细菌培养PPT参考幻灯片

㈢.是否进行了及时细致的观察与记录
培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时 观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的 变化。
代谢类型
营养类型 能源 氢的供体 基本碳源
光能无机营养( 光能自养型)
光
无机物 二氧化碳
微生物举例
蓝细菌
绿色硫细菌
藻类
光能有机营养( 光
光能异养型)
几 种 菌 落 及 其 形 态
:由核酸和蛋白质构成。
病毒的结构
吸附
注入
合成
释放
组装
病毒的增殖一般可分五个阶段，即：
吸附→注入核酸→合成核酸和蛋白质→组装→释放
：寄生
㈡.微生物需要的营养物质及功能
微生物需要的五大类营养要素物质是：
⑴.概念 ：凡是能为微生物提供所需碳元素的 营养物质。
⑵.来源： ①无机碳源：CO2；NaHCO3等
平板划线法和稀释涂布平板法。 单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。
，而空气中的其他微生物不能通过。 2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种。
最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破
而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是 坏。
③高压蒸气灭菌：100kPa、121 ℃下维持15-30min.
专为防止空气中微生物的污染而设计的。
二.实验操作(以培养大肠杆菌为例)
㈠.制备牛肉膏蛋白胨培养基
2.称量
4.灭菌:
将锥形瓶放入高压蒸气灭菌锅，在压力为 100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。 5.倒平板:

是用于培养微生物的物质，通常由水 、碳源、氮源、无机盐等组成，根据 不同微生物的需求，培养基的成分和 配比也会有所不同。
细菌培养的重要性
细菌培养是研究微生物的基础实验之一，通过细菌培养可以 了解微生物的生理生化特性、代谢途径、遗传特征等，为微 生物资源的开发利用提供基础数据。
细菌培养在医学、农业、工业等领域具有广泛的应用价值， 例如在医学上用于病原菌的分离、鉴定和药敏试验，在农业 上用于土壤微生物的调查和生物防治等。
02
细菌培养技术
液体培养基培养
液体培养基是一种均匀的、呈 液态的培养基，适合细菌的生 长繁殖。
液体培养基通常含有必要的营 养物质，如碳源、氮源、水、 无机盐等，以支持细菌的生长 。
在液体培养基中，细菌可以自 由悬浮，并且生长速度较快， 适用于大规模工业生产。
固体培养基培养
固体培养基是一种呈固态的培养 基，适合细菌的分离和纯化。
固体培养基通常含有琼脂等凝固 剂，将培养基凝固成固体状态。
在固体培养基上，细菌可以形成 可见的菌落，通过菌落的特征可
以对细菌进行鉴别和分类。
特殊培养基培养
特殊培养基是根据特定细菌的特殊需求而设计的培养基。
特殊培养基可以提供特殊的营养物质、生长因子或环境条件，以支持特定细菌的生 长。
特殊培养基在研究细菌的生理特性、致病机制等方面具有重要作用。
在食品工业中，细菌培养 与分离用于检测食品中的 病原菌，保证食品的安全 性和卫生质量。
生物能源
通过培养和分离厌氧菌， 可以生产生物沼气等可再 生能源，满足能源需求并 减少对化石燃料的依赖。
生物制药
通过培养和分离微生物， 可以生产各种生物药物， 如抗生素、酶制剂等。
在环保领域的应用

一個菌落可由單個或許多個細胞繁殖而獲得，若是一個菌落 是經由單一細胞繁殖而來，則他就是一個純種細胞群或稱選殖 體(clone)。菌落已被廣泛地應用於菌種的分離、純化、選育 等方面，在基因工程中也普遍。
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(五)微生物群體生長的規律
➢ 生長曲線(The growth curve)
微生物群體是只單一純培養微生物的群體(population)，而群 體生長常被用為研究一微生物培養的生長曲線(growth curve)之 分析研究，並採用分批培養(batch culture)或密閉系統來進行。
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1. 選擇培養基
選擇培養基有經由加入抑制非目的的微生物，但 不妨礙目的微生物的物質，已達到選擇的目的，常 用之抑制劑(物質)有抗生素和染料，例如分離真菌 用之培養基常加入抑制細菌生長的鏈黴素獲金黴素。 有時為培養的某種微生物，就在培養基中加入目的 微生物特別需要的營養物質，使培養基營養更優厚， 以達到選擇的目的，這種選擇培養基即已提過的優 厚或富集培養基。
穩定期穩定期stationphasestationphase一世代時間約為二十分鐘然而事實上這種情況並未發一世代時間約為二十分鐘然而事實上這種情況並未發生因在一個密閉的系統中的分批培養微生物的對數生因在一個密閉的系統中的分批培養微生物的對數低世代時間延長細胞活力衰退而進入穩定期低世代時間延長細胞活力衰退而進入穩定期stationphasestation殖的細胞數目與死亡的細胞數目相等總數量達最大值殖的細胞數目與死亡的細胞數目相等總數量達最大值由于在生長過程中隨著微生物細胞的生長和數目的由于在生長過程中隨著微生物細胞的生長和數目的增加營養物質不斷被消耗而不能晚族生長需求毒物增加營養物質不斷被消耗而不能晚族生長需求毒物的逐漸累積達到抑制生長的程度以及氧和的逐漸累積達到抑制生長的程度以及氧和phph等條件失去平衡使得生理旺盛的細胞轉為老化細胞代謝活力去平衡使得生理旺盛的細胞轉為老化細胞代謝活力鈍化細胞內核糖體減少rnarna和蛋白質合成也減緩和蛋白質合成也減緩因而細胞的生長變得不平衡細胞的形狀有的也發生改因而細胞的生長變得不平衡細胞的形狀有的也發生改變

实验步骤—涂布平板法
1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他 稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵 内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。 2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水 或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。 3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀 释一次,换用1支1mL灭菌吸管。 4.将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用 无菌吸管吸取菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上。再 用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮 铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹 时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20—30min， 使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌 落后即可计数。
大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。
大 肠 杆 菌
大肠杆菌的培养和分离
1、培养：在LB液体培养基上扩大培养
2、分离：
灭菌 ↓
倒平板
↓ 培养
↓ 划线分离
LB液体和固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌 将固体培养基倒入4个灭菌后的培养皿中，制备平面培 养基
在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，培养12h
平板划线法 培养皿倒置，37℃恒温培养12~24小时
基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞浆、核质 特殊结构：荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢
细菌的结构及功能
基本结构由外到内细菌的依次是 细胞壁、细胞膜、细胞浆 和核质 。 特殊结构有 荚膜、鞭毛、菌毛和芽孢。 其中能维持细菌的固有形态的结构是 细胞壁，控制遗传性状的是 核质，与细菌的毒力有关的结构是 荚膜和菌毛， 抵抗力强 的是 芽孢，决定细菌有无运动性的结构是 鞭毛。

细菌的培养及鉴定
抗酸染色步骤
1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片
干燥
固定
细菌的培养及鉴定
抗酸染色步骤
2、染色包括初染、脱色、复染三步。
初染
脱色
复染
冲洗
冲洗
石炭酸复红维持 3-5’ 3%盐酸酒精30 ’’ ~1’
冲洗
干燥 油镜观察
细菌的培养及鉴定
美蓝复染1 ’
抗酸染色结果
抗酸菌呈红色， 常堆积成团， 排列无序， 偶呈分枝状生长。 背景及非抗酸性细菌呈兰色。
细菌培养及鉴定
细菌的培养及鉴定
标本采集原则
1.及时采集微生物标本作病原学检查 2.在抗菌药物使用前采集标本 3.采样时严格执行无菌操作 4.标本容器须无菌，但不得有消毒剂 5.采样后立即送检 6.送检标本应注明细菌来的培源养及和鉴定检验目的
咳痰方法
病人先漱口，清洁口腔，去除表面的菌群 病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液 无痰可用3％～5％NaCl 5ml雾吸约5min导痰 以清晨第二口痰为佳 标本采集后放置时间不超过2小时
细菌的培养及鉴定
清洁中段尿液
尽量取早晨第一次尿液 嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水 女性病人 ➢收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水
冲洗尿道口 ➢排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿 男性病人 ➢翻转包皮，清洗尿道口 ➢排出几毫升后，不停止尿流,采集中段尿
采集标本后立即送检！
细菌的培养及鉴定
常用的培养基种类和用途
细菌的培养及鉴定
革兰染色步骤
涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片
干燥
固定
细菌的培养及鉴定
固定的目的：
使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘 得更牢固； 可改变菌体对染料的通透性； 加热固定可杀死细菌，比较安全。

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硫化氢产生试验(Production of H2S)
将细菌穿刺接种于醋酸铅培养基中， 37℃培养24h后观察结果。有些细菌能分解 培养基中的含硫氨基酸，生成硫化氢，穿刺 部位呈黑褐色，是为反应阳性。培养基颜色 无变化，则为阴性。
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尿素分解试验(Splitting of urea)
➢ 相邻两区要有重叠区域。 ➢ 结果观察：观察各区的生长情况，并看是
否有单一菌落长出；菌落的形态、颜色、 大小、边缘、透明度都需记录。
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8
平皿送37℃温箱培养24小时 结果(要求)
两种单个菌 落
分四区 无杂菌 琼脂不破
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9
℃
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3.2 细菌的接种
斜面接种法 该法主要用于单个菌落的纯培养、 保存菌种或观察细菌的某些特性。
将细菌接种于尿素培养基中，37℃培养 18～24h。变形杆菌能迅速(2～4h)分解尿素 产生大量的氨，使培养基变碱而呈紫红色， 是为阳性反应。
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实验后处理
将接种针和接种环放入原位，摆放整齐！ 将所有的原菌种管放入自己组的红框试管架
中ห้องสมุดไป่ตู้ 将自己接种的培养物集中在试管架中统一放
入培养箱中37度培养！ 关照明和电扇开关，请勿关实验室总电
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糖发酵试验
不同细菌分解糖类的能力和代谢产物不同。 例如大肠杆菌能发酵葡萄糖和乳糖；而痢疾 杆菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖。即使 两种细菌均可发酵同一糖类，其结果也不尽 相同，如大肠杆菌有甲酸脱氢酶，能将葡萄 糖发酵生成的甲酸进一步分解为CO2和H2， 故产酸并产气；而痢疾杆菌缺乏该酶，发酵 葡萄糖仅产酸不产气。

手细菌菌落总数〔cfu/cm²)=平皿上菌落的平 均数×采样液稀释倍数
30×2
4、操作步骤与质量标准
(1)着装整洁，帽子遮住全部头发，口罩遮盖口鼻；
(2〕备齐用物：治疗盘或篮、酒精灯、火柴、灭菌 棉拭子、试管、试管架、笔、纪录单、湿度、温度 计；
(3)剪指甲、洗手；
(4〕在接触病人、从事医疗活动前进展采样；
医院感染管理操作标准
环境卫生学标本采集操作标准
医院感染管理操作标准
急诊 班丽萍 2021-8-15
空气培养
1，采样及检查原那么，采样后必须尽快对样品进展相应指 标的检测；送检时间不得超过6h,样品保存于0一4℃条件时。 送样时间不得超过24h。
2、采样时间，选择消毒处理后与进展医疗活动之前期间采 样。
2．室内面积>30m2，设两条对角线，东， 西，南，北，中取五点，其中东，西，南 北距墙均1米〔图2〕
五、结果分析 I类区域：<10 cfu/m3
II类区域：<200 cfu/m3
III类区域：<500 cfu/m3
六、附录
Ⅰ类区域：层流干净手术室、层流干净病 房〔参照干净室空气培养方法与标准〕。
6、采集标本要无菌观念强、操作熟练、标记 清楚明确。
医护人员手采样
1、采样时间，在接触病人、从事医疗活动前进展 采样。 2、采样面积及方法，被检人五指并拢，将浸有无 菌生理盐水采样液的棉试子一支在双手指曲面从指 根到指端来回涂擦各两次〔一只手涂擦面积30cm²)， 并随之转动采样棉试子，剪去手接触部位，将棉试 子放人装有l0ml采样液的试管内送检。采样面积按 平方厘米〔cm ²〕计算。 3、结果计算
(2)备齐用物：治疗盘或篮、酒精灯、火柴、直径 9cm普通营养琼脂平皿〔根据需要备足量，分别标 记1,2,3,4,5；或东、西、南、北、中；或东南、西 南、东北、西北、中〕、灭菌棉拭子、试管、试管 架、笔、纪录单、计时表、湿度、温度计。

5
培养基的选择
细菌一般用营养琼脂培养基，特别指
出的是生孢梭菌用硫乙醇酸盐流体培 养基加琼脂制成的培养基进行传代。 真菌一般用改良马丁培养基。
2019 6
菌种的传代
菌种的复苏
菌种的确认 菌种的接种
菌种的保藏
2019 7
菌种的复苏
《中国药典》2005版规定，所用标准菌种 的传代次数不得超过5代。 从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为 第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种 后为第1代，直至到第3代为工作菌种。
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二. 穿刺接种法： 用接种针取细菌少许，从培养基的中央垂 直刺入，接近管底但不接触管底，然后接 种针沿穿刺线原路退出。 主要用于生孢梭菌的传代。 三.液体接种法： 用接种针取菌少许，在试管内壁与液面交 界处的管壁上轻轻研磨，使菌混合于培养 液中。
2019 47
黑曲霉接种方法：
黑曲霉孢子悬液，可以保存在4℃环境，并应在一个月内 尽快完成转种操作。转种操作应在超净工作台（或相当此 环境）中进行，关闭风机，靠近酒精灯，拧开瓶盖，用无 菌吸管吹吸管内液体，取1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面， 用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7日，培养斜面形 态可参照下图。
2019
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铜绿假单胞菌
形态特征：G-杆菌、直或微弯、较细长、散在排列、无 芽胞、有荚膜、单端有1～3根鞭毛。 培养特性：专性需氧，最适温度为35℃，但在42 ℃生 长是铜绿假单胞菌的一个特点。营养无特殊要求，普通 培养基上均能生长，菌落大小不一，扁平湿润，边缘不 齐，可产生各种水溶性色素，故使培养基变为蓝绿色。 在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长，常在其表面形成 菌膜。 分离培养：十六烷三甲基溴化铵培养基 生化反应：氧化酶试验（＋）（培养物呈粉红色渐变为 紫红色） 绿脓菌素试验（＋）（盐酸溶液呈粉红色）