血管紧张素Ⅱ对心肌细胞活力的影响

实用医学杂志２ｏｏ７年第２３卷第７期　９４７　

・实验研究・　

血管紧张素Ⅱ１型受体相关蛋白对血管　

平滑肌细胞的影响　

张毅张凌李震何惠娟　

摘要　目的：探讨血管紧张素ＩＩ　ｌ型受（Ａ　Ｔ】受体）体相关蛋白（ＡＴＲＡＰ）对ＡＴ　受体介导的血管平滑肌增殖　

和新构建的影响。方法：采用细胞培养和转染，将［，Ｈ］胸腺嘧啶掺入测定ＤＮＡ合成、动物实验和外科程序。结果：　

［　Ｈ１胸腺嘧啶掺入测定显示，ＡＴＲＡＰ　ｃＤＮＡ转染的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ）与ｐｃＤＮＡ转染的ＶＳＭＣｓ比较，过度　表达的ＡＴＲＡＰ明显抑制了Ａ　Ｔ１受体介导的ＶＳＭＣｓ的增生，有时间依赖性。Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ结果显示，过量表达的　

ＡＴＲＡＰ中含磷或不含磷的细胞外信号调控激酶（ＥＲＫ）抗体表达均较对照组增高。组织病理学观察，过量表达的　

Ａ　ｒＲＡＰ明显抑制了Ａ　Ｔ１受体介导的ｖｓＭｃｓ的增生。结论：过度表达的ＡＴＲＡＰ明显抑制了Ａ　Ｔ】受体介导的ＶｓＭｃｓ的　

增生，ＡＴＲＡＰ的生长抑制作用可能是通过在ＶＳＭＣｓ中的Ａ　Ｔｌ受体介导的细胞外信号调控激酶（ＥＲＫ）的后期激活。　

关键词受体，血管紧张素．１型　血管平滑肌细胞　新构建　

Ｅｆｆ￣Ｂ　ｏｆ　ａｎ＃ｏｔｅｎｓｉｎ　ＩＩ　ｔｙｐｅ　１　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｎ　ｖ￣ｃｕｌａｒ　ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ｃｅｌｌｓ　ＺＨＡＮＧ　Ｙｉ　，　

ＺＨＡＮＧ　Ｌｉｎｇ，ＬＩ　Ｚｈｅｎ，ＨＥ　Ｈｕｉ－ｊｕａｎ．　Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｔｈｅ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，　

Ｚｈａｎ￣ｉａｎｇ　５２４００１，Ｃｈｉｎａ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ＩＩ　ｔｙｐｅ　ｌ（ＡＴ１）　ｒｅｃｅｐｔｏｒ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　

第28卷 第12期 中国现代医学杂志 Vol. 28 No.12 2018年4月 China Journal of Modern Medicine Apr. 2018 

收稿日期：2017-03-13DOI: 10.3969/j.issn.1005-8982.2018.12.003文章编号： 1005-8982（2018）12-0017-07丹参酮ⅡA磺酸钠对血管紧张素Ⅱ诱导的 大鼠心肌纤维化的影响李泽，孟哲，李宇娜，陶海龙，白中乐，李凌[郑州大学第一附属医院 心内科（河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室）， 河南 郑州 450052]摘要：目的 观察丹参酮ⅡA磺酸钠（STS）对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的大鼠心肌纤维化的影响；并初步探讨STS抗心肌纤维化的作用与转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）所调控的抗氧化应激反应的关系。方法 40只SD大鼠随机分为5组（对照组，模型组，低、中、高剂量STS组），采用皮下植入微量渗透泵缓释Ang Ⅱ复制大鼠心肌纤维化模型，各STS组给予不同剂量STS处理。3周后，采用苏木精伊红和马松染色法观察心肌纤维化程度；采用qRT-PCR和Western blot检测心肌组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原，Nrf2和它的胞质接头蛋白Keap1，以及Nrf2所调控的抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶mRNA水平及其蛋白水平；采用比色法检测心肌组织中丙二醛、谷胱甘肽水平及超氧化物歧化酶活性。结果 STS呈剂量依赖性地减轻AngⅡ诱导的心肌纤维化，促使Nrf2在细胞核内的聚集，提高抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶的表达，增强抗氧化应激反应，降低心肌组织脂质过氧化水平。结论 STS能够有效减轻Ang Ⅱ诱导的大鼠心肌纤维化，其抗纤维化作用与调控Nrf2信号通路相关。关键词： 丹参酮ⅡA磺酸钠；血管紧张素Ⅱ；心肌纤维化；Nrf2；氧化应激中图分类号： R54；R285 文献标识码： ASodium Tanshinone A Sulfonate attenuates angiotensin -induced cardiac fibrosis in ratsZe Li, Zhe Meng, Yu-na Li, Hai-long Tao, Zhong-le Bai, Ling Li(Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou, Henan 450052, China)Abstract: Objective To investigate the effect of Sodium Tanshinone IIA Sulfonate (STS) on angiotensin II (Ang II) -induced cardiac fibrosis in rats and potential mechanisms. Methods Rat model of cardiac fibrosis was established through constant introduction of Ang II delivered byosmotic pump.Totally 40 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group, Ang II group, low-dose STS group, medium-dose STS group and high-dose STS group. STS were administered for three consecutive weeks. H&E and Masson’s trichrome staining were performedfor morphological analysis. Expression levels of Keap1, Nrf2, Collagen I & III, antioxidant enzymes and phase II enzymes were examined with qRT-PCR and Western blot. Malondialdehyde, glutathioneand superoxide dismutase activity in cardiac tissues were identified. Results STS treatment attenuated Ang II-induced cardiac fibrosis. STS stimulatednuclear translocation of Nrf2 in a dose-dependent manner, promoting the transcription of antioxidant and phase II enzymes. Enhanced anti-oxidative activities contributed to cellular protection against oxidative stress. Conclusion STS attenuates Ang II-induced cardiac fibrosis by manipulating Nrf2 mediated antioxidation signaling pathway.Keywords: STS; angiotensin II; cardiac fibrosis; Nrf2; oxidative stress 中国现代医学杂志 第28卷心肌纤维化指在致病因素作用下，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过量沉积，最终导致心脏收缩舒张功能受损的病理性改变[1]。血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）能够诱导活性氧（reactive oxygen species，ROS）的大量生成，导致ROS的生成和清除失衡，进而导致心肌纤维化的发生和进展[2-3]。丹参酮ⅡA是我国传统中药丹参的重要活性成分。丹参酮ⅡA磺酸钠（sodium tanshinone ⅡA sulfonate，STS）是丹参酮ⅡA经磺化而得到的水溶性药物。研究表明[4-6]，STS具有抗氧化应激、抗纤维化及保护心肌等作用。转录因子NF-E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-ralated factor 2，Nrf2）和其胞质接头蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）参与调控细胞的抗氧化应激反应。本研究旨在观察STS能否减轻Ang Ⅱ诱导的大鼠心肌纤维化，以及这种抗纤维化的作用是否依赖于Nrf2信号通路，为其应用于临床治疗提供一定的实验依据。1 材料与方法1.1 药品与试剂Ang Ⅱ（美国Sigma-Aldrich公司），Alzet微量渗透泵（美国Durect公司），STS（上海第一生化药业有限公司），细胞核/细胞浆蛋白抽提试剂盒、组织蛋白抽提试剂盒（北京康维世纪生物科技有限公司），Trizol试剂（美国Invitrogen公司），兔抗大鼠Keap1多克隆抗体、小鼠抗大鼠Nrf2单克隆抗体（英国Abcam公司），兔抗大鼠Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型胶原（Collagen Ⅲ）、血红素加氧酶1（HO-1）及醌氧化还原酶1（NQO1）多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），兔抗大鼠GCLC多克隆抗体（上海生工生物工程有限公司），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）Master Mix、SYBR ® Green real time PCR Master Mix（日本Toyobo公司），总谷胱甘肽（total glutathione，GSH）检测试剂盒、总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及脂质氧化丙二醛（malonaldehyde，MDA）检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。1.2 实验动物40只SPF级健康雄性SD大鼠，体重200～ 250 g，购于河南省实验动物中心。1.3 方法1.3.1 心肌纤维化模型复制及处理 40只健康SD大鼠随机分成5组，分别为对照组、模型组、低剂量STS组、中剂量STS组、高剂量STS组。采用SNIJDER等[7]所用方法，皮下植入微量渗透泵缓释Ang Ⅱ复制大鼠心肌纤维化模型。适应性喂养3 d，术前禁食12 h，自由饮水。将大鼠用10%水合氯醛（3 ml/kg）麻醉后，背部肩胛区除毛，消毒后切开皮肤，对照组植入预装0.9%生理盐水的微量渗透泵，模型组与各STS组植入预装Ang Ⅱ[435 ng/（kg·min）]的微量渗透泵，缝合切口。从术后24 h开始，对照组及模型组分别给予0.9%生理盐水[10 ml/（kg·d）]腹腔注射，低、中、高剂量STS组分别给予STS[5、10及20 ml/（kg·d）]腹腔注射，共注射3周。1.3.2 取材及切片 最后一次腹腔注射后24 h，将大鼠处死后立即开胸摘取心脏，0.9%生理盐水灌洗，于室间隔处分离左心室，取部分左心室置于10%甲醛固定（标本用10%甲醛固定后脱水、石蜡包埋并切片）；剩余部分立即置于液氮中冷冻后置于-80℃冰箱冷冻保存，以用于其他指标的检测。1.3.3 心肌组织病理形态学检查 石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精入水，用苏木素-伊红（HE）染色液及马松（Masson）染色液染色后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在显微镜下观察形态学改变，并对心肌纤维化程度进行Masson染色评分。评分采用Image-Pro Plus 6.0软件计算各组心肌胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF）。CVF=胶原面积/心肌组织总面积×100%。1.3.4 Western blot检测 取左心室心肌组织，采用细胞核/浆蛋白抽提试剂盒分别提取细胞核、细胞浆蛋白用于Nrf2的检测，采用组织蛋白抽提试剂盒提取总蛋白用于Keap1、Collagen I、Collagen Ⅲ、HO-1、NQO1和GCLC的检测。采用BCA蛋白定量分析试剂盒检测蛋白浓度后，每孔30 μg蛋白上样，6%～12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒流湿转法电转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，TBS-Tween洗膜3次，辣根过氧化物酶标记的相应二抗室温孵育2 h，TBS-Tween洗膜3次，滴加ECL发光试剂，于Tanon 5200全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）自动曝光，采集图像后分析条带光密度值。细胞核蛋白采用Lamin B为内参，细胞质蛋白采用β-tubulin为内参，总蛋白采用第12期DAPDH为内参。1.3.5 qRT-PCR检测 使用Trizol提取心肌组织总mRNA，按照说明书的步骤，使用qRT-PCR Master Mix逆转录试剂盒合成cDNA后，在ABI 7500 fast real- time PCR system qRT-PCR仪（美国Applied Biosystems公司）进行荧光定量扩增。采用2-ΔΔCt方法求得各个目的基因mRNA的相对含量。根据SYBR ® Green real- time PCR Master Mix的使用说明，PCR的反应条件为：95℃预变性1 min；95℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸45 s，共40个循环。引物序列见表1。

湖北科技学院学报（医学版）∞ｌ３年第２７卷第４￣ＩＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｕｂｅｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）］　２７７　

人参皂苷Ｒｇｌ对血管紧张素Ⅱ诱导心肌　

细胞肥大的影响木　

余良主，韩璐，孟巍，王柏军，王帮华　

（湖北科技学院基础医学院，湖北成宁４３７１００）　

摘要：目的探讨传统中药人参皂苷Ｒｇｌ对血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇＩＩ）所诱发心肌肥大的影响。方法采用酶消　化法分离新生大鼠心室肌细胞，培养心肌细胞随机分为３组：正常对照组、Ａｎｇ　ＩＩ组、ＡｎｇⅡ＋Ｒｓｌ组。在接受　药物处理２４ｈ后，检测心肌细胞总蛋白含量，Ｂ—ＭＨＣ、ＴＮＦ一仅和ＩＬ一１１３的ｍＲＮＡ表达量。结果Ａｎｇ　ｌＩ处理导致　培养心肌细胞的总蛋白含量以及Ｂ－ＭＨＣ　ｍＲＮＡ表达量显著增加，提示心肌肥大的发生；人参皂苷Ｒｇｌ显著抑　制了Ａｎｇ　ＩＩ的促心肌细胞肥大作用。同时，Ａｎｇ　ＩＩ增加心肌细胞对ＴＮＦ一仅和ＩＬ一１Ｂ　ｍＲＮＡ表达的效应也被人　参皂苷Ｒｓｌ所抑制。结论人参皂苷Ｒｇｌ抑制了Ａｎｇ　ＩＩ诱导的心肌细胞肥大以及心肌细胞对炎性介质ＴＮＦ一　、　ＩＬ－１Ｂ的释放，这可能是人参皂苷Ｒｓｌ对心脏疾病具有保护作用的细胞学基础。　关键词：人参皂苷Ｒｇｌ；血管紧张素ＩＩ；心肌细胞；ＴＮＦ—Ｏｔ；ＩＬ－１Ｂ　中图分类号：Ｒ２８４　文献标识码：Ａ　文章编号：２０９５－４６４６（２０１３）０４－０２７７－０４　

Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ　Ｒｇｌ　ｏｎ　Ａｎｇ　ＩＩ－ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ　

ＹＵ　Ｌｉａｎｇ・ｚｈｕ，ＨＡＮ　Ｌｕ，ＭＥＮＧ　Ｗｅｉ，ｅｔ　ａｌ　（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆＢａｓｉｃ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｕｂｅｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉａｎｎｉｎｇ　Ｈｕｂｅｉ　４３７１００，Ｃｈｉｎａ）　

血管紧张素2的作用

血管紧张素2（Angiotensin II）是一种具有广泛生理作用的肽类激素，常见的作用包括：

1. 收缩血管：血管紧张素2能够收缩血管，增加血管阻力，从而提高血压。

2. 刺激醛固酮分泌：血管紧张素2能够刺激肾上腺分泌醛固酮，进而使肾小管对钠离子的重吸收增加，水分也随之重吸收，增加血容量。

3. 促进心肌肥厚：血管紧张素2作为一种生长因子，能够刺激心肌细胞生长和增殖，引起心肌肥厚和重构。

4. 促进炎症反应：血管紧张素2对炎症反应有一定的促进作用，可以引起白细胞粘附和炎症细胞的浸润，导致炎症反应加剧。

5. 促进氧化应激：血管紧张素2能够增加氧自由基的产生，降低氧自由基清除能力，从而导致氧化应激加剧。

6. 刺激抗利尿激素的分泌：血管紧张素2能够刺激下丘脑神经细胞释放抗利尿激素，增加肾小管对水的重吸收，从而增加尿液浓缩能力。

总之，血管紧张素2在调节血压、体液平衡、心血管重构以及炎症反应等方面发挥重要的生理作用。