质粒DNA的小量制备

质粒DNA的小量制备

准备工作：

细菌培养：挑取单菌落，接种到3-5ml适宜的液体培养基(如氨苄青霉素抗性的标准LB培养基)中，37℃震荡培养过夜。

注：（1）最好在细菌的对数生长晚期时提取。过早则质粒得率太低，过晚则会有杂菌污染，或得到的质粒杂质太多，影响其后的酶切、电泳等处理；

（2）某些严紧型质粒(如pBR322)需要在进入对数生长中期后，在细菌培养物中加入氯霉素继续培养，以提高产量。

具体步骤：

1、细菌的收获：将1.5ml菌液倒入微量离心管中，12000g离心30秒，吸去培养液。上清要务必吸取干净，否则会影响质粒的质量。必要时可以离心2次。

2、将细菌沉淀重悬于150μl用冰预冷的溶液Ｉ中，加入1/50体积RNaseA贮存液，剧烈振荡，使之完全分散。

溶液Ｉ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris•Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)

不含DNA酶的RNaseA：10mg/ml，TE配制，煮沸15~30min，-20℃分装贮存

注：（1）溶液Ｉ高压蒸气灭菌后，贮存于4℃；（2）葡萄糖可以由NaCl代替，以利于储存；但提取大于15kb的质粒，应将细菌悬于等渗蔗糖溶液中，并用溶菌酶处理；（3）务必使细菌沉淀完全分散，以利于碱液作用充分；（4）震荡时可以在离心管中加入牙签或枪头，提高效率；（5）配制RNaseA贮存液时，煮沸时间不宜过长或过短；（6）溶液Ｉ每2个月重新配制1次。

3、加200μl溶液Ⅱ，颠倒混匀。

溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1%SDS

注：（1）若菌体裂解得充分，则溶液会变得很粘稠；（2）不要剧烈震荡，否则会混入基因组DNA；（3）每2个月重新配制1次。

4、加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ，轻微震荡混匀

溶液Ⅲ：5mol/Ｌ乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml

注：（1）所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L，pH4.8左右；（2）尽量不要有大的块状沉淀，以利于下步离心；（3）每1个月重新配制1次，并分装贮存于小口瓶中。

5、12000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。

6、加入1/2体积的Tris饱和酚、1/2体积的氯仿-异戊醇(24:1)混合液，剧烈震荡混匀。

7、12000g离心5分种，将上层液体转移到另一离心管中。

注：为了保证不吸出下层液体，可以先离心30秒，然后将上层与少量下层液体吸至另一离心管，离心5分种，再转移上层液体。切勿混入下层液体。

8、加入60%体积的异丙醇，颠倒混匀后，室温静置5分钟。12000g离心5-10分钟，小心吸去上清液。

注：（1）沉淀即为质粒DNA；（2）为确保质粒完全沉淀，异丙醇的体积可以适当加大至62~65%。

9、0.8ml 70%乙醇洗涤DNA沉淀后，小心地吸去上清。在空气中静置3~10分钟，待沉淀干燥后，溶解于50μl高压灭菌的水中。

注：为洗涤充分，可以洗2次。

10、取1~2μl样品测定紫外吸光度，对所得质粒进行定量并了解其纯度，或取1~2μl样品进行琼脂糖电泳，估计其纯度和得率。

所得质粒不能进行很好的酶促反应的主要原因：1、细菌收获时，培养液没有吸除干净；2、各种液体放置时间过长；3、沉淀中混入痕量酚、蛋白或过多乙醇；4、干燥沉淀时，在空气中静置时间过长（数小时）

质粒得率过小的主要原因：1、细菌培养时间不够；2、细菌沉淀重悬于溶液Ｉ时，没有完全分散；3、加溶液Ⅱ后，裂解得不充分；3、各种液体放置时间过长而失效；4、加入异丙醇的量不够；5、洗涤用的乙醇溶液浓度<60%；6、严紧型质粒应适当加大培养体积，并用氯霉素处理。

碱裂解法大量提取质粒DNA（同时纯化）

准备工作：

细菌培养：小量提取质粒DNA鉴定正确后，将菌液以1/50~1/20体积的比例接种到250ml液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长晚期。

注：培养体积与最终质粒DNA的收获量并无线性关系。只要培养条件适宜，50ml的培养液有时也可得到总量高达1mg以上的质粒。

操作步骤：

1、细菌的收获：将菌液倒入合适的离心管中，8000g离心5分钟，弃上清，并在吸水纸上倒置离心管使上清全部流尽。

2、将细菌沉淀重悬于10ml溶液Ｉ中。

溶液Ｉ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris•Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)

注：（1）若溶液Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ配制时间过久，可加入少量溶菌酶；（2）由于沉淀的影响，悬液的体积会达到11~13ml。

3、加15ml溶液Ⅱ，颠倒混匀。

溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1%SDS

4、加12ml溶液Ⅲ，轻微振荡混匀。

溶液Ⅲ：5mol/Ｌ乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml

5、12000g离心5分种，弃沉淀。将上清转移到另一离心管中。

6、加入60%体积的异丙醇，颠倒混匀后，室温静置5分钟。12000g离心5分钟，弃上清。

7、沉淀溶解于4~6mlTE中，加入1/50体积RNaseA贮存液，颠倒混匀，37℃静置10分钟。

8、加入1/2体积的Tris饱和酚、1/2体积的氯仿-异戊醇(24:1)混合液，剧烈振荡混匀。

9、4℃12000g离心30秒，将上层液体与少量下层液体转移到另一离心管后，再12000g离心5分种，小心吸取上层液体。

10、加入等体积13％聚乙二醇(PEG8000)-1.6mol/LNaCl混合液，颠倒混匀，冰上静置0.5~2小时。

11、4℃12000g离心10分种，弃上清，DNA沉淀用70%乙醇洗涤。

12、沉淀干燥后，溶解于适量高压灭菌的水中。

注：（1）溶解体积一般为0.2~1ml；（2）此时得到的是已经纯化的质粒DNA，可直接进行各种酶学操作。

13、取样品进行电泳或紫外定量。

其余的注意事项与常见问题见《质粒DNA的小量制备》

质粒DNA的提取与电泳鉴定

质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：

碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下：

1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。

2、37℃振荡培养过夜。

3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。

4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管

8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。

9、再以10 000rpm离心20min，弃上清。

10、用70％乙醇0.5ml洗涤一次，抽干所有液体。

11、待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE缓冲液中

煮沸法

1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。

2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。

3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。

5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。

6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8、取20ml进行电泳检查。

质粒DNA的大量提取和纯化 在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。

（一）、碱法

1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。

2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。

3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。

4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中,充分悬浮菌体细胞。

5、加入12ml新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴10分钟。

6、加9ml用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。

7、4℃下5000g离心15分钟。

8、取上清液,加入50ml RNA酶A(10mg/ml), 37℃水浴20分钟。

9、加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。

10、取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。

11、取上层水相,加入1/5体积的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分钟。

12、4℃下12000g离心15分钟, 沉淀用数ml 70%冰冷乙醇洗涤，4℃下12000g离心5分钟。

13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。

质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定

琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。

(1)琼脂糖凝胶电泳装置

由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去20年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。使用最普遍的装置是Walter Schaffner发明的水平板凝胶。

水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。

（2）琼脂糖凝胶的制备

琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。通贯凝胶的电场接通后，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。

（3）琼脂糖凝胶的染色

电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中，染色10分钟，取出紫外灯下观察。

质粒DNA的提取及定性定量分析

实验目的