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植物组织中SOD活性、MDA含量的测定方法

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植物组织中SOD活性的测定超氧物歧化酶（SOD）是需氧生物中普遍存在的一种含金属酶。

它与过氧化物酶、过氧化氢酶等酶协同作用防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞系统的伤害；SOD可以催化氧自由基的歧化反应，生成过氧化氢、过氧化氢又可以被过氧化氢酶转化成无害的分子氧和水。

【原理】
依据SOD抑制NBT在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧的条件下极易再氧化而产生02-，02- 可将NBT还原为蓝色的甲，后者在560 nm 处有最大吸收。

而SOD作为氧自由基的清除剂可抑制此反应。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性越低，反正酶活性越高。

一个酶活单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50%）时所需的酶量。

【仪器与用具】
离心机；分光光度计；进样器；紫光灯（4000 Lx）；15 mm×150 mm试管；黑色硬质套。

【试剂】
①0.05mol/L 磷酸缓冲液PBS（pH=7.8）
提取介质50mmol/L PBS（pH=7.8）内含1% 聚乙烯吡咯烷酮
② 130mmol/L 甲硫氨酸溶液：称1.9397g Met，用PBS 7.8 进行溶解
并定容至100ml；
③ 750umol/L NBT：称0.06132g NBT，用PBS 7.8进行溶解并定容至
100ml，避光保存；
④20umol/核黄素溶液：称0.0075g核黄素，用蒸馏水溶解定容至
1000ml，避光保存，现用现配；
⑤ 100umol/L的EDTA-Na2溶液：称0.0372g EDTA-Na2 ，用PBS 7.8
定容至1000ml。

【方法】
1.酶液提取
称取植物叶片0.2g（去叶脉）于预冷的研钵中，加1ml预冷的提取介质在冰浴下研磨成匀浆，加入提取介质冲洗研钵，并使最终体积为2ml，于4℃、10000r/min离心15min，上清液即为SOD粗提液。

2.显示反应
取透明度好、质地相同的15mm×150mm试管4支，2支为测定，2支为对照，按下表加入试剂。

混匀后，给1支对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬质套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应20-30min，反应温度控制在25-35℃
【计算】
以遮光的对照管作空白，将上述处理好的试管在560nm 处比色，采用如下进行计算：
()V15.0V As -A SOD ⨯⨯⨯⨯=
FW Ao t
o
SOD 活性以每克鲜重酶单位表示 其中，Ao ——照光对照管的光吸收值；
As ——样品管的光吸收值； Vt ——样品液总体积(ml)； V1——测定时样品用品用量(ml)； FW ——样品鲜重(g)；
植物组织中MDA含量和可溶性糖含量的测定
【原理】
MDA是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温条件下，可与TBA 反应生成红棕色的三甲川（3,3,5-三甲基恶唑-2,4-二酮），在532nm处有最大吸收。

但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的可溶性糖，糖与TBA显示反应产物在450nm处有最大吸收，在532nm也有吸收。

【试剂】
10% TCA；
0.6% TBA：先加少量的1mol/L NaOH溶解，再用10%的TCA定容；【方法】
1.MDA提取称取1g叶片，加2ml的10%TCA于研钵中研磨，然后再加8mlTCA继续研磨，匀浆在4000r/min离心10min,上清液即为MDA粗液。

2.显示反应取离心的上清夜2ml（对照用2ml蒸馏水代替），加入2ml 0.6%TBA，混合后于沸水反应15min,取上清夜测定450、532 及600nm处的吸光度。

【计算】
①可溶性糖浓度（mmol/L）=11.71D450（糖含量套用下面公式③）
② MDA浓度（umol/L）=6.45×(D532-D600)-0.56×D450
③ MDA含量（umol/g）=2MDA浓度（umol/L）×提取液体积（ml）
/鲜重（g）/1000。

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生理指标的测定-SOD-MDA-CAT-POD-叶绿素

生理指标的测定-SOD-MDA-CAT-POD-叶绿素

生理指标的测定测定不同时期野生大豆和栽培大豆的游离脯氨酸、丙二醛、过氧化物酶、叶绿素的含量。

测定方法如下：采样：分别在盐处理后，第2天、第7天和第12天，采叶片测量生理指标。

采摘的叶片标准为：成龄、无病虫害、无缺失、鲜绿的叶片。

丙二醛含量的测定（采用双波长硫代巴比妥酸法）材料提取：称取0.25g左右大豆叶片，加入0.5% TCA 3mL，研磨后所得匀浆3000rpm离心10min。

取上清液2mL，加0.5%TBA（称取TBA0.5g溶于0.5% TCA 溶液，并用其定容至100mL）2mL，混合后在100℃水浴上煮沸30min，冷却后再离心一次。

样品测定：分别测定上清液在450nm、532nm、600nm处的吸光值，并按公式算出MDA的浓度，再算出单位鲜重组织中MDA含量（μmol·g-1）。

结果计算：M=C×V/W×1000M为MDA含量（μmol·g-1）；C为MDA浓度（μmol·L-1）；V为提取液体积（mL）；W为样品重量（g）。

游离脯氨酸含量的测定（采用酸性茚三酮法）样品提取：称取鲜样0.5g左右，放入研钵中，加入80%的乙醇3mL研成匀浆，移入具塞试管中，并用80%的乙醇冲洗研钵，匀浆与洗液合并总量为10mL，加盖后沸水浴煮沸10min，再加活性炭粉末0.25g，振荡过滤（用80%乙醇冲洗滤纸与残渣3次），滤液于80～85℃水浴上蒸去乙醇，残渣用蒸馏水洗济并定容至100mL供测定之用。

样品测定：取具塞刻度试管2只，各加入上述过滤样液2mL、冰醋酸2mL、茚三酮试剂2mL，摇匀后加盖，于沸水浴中煮沸10～15min，冷却后于515nm下比色，记录消光值。

结果计算：A=C×V/WA为样品脯氨酸含量（μg·g-1）；C为从标准曲线上查得脯氨酸浓度（μg·ml-1）；V为样品稀释体积（ml）；W为样品重量（g）。

2013 SOD-MDA实验

2013 SOD-MDA实验



丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的
产生还能加剧膜的损伤。因此，丙二醛产生数量的多少
能够代表膜脂过氧化的程度，也可间接反映植物组织的
抗氧化能力的强弱。所以在植物衰老生理和抗性生理研
究中，丙二醛含量是一个常用指标。
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实验目的 实验原理 实验材料与设备 实验步骤 注意事项 结果比较分析 思考题


CAT活性测定
ml反应体系 0.2% H2O2 1 ml 50 mM PBS 1.95 ml 加入酶液 50 μl 启动反应，记录240 nm 下3 min内吸光值的变化.
3
在240nm下每30秒读取一次OD值，共测3min。
酶活性强度以每分钟内OD240变化0.01为一个CAT 酶活力单位，表示为U，以U/毫克•鲜重（U/ mg•DW） 按照以下公式计算： CAT活性=△OD240*D/（0.01*FW*1000）（U/ mg•FW） △OD240为一分钟吸光度变化值，FW为叶片鲜重 ，D为稀释倍数。

POD活性 ml反应混合液 1 ml 50 mmol/L PBS 1 ml 0.2% H2O2 0.95 ml 0.18 mol/L愈创木酚（pH7.0） 50 μl酶液，测定3 min内OD470 nm下的吸光值变化。 立即开始计时，在470nm波长处进行比色，开始记录数据，然后每隔一分 钟记录一次吸光度值，共测3min。 计算 以每分钟A470的化变值0.01为一个相对酶活单位，计算植物组织内过氧 化物酶酶活力的大小（单位：U/gFW）。
MDA含量计算

MDA含量C (umol/L)＝6.45(A532-A600)-0.56A450 A450、A532、A600分别代表450nm、532nm、600nm波长下
植物生理学实验报告植物组织中可溶性蛋白和MDA的测定

植物生理学实验报告植物组织中可溶性蛋白和MDA的测定

实验报告课程名称：植物生理学及实验实验类型：探索、综合或验证实验项目名称：植物组织中可溶性蛋白和MDA的测定一、实验目的和要求1.掌握植物组织中蛋白和丙二醛（MDA，malonyldialdehyde）提取。

2.掌握用比色法测定组织粗提液蛋白质和MDA.3.掌握植物组织中超氧物岐化酶（SOD)活性测定方法；4.了解植物衰老的原理。

二、实验内容和原理衰老是指细胞、器官或整个植株生理功能自然衰退，最终导致死亡的过程。

衰老时生理生化变化主要有：蛋白质含量下降，生物膜降解，核酸含量的变化，光合速率下降，呼吸速率下降，植物内源激素的变化等。

植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）。

自由基代谢失调, 并在体内积累膜脂过氧化的产物之一：MDA。

（1）可溶性蛋白测定的原理（2）考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，溶液的吸收光谱发生变化，从465nm偏转到595nm，并表现出在595nm处的吸收值与溶液中的蛋白质含量有线性关系，其范围从0~1000g/ml。

据此可制作蛋白质的标准曲线，牛血清蛋白为常用的标准蛋白。

（3）待测样品经缓冲液提取后，可溶性蛋白溶于上清液中，蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。

测定595nm吸收值，并根据蛋白质的标准曲线，得到样品中可溶性蛋白的含量。

（4）MDA测定原理（5）MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成粉红色复合物（3，5，5－三甲基噁唑2，4-二酮），该复合物在532nm处有最大吸收峰；600nm处是最小吸收峰，两峰差值的消光系数为155 (mM)-1 cm-1（6）超氧物岐化酶（SOD)活性测定原理：→ H2O2+ O22O2·−+2H2O SOD四氮唑蓝(NBT)光照还原的分光光度法:核黄素受光照产生的O2.-能将NBT还原为蓝色的甲腙，甲腙在560nm波长有最大吸收,而SOD能清除O2.-, 抑制甲腙的产生使吸收减小。

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。

网上说定容到100ML我也不懂。

拜托（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；（4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用随配，并稀释10倍（5）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加2ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。

取5ml于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。

提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。

2、酶活性测定2．显色反应取试管（要求透明度好）5支，3支为样品测定管，1支为对照管，另外1支作为空白，按表39-1加入各溶液。

混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。