实验八 食品中总抗坏血酸的测定(2,4-二硝基苯肼比色法)

选做实验食品中总抗坏血酸测定（荧光法）（一）目的意义食品中的总抗坏血酸包括还原型和脱氢型两种形式。

当食物放置时间较长或经过烹调处理后，其中有相当一部分抗坏血酸转变为脱氢型，脱氢型的抗坏血酸仍有85％左右的维生紊C活性，因此对这类食物常常测定总抗坏血酸。

（二）原理样品中还原性抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢型抗坏血酸。

脱氢型抗坏血酸与邻苯二胺反应生成有荧光的化合物恶喹啉（quinoxaline），其荧光强度与脱氢型抗坏血酸浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中总抗坏血酸量。

（三）仪器与试剂1. 荧光分光光度计或有338nm及340nm波长的荧光计2. 捣碎机3. 100ml容量瓶，锥形瓶，具塞试管。

4. 偏磷酸一乙酸液称取30g偏磷酸（HPO3），溶于80ml冰乙酸中，加500ml 蒸馏水混匀，稀释至1000ml。

于4℃冰箱可保存7～10天。

5. 偏磷酸一乙酸一硫酸液制法同4，只是用0.18mol／L硫酸代替蒸馏水。

6．醋酸钠溶液溶解500g醋酸钠（NaAc·3H2O）于蒸馏水中，稀释至1000ml。

7. 硼酸一醋酸钠溶液溶解3g硼酸于100ml醋酸钠溶液中，临用前配制。

8. 邻苯二胺溶液称取20mg邻苯二胺，于临用前溶解至100ml。

9. 0.04％百里酚蓝指示剂溶液称取0.lg百里酚蓝，加0.02mol／L氢氧化钠溶液在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量大约是10.75ml，研磨溶解后的溶液用水稀释至250ml。

10．活性炭的活化加200g碳粉与lL盐酸浓溶液（1份盐酸＋9份水），加热回流1～2小时，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110～120℃烘箱中干燥，备用。

11．抗坏血酸标准溶液（lmg／ml）精确称取50mg抗坏血酸，用偏磷酸—乙酸液溶解至50ml容量瓶中，稀释至刻度（临用前配）。

12. 抗坏血酸标准应用液（100ug／ml）取10ml抗坏血酸标准液用偏磷酸—乙酸液稀释至100ml。

一、实验名称食品中维生素C的测定二、实验目的1. 掌握食品中维生素C的测定方法；2. 了解维生素C在食品中的分布情况；3. 提高实验操作技能，培养严谨的科学态度。

三、实验原理维生素C（抗坏血酸）是一种水溶性维生素，具有抗氧化、促进生长发育、增强免疫力等作用。

食品中维生素C的含量是评价食品营养价值的重要指标之一。

本实验采用2,4-二硝基苯肼比色法测定食品中维生素C的含量。

四、实验材料1. 样品：苹果、橙子、西红柿等；2. 试剂：2,4-二硝基苯肼、硫酸铁铵、硫酸、无水乙醇、氢氧化钠等；3. 仪器：紫外可见分光光度计、电子天平、移液管、容量瓶、试管等。

五、实验方法1. 样品处理将苹果、橙子、西红柿等样品洗净，去皮去核，切成小块，称取适量（约0.5g）放入研钵中，加入少量无水乙醇，研磨成匀浆。

2. 标准曲线绘制准确移取一定量的维生素C标准溶液，分别加入2,4-二硝基苯肼溶液和硫酸铁铵溶液，混匀，室温下放置15分钟。

以无水乙醇为空白，在540nm波长下测定吸光度。

以维生素C浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

3. 样品测定将处理好的样品匀浆转移至容量瓶中，加入一定量的硫酸，混匀，室温下放置30分钟。

然后按照标准曲线绘制步骤进行测定。

4. 计算结果根据样品测定所得吸光度，从标准曲线上查得维生素C的浓度，计算样品中维生素C的含量。

六、实验结果与分析1. 标准曲线以维生素C浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性方程为：A = 0.063C + 0.0063，相关系数R² = 0.9987。

2. 样品测定结果苹果中维生素C含量为25.2mg/100g，橙子中维生素C含量为53.1mg/100g，西红柿中维生素C含量为30.8mg/100g。

3. 分析与讨论本实验结果表明，苹果、橙子、西红柿等食品中均含有丰富的维生素C。

其中，橙子的维生素C含量最高，其次是西红柿，苹果的维生素C含量最低。

食品中维生素C的测定背景：食物中的总抗坏血酸（维生素C）包括还原型和脱氢型（氧化型）两种形式。

食物陈旧、储存时间长久或经过烹调处理后，大部分维生素C被氧化成脱氢型。

后者仍有82%左右的维生素C活性，因此此类食物经常测定其总维生素C 含量。

测定时首先将还原型脱氢氧化为氧化型。

2,4-二硝基苯肼法原理：将样品的还原型抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，然后与2,4-二硝基苯肼作用，生成红色的脎。

脎的量与总抗坏血酸含量成正比，将红色脎溶于硫酸后进行比色，由标准曲线计算样品中总维生素C含量。

实验仪器及试剂：仪器：匀浆机、恒温水浴箱、721型分光光度计、容量瓶、刻度吸管、三角烧瓶试剂：4.5 mol/L硫酸、2% 2,4-二硝基苯肼、85%硫酸、2%草酸、1%草酸、10%硫脲、活性炭、维生素C储备液、维生素C标准液操作步骤：1.样品提取：匀浆取样50 g，剪碎置均浆机中，按1:1（w/v）加入2%草酸，制成匀浆，取匀浆10 g加1%草酸稀释后倒入100 ml容量瓶中，并以1%草酸定容至刻度，过滤。

2.氧化：取上述滤液25 ml置100 ml三角烧瓶中，加活性炭0.5 g，振摇1 min；过滤，即氧化液。

取氧化液10 ml置三角烧瓶中，加入1%草酸10 ml。

3.脎的形成：取试管3支，按下表操作，A为空白管，B和C为样品管。

管号 A B C样品氧化液（ml） 2.0 2.0 2.010%硫脲（滴） 1 1 12,4-二硝基苯肼（ml）0 0.5 0.537°C恒温水浴箱中保温2.5小时，取出置室温下2,4-二硝基苯肼（ml）0.5 0 04.脎的溶解：各管置冰浴中，缓慢加入85%硫酸2.5 ml，边加边振摇。

取出试管，室温下放置30 min，于490 nm波长下比色，以A管为空白调零，测样品管的吸光度。

5.制作标准曲线：取维生素C标准液25 ml于三角烧瓶中，加活性炭0.5 g，振摇1 min；过滤，即氧化液。

一药典附录试液配制:1、二硝基苯肼乙醇试液取2,4-二硝基苯肼1g，加乙醇1000ml使溶解，再缓缓加入盐酸10ml，摇匀，即得。

2、二硝基苯肼试液取2,4-二硝基苯肼1.5g，加硫酸溶液(1→2)20ml，溶解后，加水使成100ml，滤过，即得。

二、其它配制方法（一）有机试剂中微量羰基化合物测定用1、0.050g2，4-二硝基苯肼溶于25mL无羰基的甲醇和2mL盐酸溶液中，用水稀释至50mL。

2周内有效。

2、0.030g2，4-二硝基苯肼溶于94mL无羰基甲醇中，加1 5mL盐酸，混匀，当日配制。

注：在酸性介质中，羰基化合物与本试剂反应，生成2，4-二硝基苯腙，在碱性溶液中呈暗红色，可用于分光光度法（445nm处测吸光度）或目视比色法测定羰基化合物。

（二）羰基化合物定性用1、在50mL30%高氯酸中溶解1 2g2，4-二硝基苯肼。

贮于棕色瓶中，长期不坏。

2、2g2，4-二硝基苯肼溶于15mL浓硫酸中，把所得溶液缓缓注入150mL95%乙醇中，用水稀释至500mL，必要时过滤。

贮于棕色瓶中。

注：醛或酮与2，4-二硝基苯肼反应生成黄色、橙色或红色的2，4-硝基苯腙沉淀。

2，4-二硝基苯腙的颜色与醛、酮的分子结构有一定的联系，不含共轭双键的醛、酮所形成的腙一般为黄色；和碳碳双键或芳环共轭的醛、酮所形成的腙一般为橙色或红色。

试剂1在水中溶解度大，可以检定稀水溶液中的醛，而试剂2差得多，用浓硫酸配成的试剂，日久会产生沉淀，影响试验的灵敏度。

（三）油脂羰基价测定用1、50mg2，4-二硝基苯肼溶于100mL精制苯中注1：油脂经氧化所生成的过氧化物会进一步分解为含羰基的化合物，羰基化合物与本试剂反应生成腙，在碱性条件下形成醌离子，呈褐红色或酒红色，在440nm处测吸光度值，可计算油品中的总羰基价。

注2：精制苯方法：取500mL苯，置1L分液漏斗中，加入50mL浓硫酸，小心振摇5min，开始振摇时注意放气，静置分层，弃去酸液，再加50mL浓硫酸，重复处理一次。

中华人民共和国国家标准G B5009.86 2016食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定2016-08-31发布2017-03-01实施中华人民共和国前言本标准代替G B/T5009.86 2003‘蔬菜㊁水果及其制品中总抗坏血酸的测定(荧光法和2,4-二硝基苯肼法)“㊁G B/T5009.159 2003‘食品中还原型抗坏血酸的测定“和G B6195 1986‘水果㊁蔬菜维生素C含量测定法(2,6-二氯靛酚滴定法)“㊂本标准与G B/T5009.86 2003相比,主要变化如下:标准名称修改为 食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定 ;扩大了方法的适用范围;增加了高效液相色谱法及相关方法的定量限;删除了2,4-二硝基苯肼法;增加了2,6-二氯靛酚滴定法;按照G B/T20001.4 2015对原标准的结构进行了修改㊂食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定1范围本标准规定了高效液相色谱法㊁荧光法㊁2,6-二氯靛酚滴定法测定食品中抗坏血酸的方法㊂本标准第一法适用于乳粉㊁谷物㊁蔬菜㊁水果及其制品㊁肉制品㊁维生素类补充剂㊁果冻㊁胶基糖果㊁八宝粥㊁葡萄酒中的L(+)-抗坏血酸㊁D(+)-抗坏血酸和L(+)-抗坏血酸总量的测定㊂第二法适用于乳粉㊁蔬菜㊁水果及其制品中L(+)-抗坏血酸总量的测定㊂第三法适用于水果㊁蔬菜及其制品中L(+)-抗坏血酸的测定㊂2术语和定义2.1抗坏血酸:一种具有抗氧化性质的有机化合物㊂又称为 维生素C ,是人体必需的营养素之一㊂2.2 L(+)-抗坏血酸:左式右旋光抗坏血酸㊂具有强还原性,对人体具有生物活性㊂2.3 D(+)-抗坏血酸:又称异抗坏血酸㊂具有强还原性,但对人体基本无生物活性㊂2.4 L(+)-脱氢抗坏血酸:L(+)-抗坏血酸极易被氧化为L(+)-脱氢抗坏血酸,L(+)-脱氢抗坏血酸亦可被还原为L(+)-抗坏血酸㊂通常称为脱氢抗坏血酸㊂2.5 L(+)-抗坏血酸总量:将试样中L(+)-脱氢抗坏血酸还原成的L(+)-抗坏血酸或将试样中L(+)-抗坏血酸氧化成的L(+)-脱氢抗坏血酸后测得的L(+)-抗坏血酸总量㊂第一法高效液相色谱法3原理试样中的抗坏血酸用偏磷酸溶解超声提取后,以离子对试剂为流动相,经反相色谱柱分离,其中L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸直接用配有紫外检测器的液相色谱仪(波长245n m)测定;试样中的L(+)-脱氢抗坏血酸经L-半胱氨酸溶液进行还原后,用紫外检测器(波长245n m)测定L(+)-抗坏血酸总量,或减去原样品中测得的L(+)-抗坏血酸含量而获得L(+)-脱氢抗坏血酸的含量㊂以色谱峰的保留时间定性,外标法定量㊂4试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的一级水㊂4.1试剂4.1.1偏磷酸(H P O3)n:含量(以H P O3计)ȡ38%㊂4.1.2磷酸三钠(N a3P O4㊃12H2O)㊂4.1.3磷酸二氢钾(K H2P O4)㊂4.1.4磷酸(H3P O4):85%㊂4.1.5 L-半胱氨酸(C3H7N O2S):优级纯㊂4.1.6十六烷基三甲基溴化铵(C19H42B r N):色谱纯㊂4.1.7甲醇(C H3O H):色谱纯㊂4.2试剂配制4.2.1偏磷酸溶液(200g/L):称取200g(精确至0.1g)偏磷酸(4.1.1),溶于水并稀释至1L,此溶液保存于4ħ的环境下可保存一个月㊂4.2.2偏磷酸溶液(20g/L):量取50m L200g/L偏磷酸溶液,用水稀释至500m L㊂4.2.3磷酸三钠溶液(100g/L):称取100g(精确至0.1g)磷酸三钠,溶于水并稀释至1L㊂4.2.4 L-半胱氨酸溶液(40g/L):称取4g L-半胱氨酸,溶于水并稀释至100m L㊂临用时配制㊂4.3标准品4.3.1 L(+)-抗坏血酸标准品(C6H8O6):纯度ȡ99%㊂4.3.2 D(+)-抗坏血酸(异抗坏血酸)标准品(C6H8O6):纯度ȡ99%㊂4.4标准溶液配制4.4.1 L(+)-抗坏血酸标准贮备溶液(1.000m g/m L):准确称取L(+)-抗坏血酸标准品0.01g(精确至0.01m g),用20g/L的偏磷酸溶液定容至10m L㊂该贮备液在2ħ~8ħ避光条件下可保存一周㊂4.4.2 D(+)-抗坏血酸标准贮备溶液(1.000m g/m L):准确称取D(+)-抗坏血酸标准品0.01g(精确至0.01m g),用20g/L的偏磷酸溶液定容至10m L㊂该贮备液在2ħ~8ħ避光条件下可保存一周㊂4.4.3抗坏血酸混合标准系列工作液:分别吸取L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸标准贮备液0m L, 0.05m L,0.50m L,1.0m L,2.5m L,5.0m L,用20g/L的偏磷酸溶液定容至100m L㊂标准系列工作液中L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸的浓度分别为0μg/m L㊁0.5μg/m L㊁5.0μg/m L㊁10.0μg/m L㊁25.0μg/m L㊁50.0μg/m L㊂临用时配制㊂5仪器和设备5.1液相色谱仪:配有二极管阵列检测器或紫外检测器㊂5.2p H计:精度为0.01㊂5.3天平:感量为0.1g㊁1m g㊁0.01m g㊂5.4超声波清洗器㊂5.5离心机:转速ȡ4000r/m i n㊂5.6均质机㊂5.7滤膜:0.45μm水相膜㊂5.8振荡器㊂6分析步骤整个检测过程尽可能在避光条件下进行㊂6.1试样制备6.1.1液体或固体粉末样品:混合均匀后,应立即用于检测㊂6.1.2水果㊁蔬菜及其制品或其他固体样品:取100g左右样品加入等质量20g/L的偏磷酸溶液,经均质机均质并混合均匀后,应立即测定㊂6.2试样溶液的制备称取相对于样品约0.5g~2g(精确至0.001g)混合均匀的固体试样或匀浆试样,或吸取2m L~ 10m L液体试样[使所取试样含L(+)-抗坏血酸约0.03m g~6m g]于50m L烧杯中,用20g/L的偏磷酸溶液(4.2.2)将试样转移至50m L容量瓶中,震摇溶解并定容㊂摇匀,全部转移至50m L离心管中,超声提取5m i n后,于4000r/m i n离心5m i n,取上清液过0.45μm水相滤膜,滤液待测[由此试液可同时分别测定试样中L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸的含量]㊂6.3试样溶液的还原准确吸取20m L上述离心后的上清液于50m L离心管中,加入10m L40g/L的L-半胱氨酸溶液(4.2.4),用100g/L磷酸三钠溶液调节p H至7.0~7.2,以200次/m i n振荡5m i n㊂再用磷酸调节p H 至2.5~2.8,用水将试液全部转移至50m L容量瓶中,并定容至刻度㊂混匀后取此试液过0.45μm水相滤膜后待测[由此试液可测定试样中包括脱氢型的L(+)-抗坏血酸总量]㊂若试样含有增稠剂,可准确吸取4m L经L-半胱氨酸溶液还原的试液,再准确加入1m L甲醇,混匀后过0.45μm滤膜后待测㊂6.4仪器参考条件6.4.1色谱柱:C18柱,柱长250mm,内径4.6mm,粒径5μm,或同等性能的色谱柱㊂6.4.2检测器:二极管阵列检测器或紫外检测器㊂6.4.3流动相:A:6.8g磷酸二氢钾和0.91g十六烷基三甲基溴化铵,用水溶解并定容至1L(用磷酸调p H至2.5~2.8);B:100%甲醇㊂按AʒB=98ʒ2混合,过0.45μm滤膜,超声脱气㊂6.4.4流速:0.7m L/m i n㊂6.4.5检测波长:245n m㊂6.4.6柱温:25ħ㊂6.4.7进样量:20μL㊂6.5标准曲线制作分别对抗坏血酸混合标准系列工作溶液进行测定,以L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸]标准溶液的质量浓度(μg/m L)为横坐标,L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸]的峰高或峰面积为纵坐标,绘制标准曲线或计算回归方程㊂L(+)-抗坏血酸㊁D(+)-抗坏血酸标准色谱图参见附录A中图A.1㊂6.6试样溶液的测定对试样溶液进行测定,根据标准曲线得到测定液中L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸]的浓度(μg/m L)㊂6.7空白试验空白试验系指除不加试样外,采用完全相同的分析步骤㊁试剂和用量,进行平行操作㊂7分析结果的表述试样中L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸]的含量和L(+)-抗坏血酸总量以毫克每百克表示,按式(1)计算:X=(c1-c0)ˑVmˑ1000ˑFˑKˑ100(1)式中:X 试样中L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸㊁L(+)-抗坏血酸总量]的含量,单位为毫克每百克(m g/100g);c1 样液中L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸]的质量浓度,单位为微克每毫升(μg/m L); c0 样品空白液中L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸]的质量浓度,单位为微克每毫升(μg/m L);V 试样的最后定容体积,单位为毫升(m L);m 实际检测试样质量,单位克(g);1000 换算系数(由μg/m L换算成m g/m L的换算因子);F 稀释倍数(若使用6.3还原步骤时,即为2.5);K 若使用6.3中甲醇沉淀步骤时,即为1.25;100 换算系数(由m g/g换算成m g/100g的换算因子)㊂计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字㊂8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%㊂9其他固体样品取样量为2g时,L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸的检出限均为0.5m g/100g,定量限均为2.0m g/100g㊂液体样品取样量为10g(或10m L)时,L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸的检出限均为0.1m g/100g(或0.1m g/100m L),定量限均为0.4m g/100g(或0.4m g/100m L)㊂第二法荧光法10原理试样中L(+)-抗坏血酸经活性炭氧化为L(+)-脱氢抗坏血酸后,与邻苯二胺(O P D A)反应生成有荧光的喹唔啉(q u i n o x a l i n e),其荧光强度与L(+)-抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比,以此测定试样中L(+)-抗坏血酸总量㊂注:L(+)-脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与O P D A反应,以此排除试样中荧光杂质产生的干扰㊂11试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的三级水㊂11.1试剂11.1.1偏磷酸(H P O3)n:含量(以H P O3计)ȡ38%㊂11.1.2冰乙酸(C H3C O O H):浓度约为30%㊂11.1.3硫酸(H2S O4):浓度约为98%㊂11.1.4乙酸钠(C H3C O O N a)㊂11.1.5硼酸(H3B O3)㊂11.1.6邻苯二胺(C6H8N2)㊂11.1.7百里酚蓝(C27H30O5S)㊂11.1.8活性炭粉㊂11.2试剂的配制11.2.1偏磷酸-乙酸溶液:称取15g偏磷酸,加入40m L冰乙酸及250m L水,加温,搅拌,使之逐渐溶解,冷却后加水至500m L㊂于4ħ冰箱可保存7d~10d㊂11.2.2硫酸溶液(0.15m o l/L):取8.3m L硫酸,小心加入水中,再加水稀释至1000m L㊂11.2.3偏磷酸-乙酸-硫酸溶液:称取15g偏磷酸,加入40m L冰乙酸,滴加0.15m o l/L硫酸溶液至溶解,并稀释至500m L㊂11.2.4乙酸钠溶液(500g/L):称取500g乙酸钠,加水至1000m L㊂11.2.5硼酸-乙酸钠溶液:称取3g硼酸,用500g/L乙酸钠溶液溶解并稀释至100m L㊂临用时配制㊂11.2.6邻苯二胺溶液(200m g/L):称取20m g邻苯二胺,用水溶解并稀释至100m L,临用时配制㊂11.2.7酸性活性炭:称取约200g活性炭粉(75μm~177μm),加入1L盐酸(1+9),加热回流1h~2h,过滤,用水洗至滤液中无铁离子为止,置于110ħ~120ħ烘箱中干燥10h,备用㊂检验铁离子方法:利用普鲁士蓝反应㊂将20g/L亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合,将上述洗出滤液滴入,如有铁离子则产生蓝色沉淀㊂11.2.8百里酚蓝指示剂溶液(0.4m g/m L):称取0.1g百里酚蓝,加入0.02m o l/L氢氧化钠溶液约10.75m L,在玻璃研钵中研磨至溶解,用水稀释至250m L㊂(变色范围:p H等于1.2时呈红色;p H等于2.8时呈黄色;p H大于4时呈蓝色)㊂11.3标准品L(+)-抗坏血酸标准品(C6H8O6):纯度ȡ99%㊂11.4标准品的配制11.4.1 L(+)-抗坏血酸标准溶液(1.000m g/m L):称取L(+)-抗坏血酸0.05g(精确至0.01m g),用偏磷酸-乙酸溶液溶解并稀释至50m L,该贮备液在2ħ~8ħ避光条件下可保存一周㊂11.4.2 L(+)-抗坏血酸标准工作液(100.0μg/m L):准确吸取L(+)-抗坏血酸标准液10m L,用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100m L,临用时配制㊂12仪器和设备荧光分光光度计:具有激发波长338n m及发射波长420n m㊂配有1c m比色皿㊂13分析步骤整个检测过程应在避光条件下进行㊂13.1试液的制备称取约100g(精确至0.1g)试样,加100g偏磷酸-乙酸溶液,倒入捣碎机内打成匀浆,用百里酚蓝指示剂测试匀浆的酸碱度㊂如呈红色,即称取适量匀浆用偏磷酸-乙酸溶液稀释;若呈黄色或蓝色,则称取适量匀浆用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释,使其p H 为1.2㊂匀浆的取用量根据试样中抗坏血酸的含量而定㊂当试样液中抗坏血酸含量在40μg /m L ~100μg/m L 之间,一般称取20g (精确至0.01g )匀浆,用相应溶液稀释至100m L ,过滤,滤液备用㊂13.2 测定13.2.1 氧化处理:分别准确吸取50m L 试样滤液及抗坏血酸标准工作液于200m L 具塞锥形瓶中,加入2g 活性炭,用力振摇1m i n ,过滤,弃去最初数毫升滤液,分别收集其余全部滤液,即为试样氧化液和标准氧化液,待测定㊂13.2.2 分别准确吸取10m L 试样氧化液于两个100m L 容量瓶中,作为 试样液 和 试样空白液 ㊂13.2.3 分别准确吸取10m L 标准氧化液于两个100m L 容量瓶中,作为 标准液 和 标准空白液 ㊂13.2.4 于 试样空白液 和 标准空白液 中各加5m L 硼酸-乙酸钠溶液,混合摇动15m i n,用水稀释至100m L ,在4ħ冰箱中放置2h ~3h ,取出待测㊂13.2.5 于 试样液 和 标准液 中各加5m L 的500g /L 乙酸钠溶液,用水稀释至100m L ,待测㊂13.3 标准曲线的制备准确吸取上述 标准液 [L (+)-抗坏血酸含量10μg/m L ]0.5m L ,1.0m L ,1.5m L ,2.0m L ,分别置于10m L 具塞刻度试管中,用水补充至2.0m L ㊂另准确吸取 标准空白液 2m L 于10m L 带盖刻度试管中㊂在暗室迅速向各管中加入5m L 邻苯二胺溶液,振摇混合,在室温下反应35m i n ,于激发波长338n m ㊁发射波长420n m 处测定荧光强度㊂以 标准液 系列荧光强度分别减去 标准空白液 荧光强度的差值为纵坐标,对应的L (+)-抗坏血酸含量为横坐标,绘制标准曲线或计算直线回归方程㊂13.4 试样测定分别准确吸取2m L 试样液 和 试样空白液 于10m L 具塞刻度试管中,在暗室迅速向各管中加入5m L 邻苯二胺溶液,振摇混合,在室温下反应35m i n ,于激发波长338n m ㊁发射波长420n m 处测定荧光强度㊂以 试样液 荧光强度减去 试样空白液 的荧光强度的差值于标准曲线上查得或回归方程计算测定试样溶液中L (+)-抗坏血酸总量㊂14 结果计算试样中L (+)-抗坏血酸总量,结果以毫克每百克表示,按式(2)计算:X =c ˑV m ˑF ˑ1001000(2)式中:X 试样中L (+)-抗坏血酸的总量,单位为毫克每百克(m g/100g );c由标准曲线查得或回归方程计算的进样液中L (+)-抗坏血酸的质量浓度,单位为微克每毫升(μg /m L );V 荧光反应所用试样体积,单位为毫升(m L );m 实际检测试样质量,单位克(g );F试样溶液的稀释倍数;100换算系数;1000换算系数㊂计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字㊂15精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%㊂16其他当样品取样量为10g时,L(+)-抗坏血酸总量的检出限为0.044m g/100g,定量限为0.7m g/ 100g㊂第三法2,6-二氯靛酚滴定法17原理用蓝色的碱性染料2,6-二氯靛酚标准溶液对含L(+)-抗坏血酸的试样酸性浸出液进行氧化还原滴定,2,6-二氯靛酚被还原为无色,当到达滴定终点时,多余的2,6-二氯靛酚在酸性介质中显浅红色,由2,6-二氯靛酚的消耗量计算样品中L(+)-抗坏血酸的含量㊂18试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的三级水㊂18.1试剂18.1.1偏磷酸(H P O3)n:含量(以H P O3计)ȡ38%㊂18.1.2草酸(C2H2O4)㊂18.1.3碳酸氢钠(N a H C O3)㊂18.1.42,6-二氯靛酚(2,6-二氯靛酚钠盐,C12H6C l2N N a O2)㊂18.1.5白陶土(或高岭土):对抗坏血酸无吸附性㊂18.2试剂的配制18.2.1偏磷酸溶液(20g/L):称取20g偏磷酸,用水溶解并定容至1L㊂18.2.2草酸溶液(20g/L):称取20g草酸,用水溶解并定容至1L㊂18.2.32,6-二氯靛酚(2,6-二氯靛酚钠盐)溶液:称取碳酸氢钠52m g溶解在200m L热蒸馏水中,然后称取2,6-二氯靛酚50m g溶解在上述碳酸氢钠溶液中㊂冷却并用水定容至250m L,过滤至棕色瓶内,于4ħ~8ħ环境中保存㊂每次使用前,用标准抗坏血酸溶液标定其滴定度㊂标定方法:准确吸取1m L抗坏血酸标准溶液于50m L锥形瓶中,加入10m L偏磷酸溶液或草酸溶液,摇匀,用2,6-二氯靛酚溶液滴定至粉红色,保持15s不褪色为止㊂同时另取10m L偏磷酸溶液或草酸溶液做空白试验㊂2,6-二氯靛酚溶液的滴定度按式(3)计算:T=cˑVV1-V0 (3)式中:T 2,6-二氯靛酚溶液的滴定度,即每毫升2,6-二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数,单位为毫克每毫升(m g/m L);c 抗坏血酸标准溶液的质量浓度,单位为毫克每毫升(m g/m L );V 吸取抗坏血酸标准溶液的体积,单位为毫升(m L );V 1 滴定抗坏血酸标准溶液所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积,单位为毫升(m L );V 0 滴定空白所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积,单位为毫升(m L )㊂18.3 标准品L (+)-抗坏血酸标准品(C 6H 8O 6):纯度ȡ99%㊂18.4 标准溶液的配制L (+)-抗坏血酸标准溶液(1.000m g /m L ):称取100m g (精确至0.1m g)L (+)-抗坏血酸标准品,溶于偏磷酸溶液或草酸溶液并定容至100m L ㊂该贮备液在2ħ~8ħ避光条件下可保存一周㊂19 测定整个检测过程应在避光条件下进行㊂19.1 试液制备:称取具有代表性样品的可食部分100g ,放入粉碎机中,加入100g 偏磷酸溶液或草酸溶液,迅速捣成匀浆㊂准确称取10g ~40g 匀浆样品(精确至0.01g )于烧杯中,用偏磷酸溶液或草酸溶液将样品转移至100m L 容量瓶,并稀释至刻度,摇匀后过滤㊂若滤液有颜色,可按每克样品加0.4g 白陶土脱色后再过滤㊂19.2 滴定:准确吸取10m L 滤液于50m L 锥形瓶中,用标定过的2,6-二氯靛酚溶液滴定,直至溶液呈粉红色15s 不褪色为止㊂同时做空白试验㊂20 结果计算试样中L (+)-抗坏血酸含量按式(4)计算:X =(V -V 0)ˑT ˑAmˑ100 (4)式中:X 试样中L (+)-抗坏血酸含量,单位为毫克每百克(m g/100g );V 滴定试样所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积,单位为毫升(m L );V 0 滴定空白所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积,单位为毫升(m L );T 2,6-二氯靛酚溶液的滴定度,即每毫升2,6-二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数(m g/m L ); A 稀释倍数;m 试样质量,单位为克(g)㊂计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字㊂21 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值,在L (+)-抗坏血酸含量大于20m g/100g 时不得超过算术平均值的2%㊂在L (+)-抗坏血酸含量小于或等于20m g /100g 时不得超过算术平均值的5%㊂G B 5009.86 20169 附 录 AL (+)-抗坏血酸㊁D (+)-抗坏血酸标准色谱图 第一法L (+)-抗坏血酸㊁D (+)-抗坏血酸标准色谱图见图A.1㊂图A .1 L (+)-抗坏血酸㊁D (+)-抗坏血酸标准色谱图。

实验八食品中总抗坏血酸的测定（2，4-二硝基苯肼比色法）Method for determination of ascorbic acid in foods（by colorimetry with 2,4-dinitrophenylhydrazine）(一)目的掌握2，4-二硝基苯肼比色法测定食品中总抗坏血酸含量。

(二)原理总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸，样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4-二硝基苯肼作用生成红色脎，根据脎在硫酸溶液中的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色定量。

(三)仪器与试剂1.仪器和设备1.1 恒温箱(37±0.5)℃。

1.2 可见—紫外分光光度计1.3 捣碎机2.试剂本实验用水均为蒸馏水。

试剂纯度均为分析纯。

2.1 4.5 mol／L硫酸谨慎地加250mL硫酸(相对密度 1.84)于700 mL水中，冷却后用水稀释至1000 mL。

2.2 85％硫酸谨慎地加900 mL硫酸(相对密度 1.84)于100 mL水中。

2.3 2％2，4—二硝基苯肼溶液溶解2g 2，4—二硝基苯肼于100 mL 4.5 mol／L 硫酸内，过滤。

不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。

2.4 2％草酸溶液溶解20g草酸(H2C2O4)于700 mL水中，稀释至1000mL。

2.5 1％草酸溶液稀释500mL 2％草酸溶液到1000mL。

2.6 1％硫脲溶液溶解5g硫脲于500 mL 1％草酸溶液中。

2.7 2%硫脲溶液溶解10g硫脲于500mL 1％皋酸溶液中。

2.8 l mol／L盐酸取100mL盐酸，加入水中，并稀释至1200 mL。

2.9 抗坏血酸标准溶液溶解100mg纯抗坏血酸于100 mL l％草酸中，配成每毫升相当于l mg抗坏血酸。

2.10 活性炭将100g活性炭加到750mL l mol／L盐酸中，回流1—2h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子(Fe3+)为止，然后置于110℃烘箱中烘干。

壹 Vc的测定⑴原理：样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化后成脱氢抗坏血酸，再与2,4-二硝基苯肼作用，生成红色脎，其呈色强度与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。

⑵仪器：恒温箱或电热恒温水浴、可见分光光度计、捣碎机⑶试剂：4.5mol／L硫酸、85％硫酸、2％ 2,4-二硝基苯肼、2％草酸溶液、1％草酸溶液、1％和2％硫脲溶液、抗坏血酸标准溶液、活性炭⑷操作方法：①样品制备称取适量样品（含1-2mg抗坏血酸），鲜样加1﹕1量2％草酸溶液打成匀浆，干样加百分之一草酸溶液磨成匀浆，最后用百分之一的草酸溶液定容至100ml，过滤，滤液备用。

②氧化处理取25ml滤液加入0.5克活性炭，振摇一分钟，过滤，取10ml 2％硫脲溶液，混匀备用。

③呈色反应：取3支试管，每支试管都加入上述氧化稀释液4ml。

其中一支试管做空白，另两支试管各加1.0ml 2％ 2,4-二硝基苯肼，将三支试管放入（37±0.5）℃恒温箱或水浴中准确保温3小时。

取出试管放入冰水中。

空白试管冷却至室温后再加入1ml 2％2,4-二硝基苯肼溶液，10-15分钟后也放入冰水中。

向每支试管中滴加5ml 85％的硫酸，边加边摇动，滴加时间至少需要1min。

加完硫酸后将试管从冰水中取出，室温下放置30min后立即比色。

④比色用1cm的比色杯，以空白液调零点，于500nm波长下测吸光值。

⑤标准曲线绘制加2g活性炭于50ml标准溶液中，振摇1min，过滤。

取10ml滤液置于500ml容量瓶中，家5.0g硫脲，用1％的草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸的浓度为20ug／ml.取出溶液用硫脲稀释成抗坏血酸浓度一次为1、2、4、5、8、10、12ug／ml，按样品测定步骤进行显色反应并比色。

以吸光度值为纵坐标，抗坏血酸浓度为横坐标制作标准曲线图。

⑸计算结果①X=(pv／m)×f×(100／1000) x-样品中抗坏血酸的含量，mg／100g p-由标准曲线得样品氧化液中抗坏血酸的浓度，ug／ml f-样品处理过程中的稀释倍数 v-试样用1％草酸溶液的体积 m-称取样品的质量，g ②X=c／m×100 c-由标准曲线查得或由回归方程算出的试样测定液总抗坏血酸含量，mg m-测定时所取滤液相当于样品的用量，g⑹注意事项：①硫脲可保护抗坏血酸不被氧化，可帮助脎的形成，最终溶液中的硫脲的浓度应一致，否则影响色度。