重组质粒在大肠杆菌中的表达

目的基因在大肠杆菌中的诱导表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。

[主要试剂]1、LB培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）： IPTG溶于100ml ddH2O中,μm 滤膜抽滤，-20℃保存。

[操作步骤]1、通过PCR方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为BamHⅠ和HiindⅢ），PCR循环获得所需基因片段。

PCR反应体系为：。

PCR反应条件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40sec、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。

2、构建重组表达载体（1）载体酶切：将表达质粒pRSETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

（2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。

连接反应体系为：#3、获得含重组表达质粒的表达菌种（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。

否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

（3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21（DE3）的感受态细胞。

4、诱导表达1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。

2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含100mlLB培养基的300ml 培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌（最好，大约需3hr）。

3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM 作为实验组，两组继续于37℃、200rpm震荡培养3hr。

重组质粒的诱导表达——表达宿主菌以及诱导表达
1.表达宿主菌的选择
大肠杆菌常用的表达宿主菌有E.Coli BL21(DE3), E.Coli Rossatta(DE3), E.Coli BL21(DE3)Condon Plus。

针对特殊的目标蛋白其所需要的宿主菌也不相同，每种宿主菌的基本特征可在本网站查询，福因德生物可提供表中所列菌种的感受态细胞，如需更多信息可联系福因德技术部门。

2．优化表达条件
表达条件(包括IPTG浓度、诱导温度和和诱导时间等)的优化（可参照以下的正交图设计实验），主要是为了提高蛋白产量/提高可溶性蛋白表达比例；选用不同诱导时长主要是为了选择最佳收获时间（时间短了，蛋白产量不够；时间长了，大量蛋白降解）；温度诱导主要是为了得到可溶性表达的蛋白，很多的蛋白即使低温诱导也不能实现可溶性表达，一定要实现可溶性表达尽可能选择促溶标签/调整IPTG浓度，使翻译速度放缓有充分时间折叠。

福因德生物技术团队研发的自诱导培养基（Frdbio T7表达自诱导培养基即用型，PER0011）就是充分利用此原理，对表达在包涵体状态的蛋白优化为上清可溶表达状态的成功率高达60%。

可溶性表达的策略在“蛋白可溶性表达的解决方案”中有详细的阐述。

在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程通常包括以下步骤：
1. 克隆：首先需要将目标基因克隆到适当的表达载体中。

这可以通过PCR扩增目标基因，然后将其与表达载体连接，形成重组质粒。

2. 转化：将重组质粒转化到大肠杆菌细胞中。

可以使用化学方法（如热冲击法）或电穿孔法将质粒导入细胞。

3. 选择：转化后，将细胞分散在含有适当抗生素的琼脂平板上培养。

只有带有重组质粒的细胞能够存活并形成菌落。

4. 培养：将含有重组细胞的培养液转移到适当的培养基中，并在适当的条件下培养。

这可能包括调节温度、pH值和搅拌速度等。

5. 表达：在培养期间，目标基因会被大肠杆菌细胞转录和翻译为蛋白质。

使用适当的启动子和调控序列，可实现目标蛋白的高效表达。

6. 细胞破碎：一旦细胞达到最佳表达水平，就需要破碎细胞以释放目标蛋白。

这可以通过多种方法实现，如超声波、高压破碎或化学方法。

7. 纯化：通过使用各种分离和纯化技术（如亲和层析、凝胶过滤、离子交换层析等），从细胞裂解液中纯化目标蛋白。

以上是在大肠杆菌中表达重组蛋白的一般流程。

具体的步骤和条件可能因实验设计和目标蛋白的特性而有所不同。

重组人胰岛素在大肠杆菌中表达及分离纯化一、本文概述本文旨在探讨重组人胰岛素在大肠杆菌中的表达及其后续的分离纯化过程。

胰岛素作为一种关键的激素，在调节血糖水平中发挥着至关重要的作用。

然而，天然胰岛素的来源有限，且提取成本高昂，因此，通过基因工程技术在大肠杆菌中生产重组人胰岛素成为了一种可行且经济的替代方案。

本文首先介绍了重组人胰岛素的基因克隆和在大肠杆菌中的表达策略，然后详细阐述了胰岛素的分离纯化过程，包括细胞的破碎、蛋白质的提取、层析分离以及胰岛素的纯化等步骤。

本文还讨论了影响胰岛素表达及纯化的关键因素，并提出了优化表达及纯化条件的策略，以期提高重组人胰岛素的产量和纯度，为糖尿病治疗提供更为可靠和经济的药物来源。

二、重组人胰岛素的基因克隆与表达重组人胰岛素在大肠杆菌中的表达首先依赖于对胰岛素基因的克隆。

基因克隆是生物技术中一项重要的技术，它涉及到从基因组DNA或cDNA中分离出特定的基因，然后将其插入到适当的载体中，以便在大肠杆菌等宿主细胞中进行复制和表达。

目的基因的获取：需要从人源的cDNA文库或基因组DNA中扩增出胰岛素的编码序列。

这通常通过PCR技术实现，需要设计一对特定的引物，它们能够与人胰岛素基因的两端互补结合。

载体的选择：为了在大肠杆菌中表达人胰岛素，需要选择一个合适的表达载体。

常用的载体包括质粒和噬菌体。

这些载体通常含有启动子、终止子、复制原点和选择标记等元件，以确保目的基因在宿主细胞中的高效表达。

基因的克隆：将目的基因与载体连接后，通过转化技术将重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞中。

在适当的选择压力下，例如抗生素抗性，只有成功导入重组质粒的细胞才能生长，从而实现了对胰岛素基因的克隆。

表达条件的优化：在大肠杆菌中表达人胰岛素时，需要优化表达条件以获得最高的表达量。

这包括选择合适的培养基、调整培养温度、pH值以及诱导剂的浓度等。

表达产物的分析：通过SDS-PAGE、Western Blot等技术，可以对表达产物进行定性和定量分析，以确认胰岛素基因在大肠杆菌中的成功表达。

大肠杆菌表达方法一．表达鉴定1、将鉴定好的质粒转化DE3(BL21),涂卡那板。

1、挑取含重组质粒的菌体单斑3-5个克隆至2ml LB（含kana50μg/ml）中37℃过夜培养，保存甘油菌。

500ul菌加500ul 40%甘油。

2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将100ul菌加入到含5mlLB（含kana50μg/ml）培养基的培养管中，37℃震荡培养至OD600 ≌0.6-0.8（大约需3hr）。

3、取1ml液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养5hr。

4、取菌体，离心12000g×2min收获沉淀，加100ul Bugbuster protein extraction reagent 重悬后在振荡器上振荡20min。

5、4度12000rpm 离心20min，弃上清，沉淀加100ul 1×SDS-Loading buffer，电泳鉴定。

二．小规模蛋白表达、纯化、复性1、取鉴定好的甘油菌10ul接种至2ml LB（含kana50μg/ml）中37℃过夜培养2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将2ml菌加入到含200ml LB（含kana50μg/ml）培养基的培养管中，37℃震荡培养至OD600 ≌0.6-0.8（大约需3hr）。

3、取1ml液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养5hr。

4、取菌体，离心12000g×2min收获沉淀，加5ml Bugbuster protein extraction reagent 重悬后在振荡器上振荡20min。

5、4度12000rpm 离心20min，弃上清，沉淀加10ml 包涵体洗涤液(10×：200 mM Tris-HCl, pH7.5, 100 mM EDTA, 10% Triton X-100)，涡旋1min 充分重悬，12000rpm 离心15min，弃上清。

分子生物学实验技术三、外源基因在大肠杆菌中的表达（一）含有表达质粒的重组细菌的诱导表达实验安排：每组做一份（5人/组）。

操作步骤：1、将重组质粒和对照载体分别转化BL21（DE3）感受态细胞，待长出菌落后在转化的平皿中各挑取一个单菌落接种于3 mL含Amp的LB液体培养基中，37℃培养过夜。

2、将培养的细菌按1∶50比例加入到5 mL含Amp的新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3 h）。

3、取1ml菌液作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度为0.5 mM作为实验组，两组继续37℃振荡培养3 h。

4、分别取菌液1 mL于1.5 mL Ep管中，12000⨯g离心30 s，收获菌体。

5、用100 μL无菌去离子水将菌体吹散混匀，然后加100 µL 2⨯SDS凝胶加样缓冲液，混匀后沸水浴5 min。

6、通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况。

注意事项：1、IPTG的最佳诱导浓度的确定：将IPTG以不同浓度（0.2-2.0 mM）加入菌液中进行诱导，通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况，选择外源蛋白表达量最高时的IPTG浓度作为其最佳诱导浓度。

2、最佳诱导时间的选择：在菌液中加入最佳浓度的IPTG诱导6 h，其间每隔1 h（在第1、2、3、4、5、6 h）分别取菌液1 mL，通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况，选择外源蛋白表达量最高时的诱导时间作为其最佳诱导时间。

（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）实验安排：示范性操作。

实验原理：细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。

强阴离子去污剂SDS与某一还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT）并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。

采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。

当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在42℃的温度时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。

随后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。

转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。

实验准备一．器材可调移液器P1000、P200、P20及其经消毒的盒装蓝、黄吸头经消毒的1.5ml Eppendorf管、试管架及其水浴用试管架42℃恒温水浴恒温培养摇床（调至37℃，225rpm）37℃培养箱玻璃涂棒（普通玻璃吸管，细头部在煤气灯上烧成“L”形）消毒过的洁净培养皿（直径10cm）二．试剂LB培养基细菌培养用胰化蛋白胨10g细菌培养用酵母提取物5gNaCl 5g加800ml水，放入磁力搅拌棒，在磁力搅拌器上搅拌至彻底溶解，用5M NaOH（约0.2 ml）调节pH值至7.0，加水定容至1000 ml。

高压15 lbf/in2（1.034×105pa）消毒30分钟，冷却后可加入氨苄青霉素（50mg/ml）500ul，视载体特性而定，混匀，在以上1000ml培养基中加入15g细菌培养用琼脂, 即为含有琼脂的培养基抗生素琼脂平板：待含有琼脂的培养基冷却后，加入抗生素，倾入培养皿，约30~50 ml，用煤气灯火焰掠过培养基表面，以消除气泡。

冷却后，标记，封于塑料袋中，倒置，于4℃冰箱内避光保存pH试纸（或pH计）IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，-20 ℃保存。

l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )，50 mmol / L DTT，2 % SDS (电泳级)，0.1 % 溴酚蓝，10 % 甘油大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 )酶溶法(1)裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )，1 mmol / L EDTA，100 mmol / L NaCI(2)50 mmol / L 苯甲基磺酰氟(PMSF )(3)10 mg / mL 溶菌酶(4)脱氧胆酸(5)1 mg / mL DNase I2 )超声破碎法( 1 ) TE 缓冲液( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )，100 mmol / L DTT，4 % SDS，0.2 % 溴酚蓝，20 % 甘油三．实验材料重组质粒感受态大肠杆菌实验步骤自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶解约15分钟，轻轻混匀。

质粒重组实验报告质粒重组实验报告引言：质粒重组是一种重要的实验技术，可以将外源基因导入到宿主细胞中，用于研究基因功能、蛋白质表达等方面。

本实验旨在通过质粒重组技术，将外源基因成功导入到大肠杆菌中，并通过酶切、连接、转化等步骤验证重组质粒的构建。

材料与方法：1. 外源基因：选择了编码了绿色荧光蛋白（GFP）的质粒pGFP。

2. 宿主细胞：采用大肠杆菌作为宿主细胞。

3. 酶切酶：使用限制酶EcoRI和BamHI进行酶切反应。

4. 连接酶：使用T4 DNA连接酶进行连接反应。

5. 培养基：含有抗生素的LB培养基。

实验步骤：1. 酶切反应：将pGFP质粒和EcoRI、BamHI酶切酶按照指定条件进行酶切反应，以得到线性化的质粒和目标基因片段。

2. 连接反应：将线性化的质粒和目标基因片段加入连接酶缓冲液中，按照指定条件进行连接反应，形成重组质粒。

3. 转化：将重组质粒加入含有大肠杆菌的培养基中，通过热激转化法使质粒进入细胞。

4. 筛选：将转化后的细胞均匀涂布在含有抗生素的LB平板上，筛选出含有重组质粒的菌落。

5. 验证：通过PCR、酶切等方法对筛选出的菌落进行验证，确认质粒重组成功。

结果与讨论：经过酶切、连接、转化等步骤，成功构建了质粒重组实验系统。

在LB平板上筛选出了多个抗生素耐受的菌落，表明转化成功。

通过PCR验证，检测到了目标基因片段的特异扩增带，证明重组质粒中成功导入了外源基因。

进一步进行酶切验证，发现重组质粒经过连接反应后，酶切位点发生改变，与未连接的质粒有明显差异。

这些结果表明，质粒重组实验成功构建了重组质粒，并将外源基因导入到大肠杆菌中。

质粒重组实验的成功对于基因功能研究和蛋白质表达具有重要意义。

通过重组质粒，可以将外源基因导入到宿主细胞中，进而研究其在生物体内的功能和表达情况。

例如，可以通过重组质粒实现基因敲除、基因表达调控等功能，从而深入了解基因在生物体内的作用机制。

同时，重组质粒还可以用于蛋白质表达，通过外源基因的转录和翻译，使宿主细胞产生目标蛋白质，用于研究其结构、功能等方面。