考马斯亮蓝法测定蛋白

考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量原理：考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm在一定蛋白质浓度范围内（1-1000µg），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

考马斯亮蓝G-250于蛋白质结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡。

其结合物在室温下1h内保持稳定。

此法灵敏度高，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。

其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。

材料、仪器设备及试剂1、材料小麦叶片、马铃薯块茎、或其他植物材料2、仪器设备分光光度计、研钵、烧杯、移液管3、试剂（1）标准蛋白质溶液：100µg·Ml-1牛血清白蛋白：称取牛血清白蛋白25mg，加水溶解并定容至100ml,吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml即可。

（2）考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml90%乙醇中，加入100ml85%（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。

方法：1、标准曲线的绘制取6支具塞试管，按表加入试剂。

混合均匀后，向各管中加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，在595nm下比色测定吸光度。

以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水量（ml）1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白质含量（µg） 0 20 40 60 80 1002、样品测定（1）样品提取：取鲜样0.5g，加入2ml蒸馏水研磨，磨成匀浆后用6ml蒸馏水冲洗研钵，洗涤液收集在同一离心管中，在4000r/min下离心10min，弃去沉淀，上清液转入容量瓶，以蒸馏水定容至10ml，摇匀后待测。

考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究一、本文概述蛋白质是生命活动的重要承担者，其含量的准确测定对于理解生物过程、疾病诊断、药物研发等领域具有重要意义。

在众多蛋白质测定方法中，考马斯亮蓝法（Coomassie Brilliant Blue，CBB）因其操作简便、灵敏度高、适用范围广等特点而备受关注。

本文旨在深入研究考马斯亮蓝法测定蛋白含量的原理、操作步骤、影响因素及优化策略，以期为实验室研究及实际应用提供有益的参考。

本文将首先介绍考马斯亮蓝法的基本原理，包括其与蛋白质的相互作用及颜色变化的机制。

随后，详细阐述实验操作步骤，包括样品处理、标准曲线的绘制、蛋白质与考马斯亮蓝的结合等关键步骤。

在此基础上，分析影响测定结果的各种因素，如pH值、温度、时间等，并探讨相应的优化策略。

本文还将通过实际案例，展示考马斯亮蓝法在蛋白质含量测定中的应用，并评估其准确性和可靠性。

通过本文的研究，旨在提高考马斯亮蓝法在蛋白质含量测定中的准确性和稳定性，为相关领域的研究和应用提供有力支持。

也希望本文的研究能为其他蛋白质测定方法的发展和完善提供有益的借鉴和启示。

二、材料与方法考马斯亮蓝G-250，蛋白质标准品（如牛血清白蛋白），样品溶液（待测蛋白溶液），95%乙醇，85%磷酸等。

将100mg考马斯亮蓝G-250溶解于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，然后用蒸馏水定容至1000mL，充分混匀后过滤，4℃保存备用。

将蛋白质标准品配制成不同浓度的溶液，分别取适量体积与考马斯亮蓝G-250染色液混合，室温静置10分钟后，用分光光度计测定各管在595nm波长处的吸光度值。

以蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

取适量待测蛋白溶液，加入考马斯亮蓝G-250染色液，混合均匀后室温静置10分钟。

用分光光度计测定吸光度值，根据标准曲线计算待测蛋白溶液中的蛋白质浓度。

如需进一步计算蛋白含量，可根据稀释倍数和取样体积进行调整。

考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验步骤下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的具体方法及步骤蛋白质浓度测定的方法有很多，考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的一种方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作简便，下文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。

实验原理考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。

这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。

考马斯亮蓝染色法的突出优点是：(1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1 mg。

这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

(2)测定快速、简便，只需加一种试剂。

完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。

由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。

因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

(3)干扰物质少。

如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

(2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。

蛋白质的测定-考马斯亮蓝法1、原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。

它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。

此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。

强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。

Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。

但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。

2、试剂与器材①、考马斯亮蓝G―250：100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。

最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(W/V)乙醇。

②、标准蛋白质溶液：结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。

③、标准原液的配制：在分析天平上精确称取0.1g结晶牛血清白蛋白,于小烧杯内，加入少量蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，最后用蒸馏水定容至刻度。

配制成标准原液，其中牛血清白蛋白浓度为1mg/ml。

3、方法(1). 称量：用电子天平称取0.30g绿豆芽下胚轴，放入研钵中(2). 样品制备：①、研磨：往研钵中加入 5ml 蒸馏水（分三次加入），在冰浴中研成匀浆，转移至离心管中。

②、离心并定容：4000r/min离心10min , 将上清液倒入 10ml 容量瓶，再向残渣中加入 2ml 蒸馏水，悬浮后再离心 l0min ，合并上清液，定容至刻度。

标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量欧阳学文一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。

因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。

二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作（一）、试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。

最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。

2、标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。

（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）。

2、移液管使用（）。

（三）、标准曲线制作：1、A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。

1）、利用标准曲线查出回归方程。

2）、用公式计算回归方程。

3）、或用origin作图，测出回归线性方程。

即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。

4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。

（四）、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。

（五）、注意事项：1、玻璃仪器要洗涤干净。

2、取量要准确。

3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。

标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、标准曲线一般用分光光度法测物质得含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质得含量。

因此,制作标准曲线就是生物检测分析得一项基本技术。

二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作(一)、试剂:1、考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。

最终试剂中含0、01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4、7%(W/V)乙醇,8、5%(W/V)H3PO4。

2、标准蛋白质溶液:纯得牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0、15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。

(二)、器材:1、722S型分光光度计使用及原理()。

2、移液管使用()。

(三)、标准曲线制作:1、2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug),在坐标轴上绘制标准曲线。

1)、利用标准曲线查出回归方程。

2)、用公式计算回归方程。

3)、或用origin作图,测出回归线性方程。

即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0、999以上,至少2个9以上。

4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上得点应该在直线两侧。

(四)、蛋白质含量得测定:样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品得A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品得A595nm值在0、1—0、05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。

(五)、注意事项:1、玻璃仪器要洗涤干净。

2、取量要准确。

3、玻璃仪器要干燥,避免温度变化。