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东南大学出版社仪器分析第二版第八章平面色谱法

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第八章 仪器分析法(多图)(共80张PPT)

第八章 仪器分析法(多图)(共80张PPT)
仪器校正: 1. 波长准确度校正 2．吸光度准确度校正
对溶剂的要求 :
4
第八章 仪器分析法
模块四 药物含量测定技术
测定方法 :
〔一〕对照品比较法
分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶 液应为供试品溶液的100％±10％，溶剂一致，测 定吸光度 .
cx
cR
AX AR
cR 原料%
AX AR
DV 100%
第八章 仪器分析法
色谱法原理一、吸附
模块四 药物含量测定技术
当流动相流过时，各组分以 不同的速度随流动相流 出色谱柱。
第八章 仪器分析法
色谱法原理：二、分配
模块四 药物含量测定技术
混合成分 在固定相 与流动相 之间分配
第八章 仪器分析法
色谱法原理：三、分子筛
模块四 药物含量测定技术
因混合物中各 种分子体积大 小不一样而别 离
模块四 药物含量测定技术
样品浓 对 度 样照 品品 峰峰 面 对 面 积照 积品浓
定量第方八法章—仪—器内分标析法法
对照品
模块四 药物含量测定技术
内标物
供试品
内标第法八章 仪器分析法
模块四
药物含量测定技术
供试液〔样品+内标〕
对照液〔对照+内标〕
内标物
是样品中不存在的物质 与被测组分峰靠近 能与各组分完全分离 与被测组分的量接近
原料% 1E% 11c%mALDV100% W
cx
cR
AX AR
8
第八章 仪器分析法
模块四 药物含量测定技术
实例：卡比马唑的含量测定
精密称取本品0.05012g，配成500ml溶液，再定 量稀释10倍后，照分光光度法在292nm波长处测定吸 光度为0.555。按C7H10N2O2S的百分吸收系数为 557，求卡比马唑的百分含量。

仪器分析--平面色谱法

仪器分析--平面色谱法

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50-17
氧化铝吸附活性：与含水量有关，水分增加， 等级增大，活性降低。
硅胶 含水量%
0 5 15
25 38
活性 等级
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
Ⅳ Ⅴ
氧化铝
含水量% 活化温度
0 3
300－400℃
6
150－300℃
10
15
100－150℃
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国药典》2010版中许多药物采用此法。
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50-12
一、薄层色谱的固定相
吸附剂，adsorbent 1. 硅胶 2. 氧化铝 3. 聚酰胺
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50-13
1. 硅胶（SiO2·H2O，silica gel）
结构：内部— 硅氧交联结构→多孔结构 表面— 硅醇基→氢键作用→吸附活性中心
适用范围：硅胶具有微酸性，适于分析酸性或中 性物质
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50-14
基本特性：
① 易形成氢键：与极性物质或不饱和化合物。物质 极性↑，吸附能力↑，不易洗脱。
② 吸附活性次序：活泼型>束缚型>游离型 ③ 吸附活性等级：与含水量有关，含水高，活性级
数高，吸附能力弱。
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50-2
二、平面色谱法参数
1、定性参数 ① 比移值（retardation foctor）
Rf = L / L0
可用范围：0.2～0.8 最佳范围：0.3～0.5
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50-3
② 相对比移值(relative Rf )： Rr＝Rf（i）/Rf（s）＝Li /Ls

平面色谱法

平面色谱法
2014~2015学年
3.扫描方式 直线扫描和曲折扫描。 （二）定量分析法 常用外标一点法。
m样 A样 m标 A标
2014~2015学年
第三节 纸色谱法简介
以纸做载体进行的液-液分配色谱法


固定相：纸纤维吸附的水 流动相：与水不互溶的有机溶剂（饱和正丁醇） 分离机制：同液-液分配色谱 定性参数：
L 1 Rf L0 1 K VS Vm

讨论：Rf与组分性质、流动相及溶解度有关 极性组分→易保留，Rf 小（流动相极性↑， Rf ↑） 非极性组分→易流出，Rf大（流动相极性↑，Rf ↓）
2014~2015学年
（二） 相对比移值Rr
相对比移值：是在一定条件下，被测组分的比移值与参 考物质的比移值之比。
原点到组分斑点中心的距离 L1 Rr R f（参） 原点到参考物斑点中心的距离 L2
讨论
•
R f（组）
参考物与被测组分在完全相同条件下展开，可以消除系统 误差，大大提高重现性和可靠性. 参考物可以是后加入的纯物质，也可是样品中已知组分。 相对比移值Rr与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围 可以大于或小于1.
吸附剂裝于柱中。都是经典液相色谱法的一种。
2014~2015学年
（四）薄层色谱操作方法
操作步骤:制板、点样、展开、斑点定位 1.制板 ⑴薄层板的选择：表面光滑、平整、洁净、厚度均匀
⑵薄层板的涂布： 软板（不加粘合剂)：干,湿法铺 硬板（加粘合剂）：湿法铺板(匀浆） 要求：涂布均匀 ，厚度0.25mm ~ 0.5mm 常用硅胶： 硅胶G——自含粘和剂 硅胶H——不含粘和剂，铺板时另加入CMC-Na 硅胶G254——含荧光剂，254nm紫外光照发绿光 硅胶HF356——含荧光剂，356nm紫外光照发光

平面色谱法分析化学

平面色谱法分析化学
在平面上进行分离的一种色谱方法， 主要包括薄层色谱法和纸色谱法。
纸色谱法 薄层色谱法
第一节 平面色谱法的分类和原理
分类 薄层色谱法：
吸附薄层色谱法 分配薄层色谱法 分子排阻薄层色谱法
纸色谱法:分配 薄层电泳法
平面色谱法参数
定性参数 相平衡参数 面效参数 分离参数
定性参数1
二、吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂
吸附剂
硅胶：多孔性微粒，表面带有硅醇基， 呈弱酸性。 原理：硅醇基(吸附中心)与极性基 团形成氢键（吸附性）。 组分与硅醇基形成氢键（被吸附） 的能力不同而分离。 应用：酸性和中性物质的分离，如 有机酸酚类、醛类等
硅胶
活度与含水量的关系：含水量高，活性级高， 活度低。
相平衡参数
K、k与Rf值关系推导： (与定距展开比较) 1 Rf =L/L0=u/u0=R’= 1 k R’为保留比
第二节 薄层色谱法 (thin layer chromatography；
TLC)
固定相（吸附剂或载体）涂布成一均 匀薄层，点样，（密闭的容器中）展 开，斑点显色，（与对照物质）比较 进行定性定量。
1.目视比较法（如杂质限度检查方法） 2.薄层扫描法
第三节 纸色谱法
一、纸色谱法的分离原理
纸纤维为载体，吸着在其上的水为固定相 属于正相分配色谱 依据分配系数的不同而达到分离 极性或亲水性强的组分，K大，Rf值小，
极性弱或亲脂性强的组分，K小，Rf值大。 极性强弱？例：三个六碳糖
二、纸色谱法的实验条件
三、薄层色谱操作方法
制板 点样 展开 显色
均匀 集中 (多种方式) 预饱和
自学，实验课讲
四、定性和定量分析

平面色谱法

平面色谱法
一、概述
1．定义：
TLC
将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上，形 成薄层而进行色谱分离和分析的方法。
2．分离机制
吸附薄层色谱 分配薄层色谱
空间排阻薄层色谱
胶束薄层色谱
二、吸附薄层色谱材料 （一）固定相——吸附剂
氧化铝、硅胶 聚酰胺、纤维素
1.硅胶：最常用的吸附剂，SiO2· XH2O
点样量勿超载，防止拖尾 点样勿伤及薄层表面
四、薄层色谱操作过程
5、展开
展开原理：薄板一端浸入展开剂，点样点不可接触展开剂，展开剂
借助毛细作用上升，带动样品中组分的迁移。
（1）展开装置
常为圆形或方形玻璃缸，缸上具 有磨口玻璃盖，应能密闭。
立式
卧式
四、薄层色谱操作过程
5、展开
（2）展开方式
软板只能进行近水平展开 硬板可近水平、下行、上行、径向、双向、多次展开， 上行法展开最为常用
2、平面色谱分离评价参数
分离度：两相邻斑点中心距离与两斑点平均 宽度（直径）的比值
2d R W1 W2
相临两斑点间距离越大，斑点越 集中，分离度越大，分离效率越高 当R＞1.5时，相临斑点可达到基 线分离
TLC分离度与比移值的关系
Rf =0.3 时 分离度R最大
Rf = 0.2~0.5时
疏水改性硅胶（非极性键合相）
反相色谱采用高含水溶剂，需低疏水改性硅胶
亲水改性硅胶（极性键合相）
介于极性和疏水改性吸附剂间的色谱选择性
二、吸附薄层色谱材料
（二）载板
具一定机械强度，化学惰性，耐一定温度、表面 平整、厚度均匀、价格便宜
玻板： 5cm×10cm、10cm×20cm、20cm×20cm 光滑、平整、洗净后不附水珠、干燥

仪器分析平面色谱法2-精选文档

仪器分析平面色谱法2-精选文档
5
20世纪80年代

出现了仪器化薄层色谱法，薄层色谱的 每一步均用仪器来代替以往的手工操作， 再配以薄层扫描仪，这样就使薄层色谱 法的定量结果的重现性和准确性大大提 高。
6
平面色谱参数



定性参数 相平衡参数 面效参数 分离参数
7
（一）定性参数

比移值（Rf） Rf = L/ L0
最佳范围 0.3~ 0.5 可用范围 0.2~ 0.8
17
二、吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂 （一）吸附剂 硅胶 氧化铝
硅胶具微酸性适于分离酸性和中性物质 氧化铝具微碱性适于分离碱性和中性物质
18
硅胶



表面带有硅醇基呈弱酸性，硅醇基与极性基 团形成氢键而表现其吸附性能，不同组分的 极性基团因与硅醇基形成氢键的能力不同而 被分离。 硅胶吸水形成水合硅醇基而失去吸附能力， 加热（105～110℃）可失去水而提高活度， 增加吸附能力，这一过程称为“活化” 。 含水量越多，级数越高，吸附能力越弱，同 一组分在此硅胶上的Rf值越大。
42
薄层色谱扫描法的定量分析


外标法 内标法 归一化法
43
外标两点法定量
m a bA 样 样
m1 m2 b A1 A2
am bA 1 1
44
七、薄层色谱的应用及实例

广泛应用于各种天然和合成有机物的分离和鉴 定，有时也可用于小量物质的精制。 药品质量监控，可用于测定药物的纯度和检查 降解产物。 在生产上可用于判断反应终点，监视反应过程。 对中药和中成药，薄层色谱鉴别应用广泛，可 鉴别有效成分，进一步进行含量测定。
平面色谱法
plane chromatography

仪器分析—平面色谱法


~30
~12
点样数
10
18,36
展开距离/cm
10~15
3~6
展开时间/min
30~200
3~20
最小检测量:吸收/ng 荧光/pg
1~5 50~100
0.1~0.5 5~10
薄层扫描法
用一定波长、一定强度的光束照薄层上的色 点，用仪器测量照射前后光束强度的变化， 从而求得物质含量的方法
• 双波长扫描仪是较常用的仪器 • 特点是双波长 • 反射法和投射法。常用反射法，线性扫描和
• 常用的有硅胶、氧化铝、纤维素和化学键 合相
TLC与HPTLC的区别
参数
Hale Waihona Puke TLCHPTLC板尺寸/cm
20×20
10×10
颗粒直径/μm
10~40
5,10
颗粒分布
宽
窄
点样量/μL
1～5
0.1~0.2
原点直径/mm
3~6
1~1.5
展开后斑点的直径/mm
6~15
2~5
有效塔板数
<600
<5000
有效板高/μm
平面上、同一展开条件下所测得的Rf值 • 在完全相同的条件下展开，消除了系统误差，
Rr的重现性和可比性均比Rf要好 • Rr值可以大于1，也可以小于1
相平衡参数
• R’为单位时间内一个分子在流动相中出现的 几率。
• R’也可表示组分分子在平面上的移动速度
面效参数
分离参数
• 分离数
R 2(L2 L1) W2 W1
• 保留值
平面色谱法
是组分在色谱体系中的保留行为，反映组分
与固定相作用力的大小，是色谱过程热力 学的参数，也称为定性参数。

平面色谱法


与待分离 组分无作 用？
纸色谱是以滤纸为载体的液-液分配色谱。滤纸由纤维素 制成，其分子中具有很多羟基，有较强的亲水性，能吸收 20~25%的水分，其中6%左右的水分通过氢键与纤维素上 的羟基相结合形成的固定相。 正相色谱
若要分离非极性物质可用适当的低级性液体如石蜡油、硅
油等处理滤纸。反相色谱
流动相（展开剂）：与水不相溶（或部分相溶）的溶剂
薄层材料（3）
载板
具有一定机械强度、化学惰性、耐一定温度、表面平整、厚度
均匀、价格便宜
玻板：5cm10cm、10cm20cm、20cm20cm
光滑、平整、洗净后不附水珠、干燥
薄层材料（4）
粘结剂
加强固定相颗粒的附着力，增加薄层板润湿性，改善色谱分离
无机粘结剂：煅石膏
硅胶G：含1315%煅石膏
制备硅胶G：含30%煅石膏 氧化铝G：含9%煅石膏 硅胶H：不含粘结剂
有机粘结剂：羧甲基纤维素钠（CMC）
0.8%CMC溶液配均浆涂铺的薄层板强度高，色谱分离性能好
注意：不适合浓硫酸显色、易霉变降解
薄层材料（5）
荧光指示剂
适当波长激发光照射下可产生均匀的荧光背景，清晰显示化合物暗斑
用量：1.52.0%
滤纸或薄层板的处理
样品制备 色谱前衍生化
点样
滤纸或薄层板预平衡
展开 定位
定性 定量
3-1 概述（6）
薄层色谱法的基本材料及设备
滤纸及薄层板（自制或市售） 涂布器 点样器（定性：普通毛细管；定量：微量注射器或微量定量毛细管） 展开室 显色器
薄层扫描仪
3-2 薄层色谱系统
薄层材料
平面色谱法（TLC）
3-1 概述 3-2 薄层色谱系统

仪器分析 平面色谱法52页PPT

Thank you
1、不要轻言放弃，否则对不起自己。
2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远的人，常是愿意 去做，并愿意去冒险的人。“稳妥”之船，从未能从岸边走远。-戴尔．卡耐基。
梦 境
3、人生就像一杯没有加糖的咖啡，喝起来是苦涩的，回味起来却有 久久不会退去的余香。
仪器分析
平面色谱法 4、守业的最好办法就是不断的发展。 5、当爱不能完美，我宁愿选择无悔，不管来生多么美丽，我不愿失 去今生对你的记忆，我不求天长地久的美景，我只要生生世世的轮 回里有你。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿

平面色谱法

平面色谱法【真题模拟与解析】 一、A 型题（最佳选择题）1. 进行纸色谱时，滤纸所起的作用是 ___________________ 。

A.固定相 B •展开剂 C .吸附剂D •惰性载体纸色谱法的固定相为纸纤维上吸附的水分，流动 相为有机溶剂，纸色谱分离原理属于分配色谱的范畴。

答案[D]2. 试样中A 、B 两组分在薄层色谱中分离，首先取 决于 ___________ 。

A. 薄层有效塔板数的多少B. 薄层展开的方向C. 组分在两相间分配系数的差别D. 薄层板的长短得： 出二 R f2 _R f1111 av s /v m 1 KV s /v m同一薄板V s / V m 相同，欲使讯=耳2 - R f 厂0，只有 K 厂 K 2。

答案[C]3. _________________________________ 在薄层色谱中，以硅胶为固定相，有机溶剂为流 动相，迁移速度快的组分是 。

由方程：1 1 KV s /V mA .极性大的组分B .极性小的组分C.挥发性大的组分 D .挥发性小的组分在吸附薄层色谱中，通常根据被分离组分的极性进行分离，组分的极性越大，硅胶吸附组分的能力越强，迁移速度越慢，比移值越小。

答案[B]4. 在平面色谱中跑在距点样原点最远的组分A. 比移值最大的组分B.比移值小的组分C.分配系数大的组分D.相对挥发度小的组分答案[A]5. ______________________________________________ 纸色谱法分离糖类，应选用的展开剂是_________________________ 。

A. 烃类B.卤烃C.醛类D.醇类纸色谱中化合物在两相中的分配系数与化合物的分子结构及流动相种类和极性有关。

糖类化合物分子结构中含有羟基，常用的展开剂是含水的有机溶剂，如水饱和的正丁醇、正戊醇等。

答案[D]6. 平面色谱中可用来衡量展开剂选择性的A. 比移值B.相对比移值C.分配系数D.分离度相对比移值是指在一定条件下，两个被测组分的R L比移值之比，即：R r 匕1）（1）,反映了在同一条件R（2）L（2）下，不同化合物在平面上的相对位置。

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设R’表示单位时间内一个分子在流动相中出现的几率，也可以表示组分分子 在平面上移动的速度
1 R' CSVS K VS
R' CmVm
Vm
K VS Vm k
R' 1 1 k
Rf＝L/L0=ut/u0t
定时展开时 R’＝ Rf
讨论：
Rf 1 1 k
1
Rf
R' 1 K VS
Vm
1. Rf＝1 K或k=0 组分在前沿 Rf＝0 K或k=∞ 组分在原点
• 相对比移值Rs与组分、参考物性质及色谱条件有关，范 围可以大于或小于1
（二）相平衡参数
1. 分配系数K和容量因子k
分配系数K
K
组分在固定相中的浓度 组分在流动相中的浓度
cs cM
K与温度有关
容量因子k—质量分配系数、分配比
k
组分在固定相中的质量 组分在流动相中的质量
ms mM
K VS VM
2. K、k、Rf的关系
2.分离数(separation number; SN)
相邻斑点分离度为1.177时，在Rf=0(原点)到Rf=1(溶剂 前沿)之间能容纳的色谱斑点数。
SN=L0/(b0+b1)-1 b0：Rf=0组分的半峰宽；b1： Rf=1组分的半峰宽
SN越大，平面的容量越大。一般薄层板的分离数为 7~10，高效薄层板可达 10~20。SN是衡量分离容量的重要参数。
（二）展开剂 石油醚<环己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烷<苯<甲苯<二氯甲
烷<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<吡啶<酸< 水
(三) 吸附剂与展开剂的选择
吸附剂的选择：根据被测物极性和吸附剂的 吸附能力 被测物极性强——弱极性吸附剂 被测物极性弱——强极性吸附剂
二、吸附薄层色谱的吸附剂与展开剂
(一）吸附剂 1. 硅胶：氢键吸附，适合与中性和酸性物质。硅胶H、硅胶G、
硅胶F254 2. 氧 化 铝 ： 可 分 为 中 性 （ pH7.5) 、 碱 性 （ pH9.0 ） 和 酸 性 （
pH4.0）
活性分为5级，级数越大，含水量越多，吸附能力越弱，活度越小。
2. Rf与K有关，即与组分性质（溶解度）以及薄层板和展开剂的性质有关，K↑ 大，Rf↓小
3. 薄层板一定，Rf只与组分性质有关，对于极性组分， 展开剂极性↑大，Rf↑大 展开剂极性↓小，Rf↓小
（三）板效参数
1、理论塔板数—色谱分离性能指标
n=16(L/W)2
L:原点到斑点中心的距离
W：组分斑点的纵向宽度
色谱由来
§1 概述
1906年植物学家Tswett M.
植物叶片石油醚浸取液
碳酸钙柱
石油醚冲洗
固定相 流动相
色谱
色带
§1 概述
一. 色谱法 (层析法)
利用各组分物理化学性质 的不同，在流动相流经固定相 时，由于各组分在两相间的吸 附、分配或其它亲和力的差异 而产生不同速度的移动，最终 达到分离的目的。
§2平面色谱法的分类与原理
平面色谱法(plane chromatography)是在平面上进行分离的一种色谱方法； 主要包括薄层色谱法、纸色谱法和薄层电泳法。
一、平面色谱法的分类
薄层色谱法:固定相铺在玻璃板、铝箔或塑料板上成薄层 纸色谱法：以纸为载体，固定相为纸上吸附的水分，流动
相为有机溶剂
薄层电泳法
一、主要类型
（一）吸附薄层色谱 固定相为吸附剂的薄层色谱。利用吸附剂对不同组分的吸附 能力差异而实现分离。经过吸附、解吸、再吸附、再解吸 ……最后混合物得到分离。K大，Rf值小，移动慢；K小，Rf 大，移动快。
（二）分配薄层色谱 固定相为液体，吸留在载体上的薄层色谱。利用被分离组分 在固定相与流动相中的分配系数不同而被分离。常用的是反 相薄层色谱法，固定相是烷基化学键合相，展开剂是水及与 水相溶的有机溶剂。
第八章 平面色谱法
概述 平面色谱法的分类与原理 薄层色谱法 纸色谱法 应用与示例
重点掌握： 1.薄层色谱法和纸色谱法原理； 2. 薄层色谱法常用的固定相和流动相以及选择方法；
分配系数与保留体积之间的关系；薄板种类显色 方法； 3. 平面色谱中比移值与分子结构关系； 4. 理解各色谱类型中组分的流出顺序，薄层色谱操 作、定性、定量方法；正相色谱与反相色谱。
§3 薄层色谱法
1．定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上， 形成薄层而进行色谱分离和分析的方法
2．操作过程： 铺板 →活化 →点样 → 展开 →定位(定性)/洗脱(定量) 3．分离机制：吸附* 、分配*、离子交换、空间排阻
4．特点；分离能力强、灵敏度高、展开时间较短、显 色方便。
5．应用：药物杂质检查、纯度测定、定量 xt
L0
Rf
1
L1 L0
L2
L1
Rf
2
L2 L0
• back
2. 相对比移值Rr
Rr
R f（i） R f（s）
原点到组分斑点质量中心的距离 原点到参考物斑点质量中心的距离
Li Ls
• 参考物与被测组分在完全相同条件下展开,可以消除系 统误差，大大提高重现性和可靠性；
• 参考物可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分;
二、平面色谱法参数
（一）定性参数-保留值(组分与固定相作用力大小)
1. 比移值Rf(retardation factor；Rf) 溶质移动的距离与流动 相移动距离之比 图示
原点到组分斑点质量中心的距离 L
Rf
原点到溶剂前沿的距离
L0
Rf范围：
0< Rf <1
Rf = 0.2~0.8（最佳）
next
斑点移动距离相等时，斑点越集中即W越小，n越大。
2、塔板高度
H=L0/n
L0：原点到展开剂前沿的距离 n越大，H越小。
（四）分离参数
1、分离度(resolution; R) ：两相邻斑点中心的 距离与两斑点平均宽度的比值
R=2(L2-L1)/(W1+W2)=2d/(W1+W2)
• L1 、L2 :分别为原点至两半斑点中心的 距离， W1、W2斑点的宽度。
分离基础：差速迁移 (例:赛跑)
二、分类：
1．按两相分子的聚集状态分：
流动相 固定相 类型
液体 液体
固体 液体
液-固色谱 液-液色谱
气体 气体
固体 液体
气-固色谱 气-液色谱
2．按操作形式分：
柱色谱
平面色谱
液相色谱(LC)
气相色谱 （GC）
纸色谱 薄层色谱
3．按分离机制分：
四大基本类型
分配色谱：利用分配系数的不同 吸附色谱：利用物理吸附性能的差异 离子交换色谱：利用离子交换原理 分子排阻色谱：利用排阻作用力的不同