蚕豆根尖微核技术实验方案

实验方案(蚕豆根尖微核技术)
一、实验题目
蚕豆根尖微核技术检测流仓河污水污染情况
二、实验目的
1、利用植物压片技术和微核实验原理，设计实验方案，研究环境中存在的毒害物；
2、理解环境致突变因子对生物体DNA的损伤
3、掌握环境因子遗传毒性检测的微核实验方法
4、培养初步的科研能力
三、材料仪器与方法
1.1材料仪器
选取蚕豆大小均匀籽粒饱满无虫害100颗，采集于流仓河污水，烧杯，剪刀，培养皿，量筒100ml，，胶头滴管，显微镜，卡诺固定液，5 mol/L盐酸，石炭酸品红溶液，天平（带砝码）
1.2方法
1.2.1污水处理
将采集到的污水稀释100倍、10倍、不稀释，用自来水做对照
1.2.2蚕豆根尖的培养处理
将蚕豆用蒸馏水浸泡一天使其充分吸胀，然后用滤纸浸水放于培养皿中在25℃恒温箱中培养24h。

每12小时换水一次。

待蚕豆初生根长至2cm左右，选取长度一致的蚕豆，分别用蒸馏水，1倍稀释液，10倍，50倍，100倍，分别处理6h，其中蒸馏水作为阴性对照处理。

然后再放于25℃恒温箱恢复培养24h。

卡诺固定液固定24 h；固定好的幼根以蒸馏水浸洗两次，用5 mol/L的盐酸于28℃水解约25 min，至幼根被软化即可；然后用蒸馏水洗净切取0.5cm的根尖，用改良的石炭酸品红溶液染色5~10分钟。

1.2.3制片
用常规压片法制作临时装片。

1.2.4镜检计数
每剂量组选取5个根尖，每个根尖随机镜检1000个细胞，计算微核率MCN‰=观察到微核细胞数/观察细胞总数*1000‰。

重金属离子对蚕豆根尖细胞的微核效应一、实验目的1.了解微核测试的原理和毒理遗传学在实际生活与工作中的应用范围及意义2．学习蚕豆等根尖的微核测试技术二、实验原理微核是在理化诱变因子的作用下, 在细胞形态学上表现出来的一种染色体损伤类型, 只要环境中存在着一定剂量的遗传毒性物质, 生长于其中的植物就有可能产生微核现象. 根据植物细胞的徽核效应, 可以对环境污染进行监测和评价.三、实验材料：蚕豆四、实验器具和药品：实验器具：显微镜；解剖刀；镊子；解剖盘；冰箱；恒温水浴锅；滤纸；盖玻片；载玻片；烧杯；量筒；试管。

实验药品：PbCl2溶液；CdCl3溶液；CuCl2溶液；去离子水；石碳酸品红；0.05% NaClO；5-氨基尿嘧啶；无水乙醇；冰醋酸；盐酸。

五、实验步骤1.根尖的培养选取籽粒饱满、大小一致的蚕豆种子洗净后，放入盛有蒸馏水的大烧杯内，浸泡约24 h，期间换水1～2次。

待种子充分吸胀后，将其放入铺有一薄层湿润脱脂棉的解剖盘中，置（25 ±1）℃的恒温培养室中培养2～3 d，期间换水4～6次，使其长出1.5～3.0cm长的初生根。

2.根尖毒性处理取PbCl2溶液、CdCl3溶液、CuCl2溶液，将每种溶液稀释配制成50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L 4个浓度梯度，以无离子水为空白对照，。

在芽长出0. 2—0. 5 cm 时, 经4℃培养14 h, 转移在0.075%的5-氨基尿嘧啶中培养24h ( 23℃) 冲洗, 移至含氧丰富的蒸馏水中培养8—12h, 大约24% 的细胞可比较同步地出现细胞有丝分裂高峰。

2h后,转移到浓度已定的重金属离子溶液中( pH 6.6—7.2)。

培养1个细胞周期18h。

3.根尖细胞恢复培养将处理过的种子用蒸馏水浸洗2次，每次5～10 min后，再放入新铺好的湿润脱脂棉的解剖盘（或培养皿）内，按前述培养条件使根尖细胞修复培养22～24h。

蚕豆根尖微核实验实验方案第一组姓名学号龚丽桦20110442001王春20110442002周鹏20110442003蔡梣仪20110442006贺吉20110442007李彦欣20110442008蚕豆根尖微核实验一、实验目的1.通过“环境遗传物质污染的微核指示”的综合实验过程，加强学生对环境污染的遗传毒性的感性认识，掌握环境污染物对生物遗传物质及生理过程的改变及生物对环境污染物的指示作用。

2．掌握微核试验相关操作技术。

3．使学生在复习和巩固基本理论知识的同时，能深刻认识环境污染物质对环境中生物的危害，增强学习环境科学的兴趣和责任感。

4．通过本综合性实验，培养学生独立观察、思考及分析、研究、解决实践问题的能力。

二．实验内容微核试验(Themicro nucleu stest, MNT)是以动植物为材料，采用细胞生物学手段，观测其出现的微核率来表示材料受遗传损伤程度的一种检测遗传毒物的方法。

微核是无着丝点的染色体断片，在有丝分裂后期不能向两极移动，所以游离于细胞质中，在间期细胞核形成时，即可在它附近看到一到几个很小的圆形结构，直径大约是细胞直径的 1 ／ 20 － 1 ／ 5 ，这就是微核（ micronucleus ）。

微核是常用的遗传毒理学指标之一，指示染色体或纺锤体的损伤。

由于这种损伤会因细胞受到的外界诱变因子的作用而加剧，而微核产生的数量又可与诱变因子剂量的强弱呈正比，因此可以用微核出现的频率来评价环境诱变因子对生物遗传物质的损伤程度。

蚕豆(Vicia faba)是一种理想的细胞遗传学研究材料。

蚕豆的染色体大，数量少(2n=12),根尖中含有较多的分裂相细胞，非常适合显微观察，而且蚕豆根尖细胞周期中的大部分时间对诱变剂敏感，便于遗传毒性检测实验。

（一）实验仪器、试剂和材料A．实验材料：蚕豆种子B. 实验器材：光学显微镜、试管(10ml)×2、蚕豆发芽盒、镊子、手术刀、载玻片、盖玻片、滤纸等C. 试剂[1] 环磷酰胺：用其与水可溶剂配置系列溶液：0%（对照），5%，10%，20%。

利用蚕豆根细胞微核技术检测洗发水的毒性09生物技术宁伟王晓刚太红桥刘经源摘要微核（micronucleus,MCN）是真核生物细胞经各种理化因子作用后引起染色体畸变，在间期细胞中的一种表现形式。

在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3～1/20，染色与主核一样或稍浅。

一般认为微核是由无着丝粒的染色体断片或落后染色体，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。

当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即微核。

[1]蚕豆根尖细胞微核试验(Micronucleustest,MC-NT)技术是一种以染色体断裂及纺锤丝损伤为测试终点的植物微核检测方法。

它是一种应用于监测环境致突变物对人体和其他生物体的遗传物质产生危害的技术,并从细胞遗传学水平上探讨植物遗传物质的改变状况与环境污染，也可以检测淡水环境的质量。

[2]关键词蚕豆根尖微核洗发水千分率蚕豆是一种很好的细胞遗传学研究材料。

它的染色体为六对相当大的染色体，而且根尖含有较多的分裂相细胞，非常适合显微观察。

目前，蚕豆根尖微核技术在环境致突变性检测/监测方面已经形成了一套完整的体系。

它的可靠性和灵敏性较高，且本底较低，这对于一种致突变性检测方法是十分重要的。

此外，它的检测物谱较广。

目前多数学者认为，在镜检细胞微核时，应按下列标准计数微核：（1）凡主核大小1/3以下，与主核分离的小核；（2）小核的着色与主核相当或稍浅；（3）小核形态可为圆形，不规则等。

[3]1. 实验目的掌握蚕豆根尖细胞微核检测技术的一般方法。

并利用蚕豆根尖细胞微核检测技术对洗发水的毒性状况给出客观的评价，同时表明蚕豆根尖细胞MCN对胁迫很敏感，蚕豆根尖微核技术可用于洗漱用品的安全监测。

2. 材料与方法2.1实验材料蚕豆种子、洗发水、显微镜、镊子、培养皿、剪刀、载玻片、盖玻片、烧杯、Carnoys固定液、盐酸酒精解离液、改良苯酚品红染液、NaN3等。

一、实验目的1. 学习和掌握蚕豆根尖制片的基本技术和步骤。

2. 观察蚕豆根尖细胞的结构，了解其生长和分化特点。

3. 熟悉显微镜的使用方法，提高实验操作技能。

二、实验原理蚕豆根尖细胞具有明显的分生组织特征，包括根冠、分生区、伸长区和成熟区。

通过制片观察，可以了解蚕豆根尖细胞的有丝分裂过程和细胞分化特点。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜蚕豆、盐酸、酒精、蒸馏水、龙胆紫或醋酸洋红染液。

2. 实验仪器：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、解剖针、滴管、酒精灯、剪刀、剪刀夹、解剖盘。

四、实验步骤1. 取材：取新鲜蚕豆，用剪刀将根剪成约1.5cm长的根段。

2. 解离：将根段放入盛有盐酸和酒精混合液的锥形瓶中，加热至根段透明。

3. 漂洗：将解离后的根段用蒸馏水冲洗干净，去除盐酸和酒精。

4. 染色：将漂洗干净的根段放入装有染液的培养皿中，染色5-10分钟。

5. 制片：用解剖针将染色的根尖挑出，放在载玻片上，用盖玻片覆盖。

6. 压片：用镊子轻轻压盖玻片，使根尖细胞压扁，便于观察。

7. 观察：在显微镜下观察制片，记录蚕豆根尖细胞的结构特点。

五、实验结果与分析1. 根冠：位于根尖的顶端，细胞较大，排列不整齐，具有保护作用。

2. 分生区：位于根冠下方，细胞较小，细胞壁薄，细胞核大，细胞质浓，具有很强的分裂能力。

3. 伸长区：位于分生区上方，细胞停止分裂，开始迅速伸长，是根伸长最快的地方。

4. 成熟区：位于伸长区上方，细胞停止伸长，分化并形成根毛，是吸收水分和无机盐的主要部位。

在显微镜下观察，可以清晰地看到蚕豆根尖细胞的有丝分裂过程，包括前期、中期、后期和末期。

同时，还可以观察到细胞质分裂、细胞核分裂和染色体分离等现象。

六、实验结论通过本次实验，我们成功制成了蚕豆根尖制片，并观察到了蚕豆根尖细胞的结构特点。

实验结果表明，蚕豆根尖细胞具有明显的分生组织特征，包括根冠、分生区、伸长区和成熟区。

同时，我们还观察到蚕豆根尖细胞的有丝分裂过程，包括前期、中期、后期和末期。

实验六蚕豆根尖微核检测技术一、实验目的⒈了解微核测试原理和毒理遗传学意义。

⒉学习蚕豆根尖的微核测试技术。

二、实验原理微核（micronucleus,MCN）是真核生物细胞经各种理化因子作用后引起染色体畸变，在间期细胞中的一种表现形式。

在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3～1/10，染色与主核一样或稍浅。

一般认为微核是由无着丝粒的染色体断片或落后染色体，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。

当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即微核。

三、实验器材和药品松滋青皮蚕豆、显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、烧杯、Carnoys固定液、1mol／L盐酸、改良苯酚品红染液、NaN3。

四、方法与步骤⑴浸种催芽：择饱满、均匀的种子，洗净后用蒸馏水常规浸种、催芽24～30h，此期至少换水2次；待种子充分吸胀后，移入铺有干净、双层湿纱布的托盘内培养。

⑵用被检测液处理根尖：当初生根长到1～2cm时，选初生根生长良好的蚕豆6～8粒，分别放入蒸馏水（CK）、0.４mmol／L、0.８mmol／L、1.2mmol／L的NaN3中染毒8～12h。

⑶根尖细胞恢复培养：处理后的种子用蒸馏水（自来水）浸洗3次，每次2～3 min；将处理液洗净后，置于湿棉花上恢复22～24h；同时均设蒸馏水处理为空白对照组。

以上温度均为25℃。

⑷根尖细胞固定：将恢复后的种子，从根尖顶端切下1～1.5cm长的幼根，用Carnoys 固定液固定20～24h。

固定后的根如不及时制片，可换入70%的酒精溶液中置4℃冰箱中保存备用。

⑸酸解：用1mol／L盐酸在60±5℃下酸解8min，幼根软化即可。

⑹染色：吸去盐酸，用蒸馏水浸没幼根3次，每次1～2分钟。

最后浸于水中。

制片前取出置载玻片上，截下1～2mm左右长的根尖，滴1-2滴改良苯酚品红染液染色10～15min 后，加上盖玻片，覆以吸水纸常规压片。

实验四蚕豆根尖微核监测技术（VMT）一、实验目的学习如何利用高等植物间期体细胞遗传检测系统以监测环境中的致突变物。

二、原理在细胞分裂早期，若受到有害理化因子的攻击，使染色体发生断裂，产生染色体片段。

在这些片段中，有些可能重新愈合恢复正常，随细胞分裂进入子细胞，有些则由于缺乏着丝点，不能移向细胞的极部而变成圆球体，像卫星一样分布在主核的周围，这便是微核，由于染色体片段的大小和数量不一，所以微核的大小和数量也不相同。

而蚕豆根尖细胞的染色体大，DNA含量多，因而对诱发物的反应敏感，通过显微镜下的观察和计数，便可监测环境污染。

三、器材与试剂（一）显微镜、温箱、恒温水浴箱、冰箱、手揿计数器、解剖盘、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、试剂瓶、烧杯等显微镜压片实验用具。

（二）试剂1.5N HCl、45%醋酸、卡诺氏液（无水乙醇3份加冰醋酸1份配成，固定根尖时随用随备）、Schiff试剂、SO洗涤液。

2四、操作步骤1、蚕豆浸种催芽（1）浸种：将当年或前一年的松滋青皮豆种子按需要量放入盛有有自来水的烧杯中，臵25℃温箱内，浸泡20~30小时，此期间至少换水2次，换用的水最好事先臵于25℃温箱中预温。

（2）催芽：待种子吸胀后，用纱布松松包裹臵解剖盘内，保持温度，在25℃的温箱中催芽12~24小时。

待种子初生根露出2~3mm时，再选取发芽良好的种子，放入铺有薄层温脱脂棉的解剖盘内，仍臵入25℃的温箱中继续催芽，注意保护湿度。

再经24~36h，种子大部分初生根长至2~3cm，根毛发育良好，这时就可用来作为监测水源样品或药物溶液突变效应之间。

2、被监测液处理根尖（1）每一处理选取6~8粒初生根尖生长良好，根长一致的种子，放入盛有被测液的培养皿中，被测液浸泡住根尖即可，用自来水处理作对照，方法相同。

（2）处理时间4~6h。

3、根尖细胞恢复培养：（1）将处理的种子，用自来水浸洗8次，每次2~3min。

（2）洗净后的种子再放入新铺好湿脱脂棉的解剖盘内，按前述培养条件使根尖细胞恢复22~24h。