细胞生物学实验讲义(学生教材)

《细胞生物学实验》实验一细胞分裂相的观察（3 学时）一、实验目的：1、掌握减数分裂标本的制备方法。

2、掌握生殖细胞减数分裂发生过程及各个时期的染色体和细胞变化特点.3、了解植物生殖细胞的形成过程。

二、实验原理减数分裂是生殖细胞发生的一种特殊细胞分裂方式，特点是染色体复制一次，细胞分裂两次，形成4个子细胞，每个子细胞染色体数目减半。

经过受精作用后，染色体数目恢复，这样在物种延续过程中保证了遗传的相对稳定性和基因的多样性。

三、实验仪器、材料和试剂（一）仪器、用具：眼科镊子、解剖针、刀片、吸水纸、显微镜、载玻片、盖玻片（二）材料：普通小麦(Triticum aestivum,2n=2x=42)幼穗、大葱（Allium fistolosum, 2n=2x=16，花序外包绿色总苞者，长2-3cm）、黑麦（Secale cereale, 2n=2x=14，穗长约6-9cm，旗叶与倒耳叶距离3-5cm）；大麦(Hordeum sativum, 2n=2x=14)；玉米(Zea mays, 2n=2x=20)（三）试剂：苯酚品红、醋酸洋红、结晶紫A液：碱性品红 3g 溶于100ml 70%乙醇中（4℃冰箱中长期保存）B液：取A液10ml，加入90ml 5%苯酚水溶液（两周内使用）取B液45ml，加6ml冰醋酸和6ml 37%甲醛四、实验方法与步骤：1、取材：当小麦处于孕穗或期时，选取约3-5cm的幼穗，取材时间在上午6—9时为好。

2、固定：新鲜幼穗可直接观察，也可剥去外部叶鞘，剪下幼穗，投入Carnoy固定液中固定4-24小时后，倒掉固定液用95%、85%酒精换洗2次，每次1h，然后转入70%酒精中保存备用。

3、涂片与染色：取出一段幼穗，置于盛有蒸馏水的培养皿中，剥下一个小穗，取其中一朵小花，夹取其中一个花药置于清洁的载玻片上，用刀片切去花药的两端，加一滴苯酚品红染液，边染色边用镊子、解剖针用力涂抹挤压花药，挤出花粉母细胞，去掉花药等杂物，盖上盖玻片，用吸水纸吸取四周多余染液，即可观察。

如果染色过深，可加上一滴70%酒精分色，然后用吸水纸吸去多余染液再观察。

4、减数分裂时相的观察：先在低倍镜找着细胞，然后用高倍镜观察分裂相，绘图。

5、对于好的压片，可永久制片保留：（1）揭片：将玻片置于-20℃冰箱冷冻30min结冰，或放入液氮处理45～60s，用镊子或解剖刀直接揭开盖片，将有材料面朝上，37℃干燥，将晾干的载片及对应的盖片。

（2）脱水与透明：用由低浓度到高浓度（70％-80％-90％-100％）的梯度酒精冲洗1～2min，或在染缸中脱水2～5min，晾干。

注意：整个脱水透明过程中，必须保持载玻片和盖玻片原来相对的方向和位置，同时注意操作轻巧，以免造成玻片上材料漂失。

（3）封片：在中性树胶中加入1/5～1/4的二甲苯进行稀释，滴一小滴稀释胶在脱水透明后的载玻片中央，将盖玻片盖回原来位置封片。

注意：覆盖盖玻片时，按定位位置水平盖下，使之随着树胶的扩展自然下沉，切不可施加压力或移动盖玻片。

如发现封片中树胶有气泡，应让其自然逸出或用针尖烧热后烫一下，使气泡逸出。

如树胶滴得过多而逸出盖玻片四周，待树胶凝固后，用脱脂棉蘸二甲苯轻轻擦净逸出的树胶。

封片后平放晾干，镜检，物象清晰符合要求的保存，并贴上标签，注明标本名称、作者姓名和制片日期。

五、实验结果：六、作业：1、绘出你观察的细胞减数分裂相图。

注意：构图和布局、勾画轮廓、点点映衬、标注（右侧，引线平直，下方写图题，加括号表面放大倍数）2、简述减数分裂各时期的特征七、附：减数分裂过程的分期及特征1．前期I细线期：染色体呈细长的染色线，螺旋卷曲分散在细胞核内，沿着整条染色线分布着许多染色粒，形似念珠。

在细胞核内，核仁清晰可见。

偶线期：同源染色体彼此接近，发生联会。

在细线期末，偶线期初，染色体或染色丝在细胞千的部位发生变化。

在植物细胞中，染色丝凝集成块，偏于细胞核的一边，称为凝线期，在这—时期，还出现染色质(丝)穿壁转移运动。

在动物细胞中，染色丝的一端聚集到核的一侧，而另一端呈放射状扩散，呈花束状，特称花束期。

凝线期或花束期一直延续到偶线期结束粗线期开始为止。

粗线期：同源染色体完成配对，成为二价染色体(或成对的同源染色体)，染色体由于螺旋卷由的结果而缩得很短，每一粗线期的染色体具有两条并列的染色单体，成对的同源染色体含有四条染色单体，称为四分体，核仁附着于特定的染色体上。

双线期：同源染色体之间彼此开始分离，但是在一个或多个点上互相交叉而又保持在一起，形似麻花。

在该期，同源染色体的两个染色单体之间发生交换。

终变期：染色体缩得更短，交叉移向染色体的户间或末端，呈现V型、8型、O型或X型。

染色体常移到核的周围靠近核膜的地方，是统计染色体的最好时期。

该期结束时，伴随着核膜的破裂和核仁的消失。

2．中期I核膜和核仁已消失，染色体排列在赤道面上，两极出现纺锤体并与染色体的看丝点相连。

此时所有四分体都排列在纺锤体的中部。

3．后期I每个四分体中的两各同源染色体，由于着丝粒的作用而彼此分离．逐渐向两极移动，形成两组染色体。

4. 末期I当两组染色体移动到两极后又聚集起来，核膜重新出现。

在第一次核分裂之后，有些物种紧接着就进行胞质分裂，如百合、洋葱等，但有些物种则不接着进行胞质分裂，而是在第二次核分裂后才进行胞质分裂，如蚕豆、聚合草等。

5．间期当减数第一次分裂后，两个子细胞(或核)经过一个很短的问期(即中间期)，便进入减数第二次分裂。

随着物种的不同，间期的长短不一，有些物种的细胞完全没有间期。

6．前期II一末期II分裂情况与有丝分裂相同。

在减数第二次分裂后，紧接着进行胞质分裂。

至此，一个母细胞分裂成染色体数目减半的四个子细胞。

在植物中，减数分裂后，每个小孢子(花粉)母细胞成为四分孢子，每个小孢子脱离母细胞壁成为游离的小孢子，以后继续发育成为成熟花粉(二核或三核花粉)。

在动物中，减数分裂结束时．一个精母细胞成为四个精子，每个精子细胞经过一系列的分化，转变成为精子。

在雌性方面，—个大孢子母细胞(植物)或卵母细胞(动物)经减数分裂产生”卵及三个极体。

实验二DNA的细胞化学检测方法—Feulgen反应（4学时）一、实验目的了解Feulgen反应的原理，掌握Feulgen染色的方法。

二、实验原理DNA经弱酸（1M HCl）水解，其上的嘌呤碱基和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与Schiff试剂反应，形成紫红色化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。

紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色基团，所以具有颜色。

对照组不经过酸水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专—性。

(吸水纸。

(二) 材料：洋葱鳞茎或普通小麦根尖。

(三) 试剂（1) 1 M盐酸的配制：取82.5ml密度1.19g／m1的浓盐酸加蒸馏水至1000m1。

（2) Schiff试剂的配制及保存：称取0.5g碱性品红加入到100m1煮沸的蒸馏水中(用三角烧瓶)，时时振荡，继续煮5min(勿使之沸腾)，使之充分溶解。

然后冷却至50℃时用滤纸过滤到磨口棕色试剂瓶中，滤液中加入10ml l M HCl，冷却至25℃时，加入0．5g K2S2O5(偏重亚硫酸钾)．充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24h(有时需2—3d)，使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，剧烈振荡lmin，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。

滤液应为无色也无沉淀．贮于4℃冰箱中备用。

如有白色沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钾，使之再转变为无色时，仍可再用。

（3）10％偏重亚硫酸钾（4）亚硫酸水：取200ml自来水，加10 ml 10％偏重亚硫酸钾水溶液和10m1 lM HCl ，三者于使用前混匀。

（5）5％三氯醋酸四、实验方法与步骤(1) 将小麦根尖或鳞茎内表皮放在l M HCl中，加热到60℃水解8－10min。

(2) 蒸馏水水洗。

(3) Schiff试剂遮光染色30mm。

(4) 用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗3次，每次1min。

(5) 水洗5min。

(6) 将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压片（洋葱内表皮不用压片）(7) 显微镜检查，细胞中凡有DNA的部位应呈现紫红色的阳性反应。

对照片方法一：CK1:先将材料放在5％三氯乙酸中90℃水浴15min，主要把DNA抽提掉，然后按步骤(2)-(7)制片观察。

方法二：CK2:材料不经l M HCl 水解，直接放在Schiff试剂中染色，然后按步骤(2)-(7)制片观察。

方法三：CK3:材料经l M HCl 水解30 min，直接放在Schiff试剂中染色，然后按步骤(2)-(7)制片观察。

五、实验结果：六、作业：(1) 绘图示细胞DNA的分布部位。

(2) 说明设立对照的必要性。

实验三细胞膜的渗透性（3学时）一、实验目的：1、了解细胞膜的选择渗透性（即半透膜）的特性。

2、了解不同性质溶液对细胞膜透性的影响。

二、实验原理将红细胞放入等渗溶液或高渗溶液中，由于红细胞细胞膜对各种溶质的透性不同，有的可以溶质渗入，有的溶质不能渗入，渗入的溶质能提高红细胞内渗透压，促使水分子进入红细胞，引起溶血，由于溶质透入的机制和速度不同，因此溶血时间也不同。

溶血现象可作为测量物质进入红血细胞速度的一种指标。

溶血现象发生的快慢与加入细胞的溶质脂溶性大小、极性与非极性、分子量大小有关，具有以下规律：1、脂溶性物质、非极性物质比水溶性物质、极性物质穿膜快。

2、分子量大、分配系数大的非极性、脂溶性物质穿膜比分子量小、分配系数小的快。

3、疏水的小分子O2、CO2、N2、苯和小的不带电荷的极性分子如尿素、甘油、H2O可自由穿膜。

4、其他大的不带电荷的极性分子和带电无机离子，如葡萄糖、蔗糖、氨基酸、核苷酸、Na+、K+、Cl-等则要通过简单扩散、协助扩散（载体蛋白、通道蛋白）、主动运输等多种方式完成穿膜，穿膜的机制不同，溶血速度差异较大，情况复杂。

非极性化合物易溶于脂溶剂，但在水中溶解度很小。

分子量越大，碳链越长，脂溶性越大。

一种化合物在脂溶剂中的溶解度与其在水中溶解度之比，称为分配系数。

电解质溶液（如NaCl）与非电解质（如葡萄糖）分子数相等时，电解质产生的渗透压要大的多。

具有相同渗透压的某非电解溶液与某电解质溶液浓度之比，称为等渗系数。

用i来表示： i＝（葡萄糖的等渗物质的量浓度／NaCl的等渗物质的量浓度）。

发生溶血者为低渗液，所以把发生溶血的前一管溶液的浓度近似视为红细胞等渗。

三、实验仪器、材料和试剂：(一)仪器、用具：小烧杯、试管、试管架、(二)材料：含适量肝素（20mg×140U/1mlH2O=2800U/ml,用量15U/1ml血液，0.5ml肝素水溶液/50ml 血）的兔血。