细胞生物学实验讲义

细胞生物学实验室规则与操作要求为获得较好的实验结果，避免发生差错与意外事故，特制定以下规则与要求，希望实验者能严格遵守。

（一）显微镜的使用及保护①显微镜是细胞生物学实验的主要观察工具，使用时必须注意保持外观整洁、防湿、防高温、防药品侵蚀，使用时勿使染液或其它溶液沾污镜头，一旦沾污，及时用擦镜纸蘸上镜头清洗液（无水乙醚：无水乙醇＝7：3）轻轻擦拭干净。

②带光源的显微镜待电压稳定后，将电源的光亮度调节器调至最小，再打开显微镜的电源，缓慢调节光亮度适当进行量度观察，观察完毕后，则先将光亮度调节器调至最小，然后再关闭显微镜电源开关。

③镜头的清洗：实验完毕后，镜头的清洗很重要。

用擦镜纸蘸取少量镜头清洗液，先从镜头的中央开始清洗，轻轻旋转擦至镜头的边缘部分，如此重复2－3次。

④载物台必须保持清洁，必要时亦可用擦镜纸蘸少量清洗液擦试载物台。

聚光器上的污物的去除亦可采用类似的方法。

⑤使用完毕后，玻片一律取下，套上布袋.放回原处。

本桌的显微镜一律不准搬离本实验桌。

若需使用者，可到该桌使用，使用后务必保持该显微镜的清洁。

如若发现违章使用情况，必追究使用者责任，本次实验作零分计。

（二）实验时，实验室内，一律不准高声喧哗整洁，保持室内安静，认真操作，仔细做好各项观察与记录。

（三）实验室内的一切仪器、物品必须爱护。

节约材料、药品，取用时不要过量。

公用物品不得独自占用，用后归还原处。

（四）注意安全。

使用有毒物品、强酸、强碱等，应严格按照操作规程。

易燃物品远离火源。

禁止湿手拿取电源开关或接触电源。

如发生触电等事故，及时报告。

（五）取用各种试剂，要用及时盖上瓶盖。

按献宝取出所需之药品或溶液后，不得将原液倒回瓶内。

滴管、玻棒、吸管不可混用。

（六）实验中如有丢失、损坏仪器设备及用具，及时登记并报告，凡违反操作规程造成不应有的损失者，视其情节轻重，态度好坏，按有关规定处理。

（七）本实验室欢迎各位实验者对每一实验本身提出新的看法与做法，至于能否采用，视具体情况而定。

2011级细胞生物学实验讲义实验一细胞膜通透性观察一、实验目的1.了解细胞膜对物质通透性的一般规律。

2.了解溶血现象及其发生机制。

二、实验原理细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。

它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。

细胞膜的通透性孔径不会大于0.5-1.0nm，并非所有的物质都能通过。

各种物质出入细胞的方式是不同的，带电的物质通常同水结合形成一个水合的外壳，这不仅增加了它们的分子体积，同时也大大降低了脂溶性，因此带电荷的分子（离子），不管多小，都不能自由扩散。

各种非电解质进入细胞的快慢，决定于分子量的大小和极性。

相对分子质量大的物质进入细胞慢，非极性分子比极性分子容易穿膜。

在细胞膜上有专门的水通道-水孔蛋白、和运输特定物质的载体蛋白，它们的运输方式为易化扩散。

水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。

渗透作用是细胞膜的主要功能之一。

将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。

将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。

各种非电解质溶液，只要单位面积中所含的分子数相同，就具有相同的渗透压。

将红细胞置于乙二醇、丙三醇、葡萄糖等摩尔浓度的高渗液中，分子进入红血细胞，导致水的摄入，使细胞膨胀、破裂发生溶血。

溶血现象发生的快慢与进入细胞的物质的分子量有关，相对分子质量大的进入细胞慢，发生溶血所需的时间也长。

因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。

本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。

二、实验仪器、材料和试剂1、仪器、用具：小烧杯、试管、试管架、刻度吸管、秒表。

2、材料：含适量阿氏液的鸡血或兔血。

视频3.6 单个核细胞分离结果分析同学们好！我们在前面的视频中学习了“研磨法分离小鼠脾脏单个核细胞”和“密度梯度离心法分离外周血单个核细胞”的原理、操作等内容，本视频我们一并对两个实验结果加以分析。

首先，让我们先复习一下单个核细胞的概念及组成。

单个核细胞是指外周血和免疫器官中具有单个核的细胞，主要包括单核细胞和淋巴细胞等密度相近的几种免疫细胞。

其并非某种特定细胞类群。

因此，观察单个核细胞形态和计算纯度时要综合考虑这几种细胞。

1、密度梯度离心法正常分离效果：纯度， 80%左右；回收率，60%左右。

图1中细胞纯度接近80%，算比较好的分离结果。

图2中单个核细胞比率很低，混有大量红细胞和血小板。

2、脾脏单个核细胞理想分离效果：活细胞比率﹥90%，如图3。

图4则死细胞偏多。

3、外周血单个核细胞分离纯度低的原因：吸取单个核细胞层时操作不当。

（1）扰动了分层液，使沉于管底的红细胞上浮；（2）吸取上层含血小板液体太多。

4、外周血单个核细胞回收率低的原因（1）血液在普通玻璃或塑料容器中放置时间过长，部分细胞因贴壁而损失。

（2）吸取单个核细胞不完全。

（3）离心收集单个核细胞时速度偏低、时间偏短。

（4）用普通低速离心机离心时，部分细胞沉于管壁而非管底，吸弃上清和重悬时易损失。

5、脾脏单个核细胞活率低的原因（1）研磨力度过大。

（2）在同一位置反复研磨。

（3）没有及时用D-Hanks液将研磨游离的细胞冲入悬液。

6、改善外周血单个核细胞分离纯度的方法：吸取单个核细胞的吸管进入细胞悬液前先排出部分气体；缓慢进入单个核细胞层；小心吸取中间层细胞。

避免在液体中反复挤压吸管。

7、提高外周血单个核细胞回收率的措施（1）血液一经采集尽快分离。

（2）用聚丙烯离心管代替普通离心管盛装血液和分离细胞。

（3）有条件时使用水平离心机。

（4）淋巴细胞分离液密度较大，如吸入较多，应适当调大离心速度并延长离心时间。

8、改善脾脏单个核细胞活率的方法（1）组织块分割要小。

视频4.5 细胞培养结果分析
同学们好！
我们在前面的视频中，学习了“鸡胚原代细胞的获取与培养”和“贴壁细胞的传代培养”。

因细胞培养效果对细胞形态和性能影响很大，需要经常检查细胞培养物，分析培养物状态。

细胞培养物的常规检查：（1）培养液酸碱度；（2）培养物有无微生物污染；（3）培养细胞生长状态。

1、培养液酸碱度检查
因培养液中加有酚红指示剂，可通过看颜色检查酸碱度。

橙色：pH7.0左右。

黄色：pH﹤6.8，偏酸。

红色：pH﹥8.0，偏碱。

当培养液颜色变黄时就需要换液。

2、培养物微生物污染常规检查
肉眼检查：有无真菌菌落；培养液是否浑浊。

显微镜观察：
真菌：可看到真菌菌落和菌丝。

细菌：可见微小、闪光的球形或杆状小颗粒，有时可见明显的运动。

酵母：可见卵形或球形酵母细胞，有的细胞表面出有小芽。

3、培养物细胞观察
（1）贴壁细胞生长状态
状态良好的细胞：明亮、透明而饱满，轮廓不清。

状态不良的细胞：形态不规则，轮廓增强、透明性降低，胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，严重者贴壁细胞脱壁悬浮。

（2）贴壁细胞贴附比例：细胞贴附比例高的培养物中，细胞基本呈贴壁生长，有少量明亮的圆形细胞，为处于分裂期的贴壁细胞；细胞贴附比例低的培养物，可看到大量漂浮的圆形细胞。

其中，深色、灰暗细胞，一般为因消化过度而死亡的贴壁细胞；明亮饱满细胞，则是混入原代贴壁细胞培养物的悬浮细胞。

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视频3.5 巧取小鼠腹腔巨噬细胞
同学们好！
小鼠腹腔巨噬细胞可用于细胞吞噬功能检测、酸性磷酸酶显示、细胞骨架的显示等实验。

利用一定技巧，抽取腹腔液即可获得其中巨噬细胞。

实验原理：巨噬细胞天然存在于小鼠腹腔，用生理盐水冲洗腹腔后抽取腹腔液体，即可获取其中的巨噬细胞。

实验材料和用品：6-8周龄健康小白鼠；普通光学显微镜；10mL低速离心机；托盘天平；解剖盘；解剖剪；10mL聚丙烯离心管；40mL小烧杯；5mL一次性注射器；吸管；载玻片；盖玻片；0.9%氯化钠生理盐水。

实验操作环节：脱颈处死小鼠——向腹腔注射生理盐水——解剖暴露腹膜——抽取腹腔液——制备装片——显微观察。

操作细节如下：
1、脱颈处死小鼠。

2、向腹腔注射生理盐水：将小鼠腹部朝上放到解剖盘里；吸取2mL生理盐水；
提起小鼠腹中部的皮肤和腹膜；让针头从提起处扎进小鼠腹腔；缓缓推出生理盐水；轻揉小鼠腹部数次；静置3~5min。

3、解剖暴露腹膜：用镊子从下腹部腹中线处提起皮肤，使与腹膜分开；先在镊
子提起处将皮肤剪开一个小口，再向上、向下剪开整个腹部皮肤；用双手拇指和食指分别在腹中部捏住两侧皮肤，慢慢向两边撕开，使腹膜暴露。

4、抽取腹腔液：左手拇指和食指夹住小鼠一侧皮肤，中指由外向内挤压内脏，
在腹腔内形成空隙；将注射器针头插入空隙处，抽取腹腔液；拔下针头，将腹腔液注入离心管。

5、制备装片。

6、显微观察。

注意事项
尽量避免被小鼠咬伤或吸过小鼠腹腔液的针头扎伤；一旦被咬伤或扎伤，要到专门机构尽快注射狂犬疫苗或同时注射狂犬免疫球蛋白，不能超过24小时。

细胞生物学实验讲义细胞内DNA和RNA的显示一、目的要求1、掌握显示细胞内DNA和RNA的方法。

2、熟悉细胞内DNA和RNA的分布位置。

二、实验原理核酸是酸性的，它们对于碱性染料派洛宁和甲基绿具有亲和力。

利用这两种染料的混合液处理细胞，可使其中的DNA和RNA呈现出不同的颜色，这种颜色上的差异由DNA 和RNA聚合程度的不同所引起，因为甲基绿分子上有两个相对的正电荷，它与聚合程度较高的DNA分子有较强的亲和力，可使DNA分子染成蓝绿色；而派洛宁分子中仅一个正电荷，可与低聚分子RNA相结合使其染成红色。

这样细胞中的DNA和RNA可被区别开来。

三、器材与试剂1、器材：光学显微镜、载玻片、盖玻片、染色缸、染色架、注射器。

2、材料：鸡血。

3、试剂：0.2mol/L醋酸缓冲溶液、2%甲基绿染液、1%派洛宁染液、甲基绿·派洛宁混合染液。

4、试剂的配制（1）2mol/L醋酸缓冲溶液：用2ml注射器抽取1.2ml冰乙酸加入到98.8ml蒸馏水中，混匀。

再称取醋酸钠（NaAC·3H2O）2.72g 溶于100ml蒸馏水中，使用时按2：3的比例混合两液即成。

（2）2%甲基绿染液：称取 2.0g去杂质甲基绿溶于100ml0.2mol/L的醋酸缓冲溶液中即成。

甲基绿粉中往往混有影响染色效果的甲基紫，它们必须预先除去，其方法是将甲基绿溶于蒸馏水中，放在分液漏斗中加入足量的氯仿（三氯甲烷）用力振荡，然后静置，弃去含甲基紫的氯仿，再加入氯仿重复数次，直至氯仿中无甲基紫为止，最后放入40 C温箱中干燥后备用。

（3）1%派洛宁染液：称取1g派洛宁（吡罗红）溶于100ml0.2/L醋酸缓冲溶液中混匀。

（4）甲基绿派洛宁混合染液：将2%的甲基绿液和1%的派洛宁液以5：2的比例混合均匀即可。

该液应现配现用，不宜久置。

四、内容与方法1、取鸡血一小滴在干净的载玻片一端，用另一载玻片的一端紧贴血滴，待血液沿其边缘展开后，以30~400角向玻片的另一端推去，制成较薄的血涂片，室温下晾干。

植物组织培养一、实验目的1、掌握植物细胞无菌培养技术。

2、了解不同激素对细胞的不同诱导作用。

二、实验原理植物组织培养是20世纪60年代以来植物细胞生物学中发展起来的一项生物技术。

它是借用无菌操作方法，培养植物的离体器官，组织或细胞，使其在人工合成的培养基上，通过细胞的分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整的再生植株。

植物组织培养技术的研究，不仅具有重大的理论意义，而且在生产实践中也已显示了广阔的应用前景。

组织分化与形态建成问题，快速繁殖与去除病毒，花药培养与单倍体育种，幼胚培养与试管受精，抗体突变体的筛选于体细胞无体系变异，悬浮细胞培养与次生物质生产以及超低温种质保存等方面的深入研究与实际应用，都必须借助植物组织培养技术的基本程序和方法，深刻理解植物细胞的全能性。

三、实验用品1、材料半夏无菌苗。

2、仪器卧式灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养箱或培养室。

3、用具镊子、刀、牛皮纸、marker笔、棉线。

4、器皿试剂瓶(50、100、1000ml)、三角瓶(100ml)、刻度吸管(0.5、1、5、10ml)、培养皿(直径9～11cm)。

5、药品与试剂1).药品(见下表)2).70％酒精四、实验方法1、培养基的配制配制培养基前先要配制母液。

母液分大量元素、微量元素、铁盐及有机物质四类。

(各类成分浓度、用量详见下表)。

表1 MS培养基母液配制(单位：mg)1).大量元素母液(10倍液)分别称取10倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约800ml热的(60～80℃)蒸馏水中。

一种成分完全溶解后再加入下一种，最后加水定容至1000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用。

2).微量元素母液(100倍液)分别称取100倍用量的微量无机盐，依次溶解于800ml重蒸水中，加水定容至1000ml。

3).铁盐母液(100倍液)称取100倍用量的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸钠)和FeSO4·7H2O溶于800ml重蒸水中，最后定容到1000ml。