实消的步骤及注意事项

LSC-C-SC.2-020 1-3**集团氨基酸事业部1目的：通过建立发酵罐实消操作规程，以规范发酵罐实消操作。

2范围：本标准适用于发酵车间发酵罐。

3责任：发酵车间操作人员、发酵车间主任对本规程实施负责，QA 监督。

4内容：4.1实消内容4.1.1负责消沫剂罐实消，以保证物料的无菌度。

4.2、操作程序4.2.1关闭空气进气阀门，全开排气阀门，卸去罐内压力。

压力表上显示为“0”，取出pH、溶氧电极安装孔内的孔塞。

注意：此时罐内必须没有压力。

将标定好的pH、溶氧电极安装到罐体电极插孔内（电极标定参考电极标定操作规程），电极用螺母固定好与控制系统相连4.2.2固定好罐盖螺栓。

注意：发酵罐盖密封垫应放平衡，螺栓应对称；螺栓和各接口螺母牢靠即可。

不要拧得过紧，防止损坏螺栓和橡胶密封圈。

4.2.3检修结束后，进行罐体密闭性试压。

检查阀门排气阀、取样口第一阀、罐底第一阀是否关闭，慢慢开启空气阀门向罐内通入空气，待空气压力达到0.12——0.14MPa 时，关闭空气进气阀。

维持10 分钟观察压力表有无变化；用配制好的5%洗衣粉水进行试压。

具体试压部位有：罐面视镜密闭性、搅拌轴封、取样口、出料阀、罐面压力表接触处。

在各个部位进行喷洒，根据有无肥皂泡冒出来判断其气密性。

开启取样口阀，将取样口浸入洗衣粉水中观察有无气泡来判断取样口第一阀气密性；关闭取样口第二阀开启第一阀同样验证取样口第二阀气密性。

4.2.4试压结束后，慢慢开启排气阀，要求排气阀门全开，卸去罐内压力。

压力表上显示为“0”，打开罐盖。

4.2.5打料试压结束后关闭阀门罐底第一阀、取样口第一阀，打开打料阀门将配制好的培养基料液打入发酵罐内。

关闭罐盖。

4.2.6检查阀门循环水阀门、空气第一阀、罐顶空气阀、罐底第一阀、罐底第二阀是否关闭，然后开启阀门各个小排气、外盘管排空阀、排气阀，其中排气阀、排空阀、列管排空阀均为全开，其余均为半开或微开。

4.2.7实消开启控制系统搅拌电源进行低速运转。

发酵罐操作流程1 技术准备发酵罐使用之前，应先检查电源是否正常，空压机、循环水系统是否能正常工作。

同时要检查管道是否通畅及废水废气管道的完好情况。

2 空消在投料前，气路、料路、发酵罐罐体必须用蒸汽进行灭菌，消除所有死角的杂菌，保证系统处于无菌状态。

2.1 空消步骤打开蒸汽总开关----打开排冷凝水阀-------打开蒸汽过滤器开关------关闭预过滤器开关---打开空气精过滤器开关---打开进罐空气阀---打开空气排气阀---打开上分气包进发酵罐蒸汽阀---打开取料口进罐蒸汽阀---打开取样口排气----打开上分汽包进下分汽包阀---打开下分汽包总开关---打开下面进罐体蒸汽阀---打开接菌口和流量计出的排气阀。

2.2 空消注意事项2.2.1 空气管路上有预过滤器和空气过滤器，预过滤器不能用蒸汽灭菌，因此在空气管路通蒸汽前，必须将预过滤器的阀门关闭。

2.2.2 空消时，应将罐上的接种口、排气阀及料路阀门微微打开，使蒸汽通过这些阀门排出，同时保持罐压为0.13~0.15Mpa,空消时间为50分钟，夹层排水阀一直打开。

2.2.3 经常用手感受进蒸汽管道的畅通。

2.2.4 发酵罐空消前，应将夹套内的水放掉。

空消结束后，应将罐内冷凝水排掉。

2.2.5空消结束后要通入无菌风吹干管路，并且管路和罐体要始终保持正压，以免杂菌的进入。

3 罐体实消实消是当罐内加入培养基后，用蒸汽对培养基进行灭菌的过程。

空消结束后，罐体压力降至0.03Mpa,打开罐体下面出料口排水阀排冷凝水，待排完后，关紧出料口阀门。

打开进料口，加入培养基，拧紧。

3.1 实消步骤开启机械搅拌装置---打开蒸汽总开关---打开拍冷凝水阀---打开上分气包进发酵罐蒸汽阀---打开夹层蒸汽阀---打开排气口排罐体冷空气---夹层温度达到95℃时关闭夹层蒸汽阀---打开罐体上面进蒸汽阀---打开上分汽包进下分汽包阀---打开下分汽包总开关---打开下面进罐体蒸汽阀---罐体压力达到0.15Mpa时开始计时，通过调节蒸汽阀保压30分钟。

发酵系统操作规程一、发酵前准备工作（1）检查电源是否正常，空压机、微机系统和循环水系统是否正常工作。

（2）检查系统上的阀门、接头及紧固螺钉是否拧紧.（3）开动空压机,用0。

15Mpa压力，检查种子罐、发酵罐、过滤器、管路、阀门等密封性是否良好，有无泄漏。

罐体夹套与罐内是否密封（换季时应重点检测），确保所有阀门处于关闭状态（电磁阀前方的阀门除外）.（4）检查水（冷却水）压、电压、气(汽）压能否正常供应。

进水压维持在0.12Mpa，允许在0.15—0.2Mpa范围变动，不能超过0.3Mpa，温度应低于发酵温度10℃；单相电源AC220V±10%,频率50Hz，罐体可靠接地；输入蒸汽压力应维持在0。

4Mpa，进入系统后减压为0.24MPa；空压机压力值0。

8Mpa,空气进入压力应控制在0.25—0。

30MP（空气初级过滤器的压力值）。

（5）温度、溶氧电极、PH电极校正及标定，详见触摸屏PH、DO的标定帮助。

（6）检查各电机能否正常运转（共4个）。

电磁阀能否正常吸合（整套系统共11个电磁阀）。

二、灭菌1.发酵系统安装好后的初次清洗罐内的清洗：酸碱罐、补料罐、种子罐可将罐体上方的法兰卸开，由操作工采用洁净布手动清洗,结束后排尽罐内的污水，在多冲洗几遍即可.发酵罐的清洗可采用自来水管通过手孔向罐体内壁冲洗，当水位上升到搅拌轴的第二片叶轮时停止冲洗，开动电机搅拌清洗。

各管路的清洗，可以先采用清水冲洗，再根据相应功能采用相应的清洗介质(清洗管路时应以保护管路中的各种元件为前提),具体步骤可参考“空气管路的灭菌"。

如果发酵系统长时间不用或培养的菌体与上一批次的不相同时，可采用2%NaOH清洗,其他各罐也可以采用发酵罐的清洗方式清洗，清洗结束后应对发酵系统灭菌。

2.空气管路的灭菌（1）空气管路上的除菌过滤器，使用蒸汽通过减压阀（空气减压阀不能进行蒸汽灭菌，所以空气预过滤器不灭菌）、蒸汽过滤器然后进入除菌过滤器。

发酵罐的实消及接种发酵一、实验目的1、学习发酵过程中培养基的添加、实消、接种等一般操作过程。

2、对发酵罐进行参数设定并对发酵罐进行自动化控制，完成培养、取料、罐的清洗等步骤。

二、实验原理（一）培养基的添加⏹按工艺要求配制培养基原液。

⏹打开排气阀F14，关闭进气阀F13，卸去罐内压力；将校验好的pH、DO电极装入发酵罐内。

注意：传感器的坡面要放置正确，使得罐壁平滑；防止出现死角灭菌不彻底。

⏹打开罐盖上的加料口，将培养基原液加入发酵罐内，并加水至所配培养液总量的75～85％左右（视环境温度、蒸汽压力及接种量而定，其余25～15％为蒸汽冷凝水和种子量）。

⏹拧紧加料口螺母，但不要太紧以免损坏密封圈。

（二）培养基的实消⏹检查夹套排水阀F33是否打开，夹套水是否排尽。

⏹夹套预热：打开F2、稍开F33，接通电源，开电源开关，手动开启搅拌电机，调节电机转速至150rpm左右，进行慢速搅拌。

注意：F2不要太大，防止产生内压而损坏罐体。

夹套预热是为了防止进入罐内的水蒸气冷凝成水后改变培养基浓度。

⏹当发酵罐内的温度达到80℃左右时，打开F4、F22，排尽蒸汽罐中冷凝水后即关闭F22；稍开F21，使蒸汽徐徐进入发酵罐；继续升温⏹关闭进气阀F13，并将排气阀F14调为微开⏹当培养液养液温度达到95～100℃后可停止搅拌。

当发酵罐内温度达到灭菌要求温度时，关闭阀门F4和F14。

在灭菌过程中，应时刻注意罐压，并控制在0.1～0.11MPa 之间，严禁超压。

罐压的控制通过调节阀门F2和F33来实现。

⏹注意在升温过程中，要关闭冷却水，否则当温度设定值设定在培养温度时，冷却水管中会自动通冷却水，不仅会影响升温速度、浪费水蒸气，更重要的是会引起冷凝水过多，引起培养液浓度变化或不能达到灭菌效果。

⏹实消时间一般为30分钟。

到时间后，关闭F2、F14。

自然冷却10分钟左右。

⏹通冷却水进行冷却，操作如下：关闭夹套排水阀F33，按冷却键，至手动冷却状态；或调整温度设定值(调节方法见“DF-B1C控制系统的操作说明”)，按冷却键至自动状态；此时起即进入控温状态。

一、实验目的1. 理解实罐灭菌的概念和原理。

2. 掌握实罐灭菌的操作步骤和注意事项。

3. 通过实验验证实罐灭菌的效果。

二、实验原理实罐灭菌是一种将培养基放入发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培养基和容器加热至灭菌温度后维持一定时间，再冷却到接种温度的灭菌方法。

该方法无需专门的灭菌设备，灭菌效果可靠，但温度低、时间长，对培养基成分破坏较大。

三、实验材料1. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基2. 发酵罐：5L通气机械搅拌发酵罐3. 蒸汽发生器4. 温度计5. 秒表6. 冷却水四、实验步骤1. 空消：将发酵罐用蒸汽进行灭菌，消除所有死角的杂菌，保证系统处于无菌状态。

具体操作如下：- 将发酵罐内加入适量的水，开启蒸汽发生器，调节蒸汽压力至0.13MPa。

- 维持蒸汽温度在121℃左右，先开排污水阀和进气阀，排空夹套水。

- 对气路、料路、种子罐、发酵罐进行灭菌，空消时间大约为30到40分钟。

- 当设备初次使用或长期不用的情况下，最好采用间歇灭菌的方法，即第一次空消结束后，间隔3到5个小时再空消一次，以便杀死芽孢。

- 蒸汽减压阀必须调整在0.13MPa，不得超过0.15MPa。

- 空消时，应将罐上的接种口、排气阀及料路阀门微微打开，使蒸汽通过这些阀门排出，同时保持罐压为0.13～0.15MPa。

- 空消结束后，应将罐内冷凝水排掉，并将排空阀门打开，防止冷却后罐内产生负压、损坏设备。

- 空消时，溶氧、pH电极取出，可以延长其使用寿命。

2. 实消：当罐内加入培养基后，用蒸汽对培养基进行灭菌。

具体操作如下：- 将配好的培养基从加料口加入罐内，此时夹套内应无冷却水。

- 开启蒸汽发生器，调节蒸汽压力至0.13MPa。

- 维持蒸汽温度在121℃左右，维持一定时间，以确保培养基和容器内所有微生物被杀灭。

- 实验过程中，应密切观察罐内压力、温度变化，确保灭菌效果。

- 灭菌结束后，关闭蒸汽发生器，将发酵罐冷却至接种温度。

五、实验结果经过实罐灭菌处理后，培养基和发酵罐内均无杂菌生长，说明实罐灭菌效果良好。

任务三：发酵罐实消、接种子任务二；发酵罐接种引导课文通过本任务的学习你应该能够掌握下列知识：1．掌握小型发酵罐无菌接种的原理和方法。

2．理解杂菌污染的途径和防治方法。

3. 掌握接种安全操作规程通过操作训练你应该具有下列能力：1. 能进行发酵罐无菌接种操作。

2．对接种异常问题能及时预见、反应、处理。

3. 能严格按照安全操作规程进行操作。

前面我们已经制备了符合要求的产黄青霉菌种子，进行了发酵罐的清洗及空消、实消，接下来的任务就是进行接种了，那么发酵罐接种的知识你了解多少呢？一、无菌接种的必要性：案例：山东省某大型制药企业的2号发酵生产车间连续发生染菌污染事件，且每次杂菌的种类基本相同，分析可能染菌的原因，提出检查方案和防治措施。

分析：若排除了管路灭菌、空消、实消不彻底而导致染菌的因素外，能导致污染的另外一个原因就是接种操作不规范引起的。

我们的发酵属于纯培养，是由单一菌种接种以后进行的培养，其中不可以有任何杂菌，否则会影响产品的使用效果，所以为了确保每一批发酵的成功，在上罐之前，发酵人员必须具备以下两种意识：⏹无菌意识⏹安全意识二、接种量的确定接种量指移入的种子液体积与接种后培养液体积的比例接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。

但接种量过大或过小，均会影响发酵。

接种量过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而却会过多移入代谢废物；接种量过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。

通常接种量：细菌1-5%，酵母菌5-10%，霉菌7-15%，有时20-25%。

二、发酵罐接种的方法一般情况下，发酵罐接种有三种方法：①火圈直接倒种②注射器接种③压力差接种。

前两种方法适用于小型发酵罐，第三种方法适用于大型工业化生产发酵罐。

1、火圈直接倒种法操作规程如下：⏹当发酵液温度降到接种温度时即可进行接种。

⏹准备合格的摇床菌种。