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第８章《植物脱毒技术》复习题参考答案一、填空：1、目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径是茎尖培养脱毒。
2、通过茎尖或根尖离体培养可获得无病毒再生植株。
3、通过茎尖培养脱毒时，常以带1-3个幼叶原基的茎尖（约0.3—0.5mm）作外植体较合适。
4、分子生物学鉴定脱毒苗的主要方法：①双链RNA法(dsRNA)和②互补DNA(cDNA)检测法。
5、无病毒苗的保存分：隔离保存和长期保存两种方法。
二、名词解释：1、无病毒苗（virus-free plantlets）：是指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物内的存在表现阴性反应的苗木。
2、微尖嫁接技术（micrografting shoot-tip）：指在人工培养基上培养实生砧木，嫁接无病毒茎尖以培养脱毒苗的技术。
主要程序：无菌砧木培养—茎尖准备—嫁接—嫁接苗培养—移栽。
3、指示植物(indicator plant method)：将一些对病毒反应敏感、症状特征显著的植物作为指示植物（又称鉴别寄主），利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法。
三、问答题：1、植物脱毒的主要方法有哪些？其主要原理是什么？（1）茎尖培养脱毒：病毒在植物体内的分布并不均匀，越靠近茎端的病毒的感染深度越低，生长点则几乎不含或含病毒很少（2）愈伤组织培养脱毒法：通过植物的器官和组织的培养，脱分化诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗（3）珠心胚培养脱毒：病毒一般不通过种子传播，由珠心细胞发育成的胚再生的植株是无毒的，并具有与母本相同的遗传特性。
（4）茎尖微体嫁接：将实生苗砧木在人工培养基上种植培育，再从成年无病树枝上切取0.4—1.0mm茎尖，在砧木上进行试管微体嫁接，以获得无病毒幼苗。
（5）花药培养脱毒（6）热处理脱毒：一些病毒对热不稳定，在高于常温的温度下（35-40℃），即钝化失活（7）化学处理：抑制或杀死病毒2、说明微尖嫁接技术脱毒的程序微尖嫁接技术指在人工培养基上培养实生砧木，嫁接无病毒茎尖以培养脱毒苗的技术。
五章植物脱毒技术第8章植物脱毒技术（4学时）目的要求：(1)掌握植物微茎尖培养的脱毒方法；(2)一般掌握无毒苗木的鉴定方法；(3)掌握组织培养脱毒苗在生产上的重要意义；(4)一般掌握脱毒苗木的保存和利用方法病毒在植物上的危害通常危害植物的病毒有几百种，并且随着生产栽培时间的延长，危害程度越来越严重，种类越来越多。
尤其是靠无性繁殖的作物，如利用茎(块茎、球茎、鳞茎、根茎、匍匐茎)，根(块根、宿根)、枝、叶、芽(顶芽、侧芽、球芽、不定芽)等通过嫁接、分株、扦插、压条等途径来进行繁殖的。
像苹果、葡萄、草莓等。
花卉的百合、唐菖蒲、水仙、郁金香、香石竹、菊花等，蔬菜的马铃薯、姜等。
而以种子进行繁殖的种类，除豆类外，其他均可随着世代的交替而去除病毒，即病毒只能危害一个世代。
而在无性繁殖的种类中，由于病毒通过营养体进行传递，在母株内逐代积累，危害日趋严重。
一些园艺植物以小规模集约栽培，造成连作危害问题，并加重土壤传染性病毒的危害。
病毒的危害给植物生产带来的损失是很大的，如草莓病毒的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。
葡萄扇叶病毒使葡萄减产10％～18％，为害马铃薯的病虫害则更多，大约有几十种，因此，给马铃薯生产带来严重障碍。
花卉病毒的危害一般会影响花卉的观赏价值，其表现是花少而小，产生畸形、变色等。
为了提高植物的产量和质量，根除病毒和其他病原菌是非常必要的。
虽然通过防治细菌和真菌的药物处理，可以治愈受细菌和真菌侵染的植物，但现在还没有什么药物可治愈受病毒侵染的植物。
若一个无性系的整个群体都已受到侵染，获得无病毒植株的唯一方法就是消除营养体的病原菌，并由这些组织中再生出完整的植株。
一旦获得了一个不带病原菌的植株，就可在不致受到重新侵染的条件下，对它进行营养繁殖。
用组织培养法消除病毒是唯一行之有效的方法。
由于病毒对植物造成如此严童的危害。
所以世界各国都开始重视这方面的研究，如日本用柑桔茎尖微嫁接繁殖无病毒柑桔营养系。
第8章植物脱毒技术多数农作物，特别是无性繁殖作物，都易受到一种或一种以上病原菌的周身侵染。
病原菌的侵染不一定都会造成植物的死亡，很多病毒甚至可能不表现任何可见症状。
然而，在植物中病毒的存在会减少作物的产量和（或）品质。
虽然通过杀细菌和杀真菌的药物处理，可以治愈受细菌和真菌侵染的植物，但现在还没有什么药物处理可以治愈受病毒侵染的植物。
病毒在植物体内的分布是不均匀的。
在受侵染的植株中，顶端分生组织一般说或者是无毒的，或者是只携有浓度很低的病毒。
在较老的组织中，病毒数量随着与茎尖距离加大而增加。
分生组织所以能逃避病毒的侵染原因是：①在一个植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但在分生组织中不存在维管系统。
病毒在细胞间移动的另一个途径是通过胞间连丝，但它的速度很慢，难以追赶上活跃生长的茎尖；②在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性很高，使病毒无法进行复制；③倘若在植物体内确实存在着“病毒钝化系统”的话，它在分生组织中应比在任何其他区域都有更高的活性，因而分生组织不受侵染；④在茎尖中存在高水平内源生长素，可以抑制病毒的增殖。
§8.1 植物消除病毒的方法一、通过热处理消除病毒（一）基本原理在高于正常的温度下、植物组织中的很多病毒可被部分地或完全地钝化，但很少伤害甚至不伤害寄主组织。
在热处理期间，寄主植物对于病毒在活体中的钝化似乎也起某种作用。
图8.1 植物生长区与热处理区关系图解在热处理中B～C区是个关键；在寄主的热死点（C）和寄生物热死点（B）之间的距离越大，热疗法成功的机会也就越大（二）方法1 热水处理热水处理对休眠芽效果较好。
2 热空气处理热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好，既能消除病毒，又能使寄主植物有较高的存活机会。
热空气处理比较容易进行：把旺盛生长的植物移入到一个热疗室中，在35～40℃下处理一定时间即可；处理时间的长短，可由几分钟到数周不等。
（三）热疗法局限性并非所有的病毒都对热处理敏感，例如在马铃薯中，应用这项技术只能消除卷叶病毒（Leaf roll virus）。
一般来说，对于等径的和线状的病毒，以及对于已知是由类菌质体引起的病害，热处理是有效的。
延长寄主植物的热处理时间，也可能会钝化植物组织中的抗性因子，因而和对照相比会降低处理效果。
此外，在有些植物中，对植株进行较长时间的低温（2～4℃）处理也能消除病毒。
二、通过茎尖培养消除病毒（一）茎尖的概念顶端分生组织（apical meristem, apical dome）是指茎的最幼龄时叶原基上方的一部分，最大直径约为100μm，最大长度约为250μm。
茎尖是由顶端分生组织及其下方的1～3个幼叶原基一起构成的。
无病毒植株都是通过培养100～1000μm长的外植体用茎尖培养的方法得到的。
图8.2 马铃薯茎尖（引自Morel，1972）（二）剥取茎尖的方法1 表面消毒叶片在75%酒精中浸蘸一下；叶片包被松散的芽用0.1%次氯酸钠溶液表面消毒10mim；先把小鳞茎在95%酒精中浸蘸一下，再用灯火烧掉酒精；无菌苗叶片不需消毒。
2 剖取茎尖在剖取茎尖时，要把茎芽置于解剖镜下，一手用一把细镊子将其按住，另一手用解剖针将叶片和叶原基剥掉，解剖针要常常蘸入90％酒精，并用火焰灼烧以进行消毒。
为了在烧过之后重新使用之前有足够的时间冷却，至少应准备三根解剖针轮流使用，或是把针蘸入无菌蒸馏水中进行冷却，当形似一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用一个锋利的长柄刀片将分生组织切下来，上面可以带有叶原基，也可不带，然后再用同一工具将其接种到培养基上。
重要的是必须确保所切下来的茎尖外植体一定不要与芽的较老部分或体视显微镜台或持芽的镊子接触，尤其是当芽未曾进行过表面消毒时更须如此。
图8-3（12-3）（三）在茎尖培养中影响脱毒效果的因素1 培养基通过正确选择培养基，可以显著提高获得完整植株的成功率。
所应考虑的培养基的主要性质是它的营养成分、生长调节物质和物理状态。
碳源一般是用蔗糖或葡萄糖，浓度范围为2％～4％。
含有少量（0.1～0.5mg/L）的生长素或细胞分裂素或二者兼有常常是有利的。
GA3在茎尖培养中的作用，能抑制愈伤组织的形成，有助于更好地生长和分化。
表8-1（12-1）表8-1（12-1）续表2 外植体在最适培养条件下，外植体的大小可以决定茎尖的存活率。
外植体越大，产生再生植株的机会也就越多。
外植体应小到足以能根除病毒，大到足以能发育成一个完整植株。
叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株的能力。
在甘薯中，应选取带有2～3个叶原基的茎尖做外植体。
在马铃薯中，则以带1～2个叶原基的茎尖培养后脱毒效果较好。
表6-2（12-2）表6-3（12-3）3 培养条件（1）光照在茎尖培养中，照光培养的效果通常都比暗培养好。
在多花黑麦草中Dale（1980）观察到，照光（6000lx）培养中的茎尖有59％能再生植株，而暗培养中的只有34％。
在马铃薯中建立茎尖培养物的最适光照强度是100lx，但4周后应增加到200lx。
当茎已长到1cm高时，光照强度还应进一步增加到4000lx。
在进行天竺葵茎尖培养的时候，需要有一个完全黑暗的时期，这可能有助于充分减少多酚物质的抑制作用。
（2）温度关于在离体茎尖培养中温度对植株再生的效应，现在还没有什么资料，培养物通常都是放在标准的培养室（25℃±2℃）。
4 外植体的生理状态（1）芽的类型茎尖最好要由活跃生长的芽上切取，培养顶芽茎尖比培养腋芽茎尖效果好。
（2）取芽时间在植株生长季节取芽。
5 热疗法和冷疗法（1）热疗法处理在切取茎尖之前在母株上进行，也可在茎尖培养期间进行。
例如：在草莓中，36℃处理6周。
（2）冷疗法用低温处理脱毒的方法叫冷疗法。
例如：菊花植株在5℃下经过4个月冷处理后进行茎尖培养。
6 化学疗法在培养基中加入某些化学试剂，可能抑制植物组织和原生质体中的病毒。
例如三氮唑核苷能有效消除马铃薯叶肉原生质体再生植株中的PVX病毒。
（四）通过茎尖培养消除病毒的注意事项要想得到和繁殖一个品种的脱毒植株，首先必须了解有关该种植物的一些背景知识，特别是可能周身侵染该种植物的病原菌以及这种植物的繁殖方法等。
然后应当检查实验植物是否携带所疑有的病原菌，并确定茎尖外植体的适当大小，能导致生长最快和最有可能消除病毒的培养条件。
最后要反复检查茎尖产生的植株是否还带着疑有的病原菌，并在能杜绝任何再侵染可能性的条件下，繁殖那些确已脱毒植株。
三、消除病毒的其他离体培养方法（一）愈伤组织培养脱毒在由受感染的组织形成的愈伤组织中，并非所有的细胞都均匀一致地带有该种病原菌。
在用机械方法由受TMV 侵染的烟草愈伤组织分离出来的单个细胞中只有40%带有这种病毒。
在受病毒全面侵染的愈伤组织中，某些细胞所以不带病毒可能是由于：①病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度；②有些细胞通过突变获得了抗病毒的特性。
抗病毒侵染的细胞甚至可能与敏感型细胞一起存在于母体组织中。
（二）微型嫁接脱毒用作微型嫁接的砧木通常是试管内培育的无菌实生苗，接穗则是由成年无病毒植株的枝条上采集的茎尖，或者由经过热处理的植株上采集的茎尖，以及脱毒试管苗的茎尖等。
获得脱毒柑橘的完整试管苗，在杏、桃等果树、葡萄、桉树和山茶等植物中脱毒也有效。
（三）花药培养脱毒由花药培养可以产生脱毒植株，广泛用于草莓无毒苗的生产。
（四）珠心胚培养脱毒柑橘类植物中有不少多胚品种，一颗种子内除一个合子胚外，还有数个至数十个由珠心细胞形成的无性胚，称做珠心胚。
珠心胚有3个特征：①它与合子胚不同，不是受精的产物，而是由体细胞产生的，因此具有和母体相同的遗传组成；②与合子胚一样，在珠心胚和植株之间无维管组织连系，因此即使母体植株感染了病毒，珠心胚也是无毒的；③在自然条件下，珠心胚一般都不能发育成熟，只有适时从种子中剥离出来，接种在人工培养基上，珠心胚才能长成植株，而这些植株应当是不带病毒的母体无性系。
四、病毒以外病原菌的离体消除方法迄今为止，茎尖培养和愈伤组织培养主要用于消除病毒，但有些证据表明，也可通过培养消除其他病原菌如类菌质体、细菌和真菌。
Jacoli（1978）指出，胡萝卜外植体经过反复转管后，其中侵染的星黄菌（类菌质体状小体）逐渐退化并在80d内消失。
培养的植物组织内带有的细菌和真菌，由于在培养基上增殖很快，在一般情况下很容易表现出来。
通过茎尖培养已经在花叶万年青和天竺葵中消除了这类周身侵染的细菌。
§8.2 脱毒效果的检测与无毒原种的保存一、脱毒效果的检测（一）直观检测法（二）指示植物检测法（三）抗血清检测法（四）酶联免疫吸附法（五）电子显微镜检测法指示植物检测法指示植物又称鉴别寄主，指对某种或某些特定病毒非常敏感，而且症状表现十分明显的植物。
1 汁液感染法2 嫁接检测法二、无毒原种的保存无毒植株并不具有额外的抗病性，它们有可能很快又被重新感染。
为了解决这个问题，应将无毒原种种在温室或防虫罩内灭过菌的土壤中。
在大规模繁殖这些植物的时候，应把它们种在田间的隔离区内，其中应很少有或完全没有重新感染的机会。
另外一种更容易也是更便宜的方法，是把由茎尖得到的并已经过脱毒检验的植物通过离体培养进行繁殖和保存。
虽然由茎尖培养得到的植株一般很少或没有遗传变异，但最好还是要检查一下这些脱毒植株是否仍保持了原来的种性。
据报道，在苹果和大黄中，经过脱毒之后曾出现了轻微的生理变异。
§8.3 脱毒植株的应用在研究特定病毒对寄主植物的影响时，无毒植株是非常有用的实验材料。
更重要的是，主要是通过茎尖培养所得到的无毒植株的发育情况表明，很多病毒能在寄主植物中造成生活力、品质和产量的严重损失。
通过把已知病毒引入无毒植株，并比较同一个无性系的感病株和无毒株的表现，可以对病毒造成的产量损失做出更精确的估计。
通过茎尖培养的方法，Stone（1973）由一个品种的水仙中获得了一个无阿拉伯花叶病毒和水仙退化病毒的无性系。
这种无毒鳞茎比普通原种长得快，生活力强，比受侵染的植株花大，颜色丰富，每个茎的花多。
大黄脱毒后叶柄产量增加了60%～90%。
天竺葵的很多品种带有不表现症状的病毒。
据报道，由其茎尖培养产生的植株比未受过处理的植株生活力强，产生插条的数目多20%～30%，而且这些插条很容易生根。
图6-5（12-5）本章小结掌握茎尖脱毒技术的基本概念与方法，了解其他脱毒方法，以及脱毒效果的检测方法。
