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实时聚合酶链式反应（Real-time PCR）是一种分子生物学技术，用于定量测量DNA或RNA的含量。
它可以用于检测、量化和分析特定基因的表达水平，也可以用于检测病原体、基因突变和许多其他应用。
下面是实时PCR的基本原理：1. **选择性扩增目标DNA/RNA**：实时PCR的第一步是选择性扩增目标DNA或RNA片段。
这通常涉及到设计一对特异性引物（引导片段）来诱导DNA合成。
引物是两个短的DNA片段，它们会结合到目标序列的两端。
2. **荧光探针**：为了实时检测PCR反应的进展，一种叫做荧光探针的特殊DNA分子被引入反应混合物中。
荧光探针是一个含有荧光染料的短链DNA片段，它的一端与一个荧光染料分子紧密相连，另一端与一个荧光阻尼器分子相连。
在初始PCR反应中，这两个分子紧密靠在一起，从而抑制了荧光的发射。
3. **PCR反应**：PCR反应开始后，DNA引物将目标序列进行扩增。
如果目标序列存在，PCR会不断复制它，导致DNA量指数级增加。
4. **荧光信号检测**：在每个PCR循环的末尾，荧光探针靠近的情况会改变。
当PCR过程中荧光探针结合到目标序列时，它被降解，荧光染料与阻尼器分离，导致荧光信号的释放。
荧光信号的强度与PCR反应中目标序列的数量成正比。
5. **实时监测**：荧光信号会在PCR过程中实时检测和记录。
这种监测可以通过特殊的仪器完成，该仪器测量荧光信号的强度并将其显示在一个图表中。
荧光信号的强度与PCR反应中目标序列的初始数量成比例。
因此，通过比较样本中的荧光信号与标准曲线或对照样本，可以定量测量目标DNA或RNA的含量。
总的来说，实时PCR允许科学家在PCR反应进行的同时实时监测和记录DNA或RNA的数量，因此它是一种非常有用的技术，用于定量和检测基因表达、基因变异、病原体等多种生物学研究和诊断应用中。
Real-time qPCR 检测操作手册1/ 6一、实验概述Real-time Quantitative PCR Detecting System ，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR 。
是一种在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法，实现了PCR 从定性到定量的飞跃。
二、实验流程三、实验材料： 1.主要试剂试剂名称 试剂来源 Cat.No. Trizol 上海普飞 3101-100 M-MLV promega M1705 dNTPs promega U1240 oligo dT 上海生工 B0205 Bulge-LoopTM miRNA广州锐博 详见实验报告 qPCR Primer Set Rnase Inhibitor promega N2115 Primer(R&F) 上海生工 详见实验报告 SYBR Master MixtureTAKARADRR041B2/ 6样本收集Trizol 法抽取RNARNA 反转录获取cDNAReal-time qPCR2.主要器材器材名称来源Cat.NoNanodrop 分光光度计Thermo 2000/2000C稳压电泳仪上海天能EPS-600超细匀浆机FLUKO公司F6/10Real time PCR 仪器Agilent公司MX3000p反转录耗材Axygen四、实验步骤：1.总RNA 抽提（1）收取样品，Trizol 裂解。
细胞样品：收集细胞（6 孔板 80%细胞密度），2000 rpm 离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mL Trizol，充分混匀后室温静置 5 min，然后转移至新的 1.5 mL EP 管中；组织样品：将待研磨的组织样品从液氮或者-80℃冰箱中取出，无菌刀片于干冰上将组织样品切割成约 3 mm×3 mm×3 mm 大小，置于装有 1 mL Trizol 裂解液的 1.5mL EP 管中。
Real-time PCR 原理介绍一.实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1.Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念—— Ct值。
C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。
图1. Ct值的确定2.荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´ SDcycle 6-153.Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct 值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct 值（如图2所示）。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
图2. 荧光定量标准曲线4.荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料〔2〕。
现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
如图3所示。
图3. TaqMan 荧光探针工作原理2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
real-time pcr---杂交探针4．杂交探针：是⼀种新型的荧光探针，由两条探针组成，⼀条在 5’端标记荧光（3’端被封闭，以防⽌退⽕后的延伸），⼀条在3’端标记荧光，其中⼀个为受体荧光基团，另⼀个为供体荧光基团，供体荧光基团的发射光谱覆盖受体荧光基团的激发光谱，⾃由状态时只能检测到供体荧光基团发出的荧光。
退⽕时两条探针与⽬的基因特异性结合，形成⾸尾连接，两个荧光基团互相靠近，供体基团发出的能量激发受体基团发出荧光，检测时只检测受体基团发出的荧光。
只有当两条探针均与⽬的基因特异性结合时，才能检测到受体基团发出的荧光，因此检测的特异性⼤⼤增加。
⼆：杂交探针法FRET技术原理：罗⽒专利的FRET探针⼜称为双杂交探针，或者LightCycle探针。
FRET探针由两条和模版互补、且相邻的特异探针组成（距离1—5bp），上游探针的3`端标记供体荧光基团，相邻下游探针的5`端标记Red 640受体荧光基团。
当复性时，两探针同时结合在模板上，供体基团和Red640受体基团紧密相邻（距离1—5bp），激发供体产⽣的荧光能量被Red640基团吸收，使得检测探头可以检测到Red640发出波长为640的荧光。
当变性时，两探针游离，两基团距离远，不能检测到640波长的荧光。
FRET探针检测的信号是退⽕时的实时信号，每次检测信号始终严格对应模版的数量，⾮累积信号，可以⽤于做Tm曲线和SNP检测。
常⽤的受体荧光基团除了LC-Red640还有LC-Red705。
两个单标记探针的长短不影响信号的传递，⽽探针间的距离通常为1-5bp（虽然越短越好，还是要留点空间避免相互之间的反应）。
我们前⾯提到，Taqman⽔解探针法中，⼀但报告基团⽔解离开淬灭基团，就⼀直游离于反应体系中可被检测，所以检测的是累积荧光，是不可逆的。
杂交探针不同，是复性时两条特异探针杂交到模板上，相互靠近⽽产⽣检测信号，到升温变性探针远离模版就没有信号，所以检测的是实时信号，是可逆的，所以可以进⾏熔解曲线的分析，还可以⽤于进⾏突变分析，SNP基因分型以及产物鉴别。
real-time pcr名词解释
外文名【Real-time Quantitative polymerase chain reaction】
中文名【实时荧光定量多聚核苷酸链式反应】
中文简称【实时荧光定量PCR】
外文简称【RT PCR】
【实时荧光定量PCR技术】，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。
通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
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Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
【技术原理】
将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman 探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
实时定量PCR完全手册方法简介所谓的实时荧光定量 PCR 就是通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
RT-qPCR是由三个步骤组成:1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;2.扩增:用PCR的方法扩增cDNA;3.检测:实时检测和定量扩增的产物.RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint):1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。
对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。
存在的问题由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞3.总RNA或者mRNA4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略5.不同的酶以及酶的不同组合6.变异系数、灵敏度7.多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。
8.每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。
RNA 质量评价现在RNA 定量的程序很多。
最近EMBO qPCR course(http://www-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_28) 比较了用Ribogreen, Agilent BioAnalyser, spectrophotometer,Nanodrop and the BioRad Experion 来定量同样的样品。
实时PCR实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。
real time PCR 的定量使用荧光色素，目前有二种方法。
一种是在ds DNA中插入特异的荧光色素，例如SYBR Green荧光染料；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针（probe），如Taqman 探针。
、两种方法原理不同。
SYBR Green荧光染料游离时不发光，当反应体系中存在双链DNA时，SYBR Green与双链DNA结合，此时才发光。
Taqman探针带有一个荧光基团和一个淬灭基团，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端。
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，此时荧光基团发出的荧光信号可以被检测到。
real time PCR 与 reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”反应体系oligo: 多聚体，相当于mRNA引物AMV RT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶dNTPs：脱氧核苷酸RNase：RNA酶抑制剂PCR Buffer：RT-PCR缓冲液MgCl2：2价镁离注意事项：绝对定量：几种可能：1. 你的cDNA浓度是不是通过紫外分光测定的？紫外的干扰因素很多，只能作为浓度参考，也就是可能会导致你的内参Ct有差异，正常现象。
2. 反转录的效率，如果你的内参扩增产物在靠近mRNA的3'端影响不大，如果在里面或者5'端，Ct值存在差异正常。
real time pcrReal-time PCRReal-time PCR，即实时荧光定量PCR（qPCR），是一种强大的分子技术，能够在实时状态下监测和测量DNA的扩增。
该技术通过对传统PCR的改进，实现了对特定DNA序列的高精度、高灵敏度和快速检测与定量。
Real-time PCR的核心特征实时监测Real-time PCR在每次扩增循环后测量PCR产物的积累，从而能够在反应的对数增长阶段进行量化。
这种实时监测的特性使得该技术能够准确反映DNA 扩增的动态过程。
通过实时监测，研究人员可以在反应进行过程中观察到DNA 扩增的每一个阶段，而不必等到反应结束后再进行分析。
这种特性不仅提高了实验的效率，还减少了由于后续处理步骤可能引入的误差。
此外，实时监测还允许研究人员在反应过程中进行调整，以优化实验条件，提高结果的准确性。
量化能力该技术提供了一种可靠的量化关系，即初始目标DNA序列的数量与产生的扩增子（amplicon）数量之间的关系。
这种量化能力使得Real-time PCR在需要精确测量DNA或RNA数量的应用中具有显著优势。
通过标准曲线法或绝对定量法，研究人员可以准确地计算出样本中目标序列的初始拷贝数。
这对于需要精确定量的实验，如基因表达分析、病毒载量测定等，具有重要意义。
量化能力的提高也使得Real-time PCR在药物开发、临床诊断等领域得到了广泛应用。
高灵敏度Real-time PCR具有极高的灵敏度，能够检测到极少量的目标DNA。
这种高灵敏度特性使得该技术在病原体检测、基因突变分析等需要高灵敏度的场景中尤为重要。
通过使用特异性探针和优化的反应条件，Real-time PCR可以检测到低至单拷贝水平的目标序列。
这对于早期疾病诊断、微量样本分析等应用至关重要。
高灵敏度的检测能力还使得Real-time PCR在环境监测、食品安全检测等领域得到了广泛应用。
多功能性Real-time PCR不仅可用于定性分析（即检测目标DNA或RNA的存在与否），还可用于定量分析（即测量目标DNA或RNA的拷贝数）。
