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什么是免疫组化免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。
（一）免疫组织化学技术的基本原理免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。
即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫学的基本原理决定了免疫组织化学技术具有高度特异性，因此，免疫组织化学技术从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。
只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，所以免疫组织化学技术又具有敏感性高的特点。
免疫组化免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本：实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法抗原修复——原因：常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：-抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；-蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
*要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
进行抗原暴露和修复的原则：1、寻找抗体说明的有关信息2、如无信息可先不经处理做免疫组化3、如染色结果呈阴性或阳性结果不理想，可用酶消化4、如还不理想用高温办法处理5、如再不理想可用酶和高温相结合处理6、如仍然是阴性结果，可能该抗体质量有问题。
常用的抗原修复方法：微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法1．柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法（1）适用范围：适用于大量中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，其效果优于微波修复法和直接煮沸修复法。
（2）仪器设备：普通家用压力锅、电炉、不锈钢或耐高温塑料切片架。
（3）试剂：0.01M 柠檬酸型缓冲液，pH6.0。
（3）操作步骤：①常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化至水，待用；②取一定量0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0（800～1000ml）于压力锅中，加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，开始计时1－2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温（稍冷后，可在自来水龙头下加速冷却），取出切片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS（pH7.2－7.4）冲洗两次，每次3分钟。
免疫组化是一种强大的实验室技术，它利用抗原-抗体反应来检测和定位细胞中的特定蛋白质。
这种技术的核心是抗体的高度特异性，即每种抗体只能识别并结合到一种特定的抗原。
在病理诊断中，免疫组化被广泛应用于疾病的诊断和研究。
对于医生和研究人员来说，了解和掌握免疫组化技术是非常重要的。
免疫组化的基本原理免疫组化的基本原理是抗原-抗体反应，这是一种特异性极高的生物反应。
在免疫组化实验中，首先将特定的抗体引入到组织切片中。
如果切片中存在对应的抗原，那么抗体就会与其结合，形成抗原-抗体复合物。
然后，通过标记的方法，我们可以在显微镜下看到这些抗体-抗原复合物。
这种标记通常是一个可以发出信号的分子，如荧光分子或酶。
当我们在显微镜下观察切片时，这些标记会发出可见的信号，如光或颜色，从而使我们能够看到抗体-抗原复合物的位置。
通过计算这些信号的数量，还可以估计出特定蛋白质在细胞中的数量。
因此，免疫组化不仅可以帮助确定特定蛋白质的位置，还可以提供该蛋白质在细胞中相对丰度的信息，这对于理解疾病的发生和发展具有重要意义。
免疫组化在病理诊断中的应用免疫组化在病理诊断中的应用非常广泛。
在肿瘤诊断中，免疫组化可以帮助确定肿瘤的类型和来源。
例如，通过检测肿瘤细胞中的特定蛋白质，可以区分不同类型的肿瘤，如乳腺癌和肺癌。
此外，免疫组化还可以帮助预测肿瘤的行为，如其侵袭性和转移潜力。
在炎症性疾病的诊断中，免疫组化可以帮助识别炎症细胞的类型，从而确定炎症的性质。
例如，通过检测特定的白细胞抗原，可以区分不同类型的炎症，如细菌性炎症和病毒性炎症。
此外，免疫组化也被用于传染病的诊断。
通过检测特定的病毒抗原，可以诊断是否有病毒感染，如艾滋病毒和乙肝病毒。
这对于早期发现和治疗传染病具有重要意义。
免疫组化的优点和局限性免疫组化的优点在于其高度的特异性和灵敏性。
由于抗体与抗原之间的结合是高度特异性的，因此免疫组化可以在单个细胞水平上检测特定蛋白质，这对于疾病的诊断和研究具有重要意义。
组织化学与免疫组织化学课程介绍组织化学概述♦在形态学基础上应用化学、物理和免疫学方法研究细胞、组织中物质的化学组成、分布和含量的一门学科组织化学概念♦用已知化学反应为主的染色方法，在细胞、组织的原位上显示各种物质的特殊性♦探讨生理、病理和药物作用引起组织结构、化学成分和功能改建之规律，进一步使功能、形态和代谢紧密结合组织化学的发展与展望♦1830-1870⏹生理组织化学（physiologist histochemistry )♦1890-1920⏹显微组织化学（microscopic histochemistry )组织化学的发展与展望♦近年⏹酶的组织化学（enzyme histochemistry )⏹电镜组织化学（electron-microscopic histochemistry )⏹定量组织化学●显微分光光度计●流式细胞仪●真彩色图像分析仪⏹免疫组织化学（immunohistochemistry)⏹杂交组织化学（hybridohistochemistry)●原位分子杂交（in situ hybridization,ISH)⏹原位PCR（polymerase chain reaction) 技术(聚合酶原位扩增技术)组织化学研究的内容♦蛋白质生物胺♦核酸特异性抗原♦糖类无机盐♦脂类微量元素♦酶类组织化学技术的基本要求♦保持组织细胞良好形态结构♦高度特异性♦高度灵敏性♦反应产物定位精确、具稳定性♦与周围对比鲜明，易于识别♦方法简便、化时少、重复性好组织化学技术的注意事项♦严格控制反应物浓度、试剂ＰＨ值、反应温度和反应时间♦试剂选择－分析纯（A.R）♦反应产物－有色沉着物、不溶性♦试验器皿、蒸馏水组织化学显示方法的种类♦化学显色法⏹金属沉淀法磷酸酶CoS（碱性磷酸酶）或PbS（酸性磷酸酶）●磷酸底物—→反应产物——→沉淀物（显示酶性）⏹偶氮偶联法磷酸酶偶氮偶联●萘酚族化合物—>分解产物＋重氮盐——→不溶性偶氮色素组织化学显示方法的种类♦化学显色法⏹Schiff氏反应●显示多糖（PAS反应）●显示DNA（Feulgen反应）细胞中的醛基●Schiff试剂中无色品红————————→绛红色⏹联苯胺反应●过氧化物酶检测●无色联苯胺——————→联苯胺蓝—→棕色联苯胺●过氧化物酶组织化学显示方法的种类♦化学显色法⏹普鲁士蓝反应●显示含铁血黄素●Fe++++ 酸性亚铁氰化钾————→普鲁士蓝反应⏹甲月替反应●脱氢酶将底物脱氢，将四唑盐（无色）还原为双甲月替（蓝色）组织化学显示方法的种类♦类化学反应⏹Best卡红（洋红）———显示糖原♦物理方法⏹脂溶染色法⏹荧光分析法⏹放射自显影术♦免疫学方法对组织化学方法的评价♦优点⏹能测组织中微量物质⏹取材小、反应较灵敏♦缺点⏹测定步骤较多、试剂昂贵⏹影响因素多组织化学方法的应用♦寻找病原微生物♦帮助诊断和鉴别诊断♦研究探讨发病机制♦研究药物作用后的代谢改变等♦为临床治疗提供治疗方案选择细胞和组织标本制备制片程序示意标本取材组织固定固定后处理石蜡切片法冰冻切片法脱水制成冻块透明冷冻切片浸蜡贴片包埋醇固定水洗切片染色粘片贴片脱水脱蜡封片透明各级酒精封片水洗常规染色组化染色脱水透明封片标本取材♦细胞标本⏹方法●印片法●穿刺涂片法●体液沉淀涂片法●活细胞培养标本⏹注意事项●涂片用载玻片应先涂粘附剂●涂片时细胞应分布均匀、或用细胞离心涂片器（cytospin) 标本取材♦组织标本⏹方法用切取、钳取、穿刺等方法●活体标本♦取自宫颈、鼻咽、喉、皮块活检组织♦内窥镜钳取组织♦肝、肾等穿刺组织●手术切取标本♦病灶区组织♦病灶与正常交界区组织♦远距离正常组织标本取材♦组织标本●动物模型标本♦麻醉后取材▪用乙醚或氯仿棉球▪４％戊巴比妥静脉注射▪２０％氨基甲酸乙酯腹腔注射♦处死后取材▪空气栓塞法▪断头法▪颈椎脱臼法▪眼球放血法标本取材♦组织标本⏹注意事项●材料新鲜、固定及时●防止挤压●注意组织大小及厚度（宜小而薄）●正确选择取材切面及部位●去除坏死物、血污、粘液等物质●防止组织干燥●标本编号、分瓶存放、低温保存固定（Fixation)♦固定和固定剂⏹标本＋特定试剂→以保持组织原形态结构，该过程为固定，试剂为固定剂♦固定的目的⏹防止组织自溶和腐败⏹使组织某些成分凝固或沉淀、变成不溶性物质，避免弥散，保持原有生活时形态⏹使组织硬化⏹有利于染色反应固定（Fixation)♦优点⏹保存形态结构⏹长期保存♦缺点⏹物质损失⏹组织皱缩⏹影响常规染色固定（Fixation）♦常用固定方法⏹浸泡固定●组织大小、固定液量、温度、时间⏹蒸汽固定●甲醛、付甲醛、锇酸、戊二醛⏹灌注固定●局部●全身⏹微波固定固定（Fixation）♦注意事项⏹固定液量⏹组织块厚度⏹固定时间⏹固定温度⏹加热固定剂的特性和作用♦具相当穿透力♦具媒染效果♦固定剂与蛋白质间化学反应，改变分子结构，产生沉淀♦使蛋白质变性成沉淀状态♦使蛋白质凝胶化、不溶于水常用固定剂（单一或混合）♦甲醛（福尔马林）⏹市售浓度：４０％水溶液⏹固定用浓度：１０％福尔马林溶液（实际浓度４％）⏹常用●１０％福尔马林溶液（40％甲醛10ml＋蒸馏水90ml)●10%中性缓冲福尔马林溶液（40％甲醛10ml＋0.01mol/L PH7.4,PBS90ml) ♦组化常用●10甲醛盐溶液（40%甲醛10ml＋生理盐水90ml）♦改善渗透压常用固定剂（单一或混合）♦甲醛（福尔马林）⏹优点●渗透力强、收缩小●保存脂类和类脂体●价廉⏹缺点●福尔马林色素形成●PH酸性影响胞核着色●抗原决定簇被掩盖常用固定剂（单一或混合）♦4%多聚甲醛～0.1mol/L磷酸缓冲液（PH7.3）组成⏹多聚甲醛40gm＋0.1mol/L PBS 1000ml⏹组化和免疫组化灌注固定♦丙酮⏹渗透力强，对核固定不佳⏹常用于磷酸酶固定⏹冷丙酮—12-24h冰箱内，小块组织１－２小时常用固定剂（单一或混合）♦乙醇⏹很少单独使用，可用于血片、涂片⏹有固定兼硬化作用，适用于糖原固定⏹高浓度可使组织变脆，50%以上浓度溶解脂类常用固定剂（单一或混合）♦Carnoy液⏹组成●无水酒精60ml+氯仿30ml+冰醋酸10ml●使用时预冷４℃⏹适用●保存糖原、DNA、RNA⏹优点●穿透力强，快速固定⏹缺点●破坏红细胞⏹固定时间●小组织<3-6h（４℃）常用固定剂（单一或混合）♦Bouin’s液⏹组成●苦味酸饱和水溶液75ml,40%甲醛水溶液25ml,冰醋酸5ml⏹优点●穿透力强，对结缔组织及胞核着色好⏹缺点●易变脆、损害抗原、毒性⏹时间●１２－２４小时常用固定剂（单一或混合）♦2.5%戊二醛／0.1mol/L磷酸缓冲液或0.1mol/L二甲砷酸缓冲液♦25% 1ml+0.1mol/L9ml♦用于：电镜组化固定剂的选择♦多糖—苦味酸、醋酸和酒精使糖原沉淀⏹糖原●冷饱和苦味酸的纯酒精液＋甲醛（９：１）●冷Carnoy液—－７０℃下固定防止糖原极化●冰冻干燥法或恒冷箱切片后固定，无极化⏹粘液物质●易溶于水●弱醋酸和酒精使它沉淀●Carnoy液对粘液和酸性粘液物保存佳固定剂的选择♦脂类—除含有脂溶剂的不能用于固定外，其他固定剂均可⏹甲醛及甲醛钙（Fca)溶液●钙离子可防止脂类扩散入固定液，使脂类与蛋白质形成络合凝聚层固定剂的选择♦核蛋白及核酸－用醋酸或三氯醋酸（TCA）沉淀核蛋白⏹Carnoy液固定（但固定时间勿过长）♦酶－最好冷冻切片⏹丙酮－作酶固定剂⏹中性甲醛－低温固定、低温冲洗⏹戊二醛－保存微细结构及酶活性⏹醛固定剂中加入适量二甲基亚砜（DMSO)，使渗透性增加组织切片的制备♦石蜡切片（Paraffin Section)⏹主要步骤●取材、固定●洗涤－流水充分冲洗，除去组织内的固定剂●脱水－浓度逐渐升高的梯度酒精脱去组织内水分●透明－组织块经２－３次二甲苯液浸洗可使组织透明●浸蜡－组织经２－３次熔化的石蜡中浸泡，使石蜡透入组织●包埋－将组织块包埋于石蜡中，制成蜡块●切片－将蜡块置于石蜡切片机上切片，厚度４－６um左右，切片贴片后可在３７℃过夜烘干—>染色，或４℃保存备用●染色、封片组织切片的制备♦石蜡切片（Paraffin Section)⏹优点●保存良好形态结构●蜡块长期保存●连续切片⏹缺点●影响组织抗原性⏹注意事项●取材与固定●脱水、透明、浸蜡组织切片的制备♦冷冻切片（Frozen Section)⏹组织在冷冻状态下直接切片⏹冷冻切片流程●组织制成冻块－> 冷冻切片—>切片后处理—>染色●冻块制备♦低温、速冻，减少冰结晶♦方式▪组织入液氮（－196 ℃)▪干冰倒入丙酮（异戊烷）▪CO2汽雾直接喷于组织♦OCT包埋剂（optimal cutting temperature)♦组织冻块可储存于－70 ℃组织切片的制备♦冷冻切片（Frozen Section)⏹注意事项●防止冰晶形成●防止组织块失水●加温速融组织切片的制备♦冷冻切片（Frozen Section)●切片♦冷冻切片机▪开放式▪恒冷箱式♦切片厚▪6-15u(10-15u)▪2-4u♦切片条件▪冷室温度-25 ℃～-30 ℃组织切片的制备♦冷冻切片（Frozen Section)●切片后处理♦贴片—>自然干燥（１～２小时）—>冷丙酮或醋酸、乙醇固定１０分钟—>待干—>染色（或封存于-20 ℃) 组织切片的制备♦冷冻切片（Frozen Section)⏹冷冻切片优点●快速、简便●保存抗原性和酶活性⏹冷冻切片缺点●易形成冰晶●需特定仪器设备●组织结构不清晰●不能长期贮存组织切片的制备要点组织化学组化概念组织化学技术的基本要求对组织化学的评价细胞和组织标本制备♦细胞或组织标本取材的方法和注意事项 ♦固定的概念、目的以及优缺点♦常用的固定方法及注意事项♦固定剂的特性和作用♦常用的几种固定剂的优缺点♦石蜡切片和冰冻切片制备时注意事项及其优缺点♦H 3PO 4+Ca(NO 3)2-->Ca 3(PO 4)2 + HNO 3♦Ca 3(PO 4)2+Co(NO 3)2-->Co 3(PO 4)2 +Ca(NO 3)2♦Co 3(PO 4)2+(NH 4)2S ---> CoS +(NH 4)3PO 4 (黑色沉淀)。
