化学发光免疫分析中的标记物质及类型
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血检四项化学发光法调查目前血检四项(HBsAg、HCV、HIV、TP)的检测方法主要有酶联免疫(ELISA)、核酸扩增(PCR)、胶体金标记、以及化学发光(CLIA)。
现就CLIA在血检项目中的应用情况做一调查分析。
一.化学发光免疫分析法简介。
化学发光免疫分析法(Chemiluminescence imnunoassay,CLIA)是建立在放射免疫分析技术(radioimmunoassay,RIA)理论的基础上,以标记发光剂为示踪物信号建立起来的一种非放射标记免疫分析法。
CLIA是利用化学反应中释放大量自由能,产生激发态中间体,当其回到稳定的基态时发射出光子(hν),用发光信号测量仪对所发出的光量子进行定量测量。
鲁米诺(1umino1)、异鲁米诺(isolumino1)及其衍生物、吖啶酯(acIidinim ester)衍生物、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是目前CLIA中使用最多的四类标记物。
表1 化学发光法类型注:* 严格意义上属于荧光免疫。
二.国内外化学发光法的仪器和试剂情况。
国外化学发光法检测仪器的生产厂家以贝克曼、雅培、罗氏、拜耳这四家的市场占有率较高。
其中罗氏拥有唯一的电化学发光技术,雅培则独占微粒子酶联免疫(EMIA)。
不同厂家的仪器有各自的优势检测项目,主流的仪器型号如下:表2 国外主要化学发光免疫分析仪厂家国内也逐渐有厂家研制化学发光试剂,配合国外引进的仪器(多为半自动)共同销售,也有自发研制的化学发光仪(泰格科信)。
针对血检四项(HBsAg、HCV、HIV、TP),除北京科美生物(科美东雅)外,所有厂家试剂均只有HBsAg试剂。
表3 国内主要厂家仪器和试剂情况国外厂家的试剂大多随仪器配送,并没有在SFDA单独注册。
目前SFDA注册的血检四项化学发光法试剂列表如下。
就检测项目来看,除梅毒外,其余三项均可使用化学发光法;就现有资料,国内外只有北京科美东雅配有梅毒检测试剂。
化学发光免疫标记分析技术基本原理化学发光免疫标记分析技术主要包括两个步骤:标记物制备和检测过程。
在标记物制备阶段,通常使用特定的荧光染料或荧光标记物来与待检测物质进行反应,并形成稳定的标记物-待检测物质复合物。
而在检测过程中,通过光学系统激发和采集标记物产生的化学发光信号,从而获得待检测物质的信息。
1.标记物制备:在化学发光免疫标记分析技术中,常用的标记物包括酶标记物和荧光标记物。
酶标记物的原理是将特定酶与待检测物质结合,并通过酶反应产生化学发光信号。
例如,常用的酶标记物有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)等。
而荧光标记物的原理则是将特定荧光染料或荧光物质与待检测物质发生物理或化学反应,从而产生荧光信号。
荧光标记物具有高灵敏度、高分辨率和多颜色检测等优点。
2.检测过程:在化学发光免疫标记分析技术中,通常采用放射性同位素或者化学合成的光感受物质作为化学发光底物。
这些光感受物质在一定条件下与酶标记物或荧光标记物发生反应,产生化学发光信号。
这种化学发光反应通常是一种酶催化反应,通过酶的催化作用将底物转化为高能态的中间产物,进而使中间产物与发光底物反应产生化学发光。
1.样品制备:将待检测的样品进行适当处理和净化,以去除干扰物并保留待测物质。
2.标记物制备:选择适当的酶标记物或荧光标记物,并将其与待检测物质结合,形成稳定的复合物。
3.反应过程:将标记物与样品中的待测物质进行反应,形成标记物-待检测物质复合物。
4.分离与清洁:根据实验需求,通过特定的分离技术分离出标记物-待检测物质复合物,并清洁除去未结合的杂质。
5.光学系统激发和采集信号:将分离出的标记物-待检测物质复合物放置于化学发光仪或荧光显微镜等设备中,通过特定的光源激发标记物产生的化学发光或荧光信号,并通过相应的光学系统采集和记录信号。
6.数据分析和结果解读:通过对采集得到的化学发光或荧光信号进行数据处理和分析,根据标定曲线或标准样品,计算出待检测物质的含量或其它相关信息,并根据实验目的对结果进行解读。
化学发光免疫分析的类型介绍更新:2012-05-16 12:26:51 | 来源:标签:化学发光反应参与的免疫测定分为以下几种类型:(一)化学发光酶免疫测定化学发光酶免疫测定(CLEIA)是采用化学发光剂作为酶反应底物的酶标记免疫测定。
经过酶和发光两级放大,具有很高的灵敏度。
以过氧化物酶为标记酶、以鲁米诺为发光底物、并加入发光增强剂以提高敏感度和发光稳定性。
应用的标记酶也可以为碱性磷酸酶,发光底物为dioxetane磷酸酯,固相载体为磁性微粒医学教|育网搜集整理。
(二)化学发光免疫测定化学发光免疫测定(CLIA),是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的一类免疫测定方法。
吖啶酯是较为理想的发光底物,在碱性环境中即可被过氧化氢氧化而发光。
用作标记的化学发光剂应符合以下几个条件:1.能参与化学发光反应。
2.与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物试剂。
3.偶联后仍保留高的量子效应和反应动力。
4.应不改变或极少改变被标记物的理化特性,特别是免疫活性。
鲁米诺类和吖啶酯类发光剂等均是常用的标记发光剂。
(三)微粒子化学发光免疫分析该免疫分析技术有两种方法:一是小分子抗原物质的测定采用竞争法;二是大分子的抗原物质测定采用双抗体夹心法。
该仪器所用固相磁粉颗粒极微小,其直径仅1.0μm,这样大大增加了包被表面积,增加抗原或抗体的吸附量,使反应速度加快,也使清洗和分离更简便。
其反应基本过程:(1)竞争反应:用过量包被磁颗粒的抗体,与待测的抗原和定量的标记吖啶酯抗原同时加入反应杯温育,其免疫反应的结合形式有两种,一是标记抗原与抗体结合成复合物;二是测定抗原与抗体的结合形式。
(2)双抗体夹心法:标记抗体与被测抗原同时与包被抗体结合成一种反应形式,即包被抗体-测定抗原-发光抗体的复合物。
(四)电化学发光免疫测定电化学发光免疫测定(ECLI)是一种在电极表面由电化学引发的特异性发光反应,包括电化学和化学发光两个部分。
分析中应用的标记物为电化学发光的底物三联吡啶钌或其衍生N-羟基琥珀酰胺(NHS)酯,可通过化学反应与抗体或不同化学结构抗原分子结合,制成标记的抗体或抗原。
免疫发光试剂作用原理
免疫发光试剂是一种用于检测生物分子(例如抗体、抗原、核酸等)的试剂,利用免疫学和光学技术的结合来实现高灵敏度的检测。
其作用原理涉及到荧光发光的产生和检测,通常基于化学发光的原理,而非荧光染料。
以下是一般免疫发光试剂的作用原理:
1.标记物:在免疫发光试剂中,常用的标记物是荧光标记的抗体或抗原。
这些标记物通过特异性的抗原-抗体反应与待测生物分子结合。
2.激发和发光:荧光标记的抗体或抗原与待测物结合后,形成免疫复合物。
该免疫复合物被引入检测系统中,其中含有激发发光的化学物质(例如过氧化物化合物或者酶)。
在检测系统中,化学物质受激发后产生活性物质,这个活性物质激发荧光标记,使其发光。
3.发光检测:产生的荧光通过光学系统进行检测。
光学系统包括光源、滤光片和光电二极管等部分。
通过测量产生的荧光强度,可以确定样品中所含有的目标生物分子的量。
4.信号检测和数据分析:通过检测发光信号的强度,可以定量或定性地分析样品中的目标物质。
这个信号可以与标准曲线或控制样品进行比较,以得出样品中目标物质的浓度。
免疫发光试剂在生物医学研究、临床诊断和生物化学实验中得到了广泛应用,其主要优势包括高灵敏度、广泛的动态范围、低检测限和可自动化程度高等特点。
这使得免疫发光技术成为许多生物学和医学实验的首选方法之一。
化学发光及生物发光的原理及其应用第一部分概述化学发光 (ChemiLuminescence ,简称为 CL) 分析法是分子发光光谱分析法中的一类,它主要是依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理,利用仪器对体系化学发光强度的检测,而确定待测物含量的一种痕量分析方法。
化学发光与其它发光分析的本质区别是体系产生发光 ( 光辐射 ) 所吸收的能量来源不同。
体系产生化学发光,必须具有一个产生可检信号的光辐射反应和一个可一次提供导致发光现象足够能量的单独反应步骤的化学反应。
化学发光体系用化学式表示为:依据供能反应的特点,可将化学发光分析法分为: 1 )普通化学发光分析法 ( 供能反应为一般化学反应 ) ; 2 )生物化学发光分析法 ( 供能反应为生物化学反应;简称 BCL) ; 3 )电致化学发光分析法 ( 供能反应为电化学反应,简称ECL) 等。
根据测定方法该法又可分为:1 )直接测定 CL 分析法;2 )偶合反应 CL 分析法 ( 通过反应的偶合,测定体系中某一组份;3) 时间分辨 CL 分析法 ( 即利用多组份对同一化学发光反应影响的时间差实现多组份测定 ) ;4 )固相、气相、掖相 CL 。
分析法;5 )酵联免疫 CL 分析法等。
化学发光的系统一般可以表示为:在整个的检测系统中其关键的部分为 PMT ,其直接影响到仪器的检测性能,其最高检测极限为 10 - 22 mol/L 。
不同型号的仪器其检测技术不一样,但基本原理都是利用待测组份与体系的化学发光强度呈线性定量关系,而化学发光强度随体系反应进行的速度增强或衰弱。
记录仪记录峰形,以峰高定量,也可以峰面积定量。
因化学发光多为闪烁式发光 (1—2s 左右 ) ,故进样与记录时差短,分析速度快。
第二部分、化学发光常用的化学试剂及其原理化学发光是某种物质分子吸收化学能而产生的光辐射。
任何一个化学发光反应都包括两个关键步骤,即化学激发和发光。
化学发光免疫分析所使用的标记物可分为三类: 1.发光免疫分析反应中直接参与发光反应的标记物; 2.以催化作用或能量传递参与发光反应的酶标记物; 3.以能量传递参与氧化反应的非酶标记物。
(一)直接参与发光反应的标记物这类标记物在化学结构上有产生发光的特殊基团,在发光免疫分析过程中直接参与发光反应,并没有本底发光。
最常用的标记物主要有吖啶酯类化合物。
吖啶酯类化合物发光是典型的瞬间发光,其化学发光分析时间很短,在加入氧化剂和pH纠正液后,吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光,在1秒内光子散射达到高峰,整个过程在2秒内完成。
(二)以催化反应或能量传递参与发光的酶标记物在这类发光反应中,采用某些酶作为标记物。
这类标记物作为发光反应的催化剂或作为一种能量传递过程中的受体,其本身直接参与发光反应。
主要有两种酶: 1.辣根过氧化物酶(HRP) 2.碱性磷酸酶(ALP)(三)以能量传递参与氧化反应的非酶标记物这类标记物作为化学发光反应的催化剂或能量传递过程中的中间体(或受体),不直接参与化学发光反应。
最常用的有三联吡啶钌标记物。
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