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流式细胞术中应用的荧光染料介绍流式细胞术（Flow Cytometry）是一种用于分析和计数细胞的技术。
在流式细胞术中，荧光染料起着至关重要的作用，可以标记细胞的不同成分，使其能够通过流式细胞仪进行检测和分析。
荧光染料通过特定的荧光光谱来发出荧光信号，这些信号被流式细胞仪采集和分析，从而提供有关细胞类型、数量和功能的信息。
以下是几种常见的流式细胞术中应用的荧光染料的介绍。
1. FITC（Fluorescein Isothiocyanate）：FITC是最常用的荧光染料之一，通过与免疫球蛋白G（IgG）结合，可用于免疫细胞表面分子的检测。
FITC在波长为488 nm的激光下激发，发射的荧光信号在525 nm 左右。
它可以与其他荧光染料（如PE或APC）结合使用，以实现多参数流式细胞分析。
2. PE（Phycoerythrin）：PE是一种从红藻中提取的荧光染料，其发射的荧光信号在575 nm左右。
PE通常用于检测细胞表面的抗原或细胞内的蛋白质，如细胞因子。
PE也可以与其他染料结合使用，以实现多参数分析。
3. APC（Allophycocyanin）：APC是一种类似于PE的荧光染料，通过独特的发射波长（约于660 nm附近）和长的荧光寿命来区分。
APC适用于检测多种细胞表面分子和蛋白质，在深色的区域提供了可靠的信号。
5. PE-Cy7：PE-Cy7是PE染料与Cyanine 7（Cy7）结合形成的荧光染料。
它适用于多参数流式细胞术，利用其较长的荧光寿命和波长（激发于488 nm，发射于780 nm左右），可以与其他染料一起使用，以实现更多的细胞表面和内部分子的检测。
除了上述染料外，还有很多其他的荧光染料可以用于流式细胞术。
例如，Alexa Fluor系列、eFluor系列、Brilliant Violet系列等。
这些染料具有不同的光谱特性和荧光强度，可以根据实验需要选择合适的染料。
需要注意的是，在选择荧光染料时，需考虑染料的互相干扰问题和流式仪的激发和检测系统。
美天旎公司磁珠分选产品标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]美天旎公司MACS(磁珠分选)相关产品一、MACS微珠（MicroBeads）MACS微珠是一种与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒，用于目的细胞或者去除细胞的磁性标记。
微珠直径约有50nm，比细胞小200多倍，体积为细胞的百万分之一，光学显微镜下不可见。
微珠由多聚糖和氧化铁组成，无毒性，对细胞无损伤，可以生物降解。
MACS微珠与流式细胞仪兼容，不会影响细胞的光散射特性；磁性标记只占用2 0－30％的结合位点，不影响细胞的荧光抗体标记。
此外，MACS微珠可以最大限度地避免细胞活化；无需解离磁珠，可以直接进行后续实验：如流式细胞仪分析或分选、细胞培养、分子生物学研究、回输给人或者动物。
MACS微珠主要有三种：直标微珠、间标微珠、多选微珠。
其中间标微珠有抗免疫球蛋白微珠、抗生物素微珠或链霉亲和素微珠、抗荧光素微珠。
多选微珠是专门为分选细胞亚群而研制的一种微珠。
这种微珠通过特殊的方式与抗体偶联，在第一次阳性分选完成后，与细胞结合的多选微珠可以被解离试剂剪切下来，阳性分选的细胞可以进行再次阳性分选或者去除分选。
MACS技术分选的CD8阳性T细胞（箭头所示为磁性结合在细胞表面的微珠）二、MACS分选柱（Separation Column）MACS分选柱是一类填充有不同规格铁珠的塑料容器，铁珠表面有亲水包被，因此不会损伤细胞。
在磁场外MACS分选柱不带有磁性，但是当置于一个永久性磁场—MACS分选器中时，分选柱内的铁珠可以使分选器的磁场增强1000倍，足以滞留仅标记有极少量微珠的目的细胞；磁性标记细胞从分选柱中通过时可以受到均匀的磁力作用，从而提高分选纯度和回收率。
手动操作在30分钟内可完成，自动分选仅需分钟，得到的细胞可立即用于后续实验。
此外，大多数MACS分选柱都是无菌包装，一次性使用，可以满足细胞培养所需的无菌条件。
不知道分选柱该如何选择？给你方案！美天旎的分选柱分几类，如MS、LS、LD级autoMACS column 等，那么，这些有什么区别呢，您在实验中又该如何去选择适合您的分选柱呢？首先，让我们来认识一下分选柱：美天旎的分选柱（Column）是MACS技术的核心，其特点如下：•填充有不同规格的铁珠，可分选或者去除10^7-10^10细胞；•表面亲水包被，不损伤细胞，同时保证流速；•可以将磁场放大1000-10000倍，因此只需极少的细胞表位被识别即可被磁场捕获，从而为后续实验预留足够抗原表位，如磁珠分选后的细胞无需切除磁珠即可直接染流式抗体，而不受影响。
我们知道，美天旎的MACS分选策略有阳性分选、去除分选，那我们就按两种分选策略来分析如何选择恰当的分选柱：一、阳性分选1、要分选的细胞数量：如下图所示：MS柱容纳的最大细胞上样量是2×10^8细胞（既包含阳性细胞又包含阴性细胞），而其能捕获的阳性细胞最多是10^7。
2、目的细胞是常见细胞还是稀有细胞为了在分选稀有细胞（表达频率〈5%）时得到较更高的纯度，您可以使用两个分选柱：用一根分选柱进行一次分选后，阳性成份再过一次新的分选柱。
3、大体积的细胞另外，如果您要分选的目的细胞是体积较大的特殊细胞，如原生动物细胞、人皮肤郎罕式细胞、鼻咽癌细胞、心肌细胞等，那推荐您使用Large cell column。
因为大细胞柱的铁珠间隙足够大，容许这些特殊的大体积细胞顺利通过。
二、去除分选去除分选中需要考虑以下几个因素：1您使用MACS isolation kits 或MACS microbeads吗？2 抗原表达强还是弱呢？3 您需要更高的纯度还是回收率呢？4 您需要分选多少细胞？根据这几个因素，您可以按下图的标识来选择合适的去除分选柱。
常用抗体荧光染料的选择随着免疫荧光技术的不断发展，荧光染料及其标记的抗体偶联物也被广泛的应用于生物学实验中。
目前，市场上抗体及蛋白标记的荧光染料主要有CFTM系列(BIOTIUM, USA); Alexa Fluor®系列(Life technology, USA); DyLight系列; Cy系列; IR Dye系列等等。
使用最多的为Alexa Fluor®系列和CFTM系列。
一、CFTM系列染料的核心对比Alexa Fluor®系列具有以下几点优势：1、新型罗丹明核心罗丹明染料以优异的耐光性和良好的荧光量子产量著称。
因此很多Alexa Fluor®染料具有罗丹明核心结构，但是，传统罗丹明的化学结构很难从长波长的荧光染料延伸至远红外区域甚至是更具挑战性的近红外区域，而且生物偶联后其水溶性并不理想。
Biotium 科学家发现从绿色到近红外多色荧光的罗丹明染料的新型化学方法。
该方法被有效的应用于CF染料的产品中，尤其是远红外CF染料，而且通过这种方法制备的染料不仅水溶性极佳而且耐光性极好。
2、特异性高的近红外染料近红外染料最大的特点是比可见光范围要大很多，大滴的染料常会导致染料水溶性低、染料聚合体多、荧光量子产量差等问题。
为了解决这些问题，许多商用的近红外染料比如AlexaFluor®、DyLight®dyes和IRDyes®近红外染料，在制备时吸附了大量的带负电荷的磺化基团，其磺化作用可以在一定程度上会提高染料的溶解性和荧光性，但这样也带来了另一些更加严重的问题，经这种染料标记的生物耦联物的非特异性结合。
Biotium的科学家用革命性的方法设计出近红外染料CF，在避免引入大量负电荷的情况下，极大的保证了染料优异的理化特性。
Biotium 近红外的CF 染料以花青或罗丹明染料为核心结构，该核心结构的特殊化学修饰限制了染料的分子内位移，从而获得染料的高量子产率和更好的水溶性。
1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL1通道检测；3）可用于荧光显微镜技术4）荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。
2、Alexa Fluor 488：激发波长488nm，最大发射波长519nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL1通道检测；3）具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜技术；4）在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4～10）。
3、Cy3：激发波长488nm，最大发射波长570nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL2通道检测；3）适用于荧光显微镜技术；4）为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于PE。
4、Cy5：激发波长633/635nm，最大发射波长670nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL4通道检测；3）适用于荧光显微镜技术；4）同样为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于APC。
5）与单核和粒细胞非特异性结合多，易出现假阳性结果。
5、PE：激发波长488nm，最大发射波长575nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL2通道检测；3）其荧光泯灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术，但适用于激光共聚焦显微镜技术。
6、PE-TR：激发波长488nm，最大发射波长615nm。
1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测；2）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。
7、PE-Alexa Fluor 610：激发波长488nm，最大发射波长628nm。
1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测；2）荧光强度高；3）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。
流式抗体使用说明书流式抗体是一种用于检测细胞表面分子的重要工具。
它可以通过荧光标记来检测细胞表面分子的表达情况，从而帮助研究人员了解细胞的功能和特性。
在使用流式抗体时，需要注意以下几点：1. 样本的制备在使用流式抗体之前，需要对样本进行制备。
样本可以是细胞悬液、组织切片或血液等。
对于细胞悬液，需要进行细胞计数和细胞浓度调整。
对于组织切片，需要进行切片和染色等处理。
对于血液样本，需要进行红细胞溶解和白细胞分离等处理。
2. 抗体的选择在选择抗体时，需要考虑抗体的特异性和亲和力。
特异性是指抗体只能与目标分子结合，而不与其他分子结合。
亲和力是指抗体与目标分子结合的强度。
选择合适的抗体可以提高检测的准确性和灵敏度。
3. 抗体的标记在使用流式抗体时，需要将抗体标记上荧光物质。
常用的荧光物质有FITC、PE、APC等。
不同的荧光物质有不同的激发和发射波长，需要根据实验需要选择合适的荧光物质。
4. 流式细胞仪的设置在使用流式抗体时，需要使用流式细胞仪进行检测。
在使用流式细胞仪之前，需要进行仪器的设置。
包括激光的选择、荧光信号的检测、数据采集等。
不同的实验需要不同的设置，需要根据实验需要进行调整。
5. 数据分析在使用流式抗体进行检测后，需要对数据进行分析。
常用的数据分析软件有FlowJo、FCS Express等。
数据分析可以帮助研究人员了解细胞表面分子的表达情况，从而进一步研究细胞的功能和特性。
流式抗体是一种重要的细胞分析工具，可以帮助研究人员了解细胞的功能和特性。
在使用流式抗体时，需要注意样本的制备、抗体的选择、抗体的标记、流式细胞仪的设置和数据分析等方面，以保证实验的准确性和可靠性。
一、流式细胞术常用试剂1、10％NaN3：将10gNaN3溶解于100ml蒸馏水中，室温保存；活体实验或在辣根过氧化酶反应中可不使用NaN3。
2、3％BSA/PBS：100ml PBS中加入3g BSA，使之溶解，再加入0.2ml 10％的NaN3。
3、500mmol/L EDTA：将186g EDTA•Na2•2H2O溶解于400ml蒸馏水中，用NaOH将PH调至8.0，补充蒸馏水至500ml，分装，高压灭菌，室温保存。
4、4％多聚甲醛：在磁力搅拌下，将4g多聚甲醛溶于100ml PBS，加入数滴NaOH，在通风柜中于60度加热，使其溶解，调整PH至7.4，使用前新鲜配制。
5、消化液：0.25％胰蛋白酶（用培养液或PBS配制）或0.25％胰蛋白酶与0.02％EDTA的混合液。
6、红细胞裂解液：NH4Cl 4.16g，KHCO3 0.5g，EDTA•2Na 0.02g，溶于100ml水中，调PH 至7.2，补充蒸馏水至500ml，4度储存，使用时需恢复至室温。
7、流式细胞抗体稀释剂：0.1mmol/L PBS液（PH 7.4）＋1％BSA＋0.1％Na2N3。
8、常用细胞破膜剂：PBS液（PH 7.4）＋1％FBS（或BSA）＋0.1％NaN3＋0.1％saponin（Sigma 的效果不错）。
9、流式细胞染色洗涤液：含2％的BSA、0.1％NaN3的PBS（PH 7.4）。
10、PI染液（保存液，10×，用于细胞周期和凋亡检测）：10mg PI溶于10ml PBS，加入2mg 无DNA酶的RNA酶，4度保存备用。
应用时，10倍稀释，每管加0.3ml～0.5ml PI染液。
11、Hanks液的配制（BSS，主要用于培养液、稀释剂和细胞清洗液，不能单独作为细胞、组织培养液）原液ANaCl 160gMgSO4•7H2O 2gKCl 8gMgCl•6H2O 2gCaCl2 2.8g溶于1000ml双蒸水原液B1）Na2HPO4•12H2O 3.04gKH2PO4 1.2g葡萄糖20.0g溶于800ml双蒸水2）0.4％酚红溶液：取酚红0.4g置玻璃研钵中，逐滴加入0.1N NaOH并研磨，直至完全溶解，约加入0.1N NaOH 10ml。
