细胞培养的超净台操作

细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。

细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。

1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。

1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。

6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。

通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。

二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。

这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。

细胞培养的实验步骤细胞培养的实验步骤如下：1、细胞复苏：细胞培养条件2、复苏流程：（1）确认水浴锅的水清洁可用，方可提前打开37度预热。

（2）确认好复苏细胞的液氮罐中具体位置，并做好复苏登记。

（3）提前做好复苏准备，预热培养基。

（4）悬浮和贴壁细胞复苏参数：（5）将细胞快速放入37度水浴锅中迅速溶解，1.8ml时间大概1分30秒，1ml大概1min左右，需计时，其间不要老是拿起来观察，需要快速复溶，避免细胞受到损伤。

（6）贴壁细胞需离心，1000rpm，5min。

悬浮细胞直接加入预热的培养基中然后放入培养箱中（7）贴壁细胞离心后去除上清，用预热的培养基重悬细胞后加入T25方瓶，蕞后放入培养箱中培养。

（8）取小样计数观察，细胞活力在70%以上算正常。

低于70%活力可能细胞状态不太好，需要培养和恢复。

3、细胞传代培养1．悬浮细胞传代流程：（1）先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台。

（2）打开摇瓶瓶盖，用200ul移液器取100~200ul细胞放入1.5mlEP管中，瓶盖过火，拧紧，将培养瓶放回摇床。

（3）将200ul细胞混匀，取10ul细胞加入10ul台盼蓝，显微镜下计数。

根据细胞数决定下游实验。

（4）细胞需计数两次求平均值。

（5）悬浮细胞生长参数（6）根据不同细胞的生长曲线在合适的时间和密度给细胞接种传代。

以sf9细胞为例：细胞接种密度0.4x10^6个/ml,24h密度1x10^6个/ml,48h密度2.4x10^6个/ml,72h密度6x10^6个/ml，此时需要传代细胞。

要求留样100ml0.4x10^6个/ml具体操作如下：计算：需要母细胞体积=100*0.4/6=6.6ml需要培养基体积=100-6.6=93.4ml将上面体积的细胞和培养基加入摇瓶中，放回27度培养箱培养即可2.贴壁细胞传代流程：（1）显微镜下观察细胞状态和密度，80%汇合率以上需要传代。

（2）T25方瓶中加入0.5ml~1ml0.25%胰酶溶液（需37度预热），使瓶底细胞都浸入溶液中。

细胞培养的方法与步骤1．开紫外灯前先擦超净台，台内紫外30分钟，室内紫外10分钟。

同时将放在4℃内的培养液提前放置到室温。

（可放在抽屉中，防止紫外照射）换液2．先将培养液打开（开一层烧一层），放置在酒精灯旁。

3．将细胞从培养箱中拿出，进超净台前先要喷酒精。

4．打开培养瓶，烧瓶口，而后弯脖朝后，倒液，注意瓶口不要残留液体，若有残液要用纱布擦净。

5．倒培养液（之前要烧瓶口），注意量（5ml）不要再瓶口有残留液体是烧瓶口，否则碳化的培养液会对细胞的生长有毒害作用。

6．倒一瓶封一瓶，迅速放平，培养瓶口拧紧后再松一下，放入培养箱中。

传代2．拿出细胞，开口，烧，倒液。

3．（5ml大枪加3ml）用PBS洗2~3遍（洗净血清，放置血清钝化胰酶）。

4．胰酶消化，37℃5分钟（时间可自控）。

消化程度是细胞不能滑落，要吹落。

500微升胰酶（4×，1%）+1.5mlPBS→工作浓度0.25%（此时要用大枪）。

5．（大枪）加入3mlDMEM完全培养液终止消化，用吸管缓慢吹打壁上的细胞（不要让吸管的嘴端接触到瓶壁）6．将混合物吸入离心管，加封口膜，离心500g 5分钟（此时洗去胰酶）在此期间PBS 洗培养瓶3遍，PBS一定要吸净，否则加入培养液后会产生沉淀（培养瓶要重复使用，至少100次）7．倒掉上清，此时动作要轻或用大枪吸，加入3mlDMEM完全培养液重悬细胞，用吸管吹掉（再洗，清除胰酶）。

8．离心完毕，加入3ml新鲜培养液，再次吹打（约50~100下，视细胞情况而定），防止起泡沫，至细胞单个，圆球状为宜。

9．在培养瓶中加入新鲜培养液4ml，将吹打起来的细胞分配至各培养瓶中（量依需要而定）。

80微升，100微升都可以。

冻存8．在冻存管中加入200微升冻存液，在离心管中加入1000微升冻存液，吹打（防止起泡），移入冻存管中，此段时间不宜过久（DMSO对细胞伤害很大）。

9．封口膜封紧冻存管，可多封几层，用胶布缠紧，只缠一层就行，然后写字。

细胞实验考核要点一、准备工作1、清点超净台中仪器物品（垃圾桶、饭盒中三种管、橡胶塞、蓝枪头、移液枪、电子枪、50ml离心管、镊子、剪刀、marker笔、打火机、卫生纸、6孔板、平衡50ml内含1ml离心管），合理布置台面。

2、超净台灭菌：酒精喷洒超净台面，紫外照射20min左右。

3、预热：将PBS、10%FBS、胰酶装进PE手套中，37℃预热备用。

二、实际操作1、点燃酒精灯2、从水浴锅中取出预热的三种液体，喷酒精后放入超净台，用卫生纸擦拭瓶壁酒精。

撕开三个封口膜。

瓶口在外焰烧灼烧，拧松三个瓶盖，以备用。

3、手喷酒精后，旋松并取出T25瓶。

在显微镜下观察细胞长势，若细胞密度达到了80%-90%，则可以进行传代。

注意若显微镜没有人用过，需要在载物台附近喷洒酒精后擦拭。

4、将T25拿到超净台里面。

手进入台面内需酒精喷洒消毒（后不赘述）。

打开吸泵。

5、来回灼烧吸泵铁头。

旋开T25瓶，注意灼烧瓶盖，瓶盖扣放。

铁头插上两个蓝枪头，瓶身倾斜吸去瓶中原培养基。

灼烧瓶盖和瓶口后盖盖，不要盖太紧。

6、取1ml移液枪，将T25竖起来，向未生长细胞的侧壁打入5ml PBS冲洗。

盖盖后左右上下稍移动。

将PBS吸出。

关吸泵！7、向瓶中加入500ul胰酶。

稍混合均匀。

放入培养箱中消化2min。

计时。

8、2min内需完成的操作（1）取出一个50ml离心管。

（2）烧套管：镊子在火上过一下，套管盒稍稍开一小口，用镊子取出一个套管，火上来回灼烧，然后放置在离心管架上。

（3）烧弯头吸管：从烧瓶中用镊子取出一个塞子。

弯头吸管盒稍开一小口，确定是不是塞棉花的一头。

镊子稍稍过火灼烧，开一小口，镊子夹出塞棉花一头，放下镊子，拿出吸管。

盒子放回原处。

将塞子塞入弯头吸管中。

手持塞子来回在火上灼烧，完毕后放入套管中。

9、取出培养箱中消化的细胞，显微镜及肉眼观察消化是否合适。

若在显微镜下看到细胞质壁分离呈球形，大部分细胞已经脱离瓶壁游走在视野中，肉眼观察有白色的成片细胞脱落，说明消化完成。

细胞培养超净台的使用流程简介细胞培养超净台是一种专门用于进行细胞培养的设备，它可以提供一个无菌环境，确保细胞培养的成功。

本文将介绍细胞培养超净台的使用流程，包括准备工作、操作步骤和注意事项等内容。

准备工作在正式使用细胞培养超净台之前，需要做一些准备工作，以确保操作的成功和安全性。

1.确保超净台的清洁：使用前，需要先对超净台进行清洁，包括台面、操作面板、门把手等部分。

使用一种有效的清洁剂，确保彻底清洁。

2.检查工作区的设备和物品：检查超净台内的仪器设备和所需物品是否完整，如培养皿、管道、培养液等。

确保所有设备和物品的质量和数量符合实验需要。

3.穿戴合适的实验服和防护用品：进行细胞培养实验时，需要穿戴实验服、手套、面罩等防护用品。

检查这些防护用品是否齐全，并确保它们平整干净。

操作步骤完成准备工作后，可以开始按照以下步骤正确操作细胞培养超净台。

1.打开细胞培养超净台的电源开关，待设备启动完毕后，确认台面无菌。

2.消毒操作区域：在操作区域进行消毒处理是保证实验无菌的重要一步。

使用经过验证的消毒剂，将操作区域进行彻底消毒。

3.开启超净台内部紫外线灯：超净台内部通常配有紫外线灯。

启动紫外线灯进行灭菌，时间通常为15-30分钟，具体时间根据实验需要进行调整。

4.确保洗手消毒：在进行任何实验操作之前，必须先进行洗手消毒。

使用洗手液彻底清洁双手，然后使用酒精进行彻底消毒。

5.将所需的仪器和物品摆放到操作区域：将培养皿、离心管、试管等所需仪器和物品摆放到超净台的操作区域，以便于进行操作。

6.样品处理、细胞培养：根据实验要求，进行样品处理和细胞培养的操作。

在操作过程中，确保操作区域的无菌状态，避免污染。

7.实验结束后清洁超净台：实验结束后，清洁超净台是保证下次实验成功的必要步骤。

彻底清洁台面，消毒操作区域，并关闭超净台的电源开关。

注意事项在使用细胞培养超净台时，需要注意以下事项，以确保操作的准确性和实验结果的有效性。

超净工作台的使用方法：1、接通电源2、提前20分钟开风机。

3、提前30分钟开台内紫外灯杀菌。

注意事项：1、新安装的或长期未使用的超净工作台使用前：须对净化工作台及周围环境用超净真空吸尘器或无纤维的工具进行清洁；2、工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流正常流动，不受干扰。

3、禁止在工作台面上记录，工作时应须尽量避免作明显扰乱气流的动作无菌操作注意事项体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。

即便使用设备完善的实验室。

若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。

因而．为在一切操作中为最大可能的保证无菌．每一项工作都必须做到有条不紊和完全靠。

【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。

有关数据的计算要事先做好。

根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。

这可以避免开始实验后．囚物品不全往返拿取而增加污染机会。

【操作野消毒】无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)．紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。

然后紫外线淌毒30min。

在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置．否则会遮挡射线降低消毒效果。

—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。

【洗手和着装】原则上和外科手术相同。

平时仅做观察不做培养操作时，可穿装细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。

在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。

如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。

进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。

【火焰消毒】在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。

细胞培养实验报告细胞培养实验报告细胞培养主要包括细胞复苏、细胞传代和细胞冻存三个过程。

一、实验仪器及用品（一）超净台：1.枪头：10 mL、5 mL、1 mL、200 μL、10 μL；2.移液枪：同上，及相应的支架；3.离心管：50 mL、15 mL、1.5 mL，及相应支架与盛皿；4.记号笔；5.PBS缓冲液；6.酒精棉；7.废液杯×2：一个装枪头，一个装废液；8.封口膜；9.排枪卡槽；（二）细胞间：1.离心机：中型、小型；2.培养瓶：透气的用于培养，密封的用于运输，培养皿；3.灭菌离心管、枪头、冻存管等备用；4.毛巾、手套、口罩、酒精喷壶、灭菌超纯水、除菌滤膜；5.100 μL排枪；6.血球计数板、载玻片；7.水浴锅；（三）冰箱：1.双抗、环丙沙星；2.4℃：DMEM、1640、PBS、已配培养基；3.-20℃：MTT、MTS、DMSO、血清、胰酶；（四）缓冲间：罐、液氮罐；1.CO2（五）换衣间1. 实验服、拖鞋、手套、口罩、酒精喷壶；二、实验前准备（一）实验前将需要带入的物品洗净、高温灭菌、喷酒精，放入传送窗，将传送窗与细胞间紫外开启杀菌半小时；（二）半小时后关闭紫外，开启风阀与空调，散去臭氧，双手用洗手液洗净擦干后进入换衣间，换上隔离服（若不使用超净台，换实验服即可），戴上口罩、手套喷酒精，进入缓冲间风浴1-3 min；（三）进入细胞间，冰箱中取出所需溶液（胰酶、培养基等）置于超净台中，开启超净台紫外，关闭传送窗紫外，将物品取出后喷酒精后放于应处位置；注：若是冬天，溶液应在37℃水浴后再使用，所有物品放入超净台前均需再喷酒精，特别是盖口处。

三、细胞培养（一）细胞复苏1. 培养基配制：倒出50 mL培养基，加入50 mL血清，5 mL双抗（浓度10-50 μg/mL环丙沙星可作用一周抑制支原体生长），分装3天够用的培养基即可，所有都用封口膜封住；2. 冻存液配制：1 mL DMSO、2 mL血清、7 mL培养液混合；3.37℃温育DMEM培养液（含双抗和血清）。

细胞培养操作步骤培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml冻存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清2ml。

依次比例酌量配置。

超净工作台常规配置移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个，常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精……实验前准备：所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。

首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37℃的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37℃水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。

若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。

这一过程可在超净工作台外操作。

实验步骤一、原代细胞的培养1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。

特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。

3.取1个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。

4.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。

1.目的为了规定了超净工作台的使用及维护保养标准操作规程，以达到操作者正确操作及维护的目的。

2.范围适用超净工作台的操作、维护清洁及注意事项。

3.职责仪器操作人员执行本操作规程。

4.工作内容4.1 仪器描述超净工作台是一种提供局部无尘无菌工作环境的单向流型空气净化设备，广泛适用于医药卫生、生物制药、食品、医学科学实验、光学、电子、无菌室实验、无菌微生物检验、植物组培接种等需要局部洁净无菌工作环境的科研和生产部门。

4.2 技术参数电源：AC220V，50Hz输入功率：300VA洁净度：ISO 5（100级）设备净重：125Kg外形尺寸（mm）：840×825×14304.3 正常使用条件：环境温度：(5～40)℃相对温度：不大于80%4.4 操作方法4.4.1 使用前的检查使用前应仔细检查，调试超净工作台各种性能、状况、仔细检查、调试电源、电压是否完好、稳定，用75%酒精认真做好净化工作台使用前的清洁擦拭工作。

4.4.2 操作4.4.2.1 将实验所需要的仪器用品放入工作台，接通总电源，使超净工作台通风和普通照明开关关闭，打开紫外灯30min，进行紫外杀菌、消毒。

4.4.2.2 关闭紫外灯，开启照明、风机开关，调节风力至适当大小，吹15min以上，以排除臭氧。

4.4.2.3 穿好隔离衣，戴好口罩，帽子。

双手及手腕用75%酒精消毒。

4.4.2.4 点燃酒精灯，工作台内应避免放入过多的物品，使用的吸管，滴管，试管，培养瓶等均事先灭菌。

4.4.2.5 打开各类瓶盖前先用酒精棉擦拭，再过火，以固定灰尘；打开的瓶口、试管口过火焰，镊子使用前应经火焰烧灼。

4.4.2.6 工作台内瓶口应斜置，尽量避免瓶口敞开直立。

4.4.2.7 同一根吸管或滴管不应连续用于几个不同的细胞系；吸取培养基的吸管应离开培养瓶或试管口0.5cm，避免伸入培养瓶口或试管口；以防止细胞系的互相混杂污染。

4.4.2.8 遗留在培养瓶上或迸溅台上的液体，立即用酒精棉球擦拭。

细胞培养
（1）超净台准备：穿好隔离衣，拖鞋后，进入细胞培养室。

带好手套，紫外线消毒30分钟，点
燃酒精灯，烘烤仪器架，将要使用的滴管烘烤大
约四分之三的长度，并配好胶头，放在仪器架上
备用。

（2）细胞复苏：将准备复苏的细胞，快速送入细胞室后，放入37℃的温箱，大约1分钟左右，
至冻存管解冻大约五分之四时取出，进入超净台，开始复苏。

将冻存管中的液体用一号吸管取出放
入准备好的离心管中，放入离心机中离心5分钟
／1000R，弃去上清，用2号吸管放入适量的培
养液用一号吸管充分吹打后分装在培养瓶中，并
用2号吸管注入适量培养基，于细胞培养箱中培
养（松开瓶口）。

（3）细胞换液：用1号吸管吸取液体，紧贴细胞生长的壁吸液，用2号吸管吸取新的培养液。

（4）细胞传代：用1号吸管弃去废液，并用PBS 液冲洗两遍，用枪头取胰酶约800ul入培养瓶,
震荡一分钟左右,当有片状脱离时,用培养液终止
反应,取出离心,后弃去上液,加入新的培养液吹
打充分后,分装.
（5）细胞冻存:如细胞传代,将细胞分离后,加入冻存液,分装到冻存管中(1.5ml),放入冻存室.。

细胞间基本规定每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min)。

显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。

超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。

带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾.细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。

基培需写上开启时间。

细胞培养标准流程1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例）Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。

所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。

步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌2。

弃旧：细胞生长融合达90％时，吸出培养基3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1—2次4。

消化：加入1ml 0。

25％胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO2 放置40s-1min，，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞脱壁。

5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10％FBS的完全培养基终止消化。

6。

吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁,呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿.再加入10ml全培。

（大盘10ml全培，小盘6ml全培）（细胞生长快留30％，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA）7。

培养:每天或每两天更换一次培养基,直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况.PS：六孔板一般加培养基2300μL/孔。

2、细胞转染TurboFect 转染试剂转染(用于质粒的转染,说明书附后）细胞接板24 h 后转染。

转染时细胞密度需达到70-90%。

以6 孔板为例，转染前细胞先换液,加4ml全培。

取1.5 ml 离心管，加入400 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入质粒2 μg，混匀后静置5 min，再转染试剂4 μL,混匀(转染试剂是质粒的2倍），室温静置15－20 min。

无菌接种箱超净工作台超净台安全操作及保养规程前言超净工作台（Hood）和超净台（Clean Bench）是生命科学领域中最常用的实验室设备之一。

它们具有无尘、无菌、无毒等优点，广泛应用于细胞培养、微生物学、分子生物学、药物研发等领域，保证了实验的准确性和可重复性。

然而，正确使用和保养这些设备是确保实验准确性和人员安全的必要条件。

本文将介绍无菌接种箱超净工作台超净台的正确使用和保养规程。

安全操作前操作1.确定实验物品种类和数量，仅在洁净室内打开包装，将物品移入Hood或Clean Bench；2.检查工作区域内的温度、湿度、洁净等级，调整为符合实验要求；3.将Hood或Clean Bench的UV灯开启20-30分钟，杀灭残余的细菌和病毒；4.开始实验。

操作过程1.操作人员应穿戴干净、防护的实验室服装，佩戴口罩和手套，消毒双手；2.操作人员应在Hood或Clean Bench内逗留，避免频繁进出；3.实验物品应放置在Hood或Clean Bench的中央位置，避免恶劣温湿度环境；4.操作人员慢慢、轻轻地将实验物品放置在培养皿或试管中，避免产生气泡；5.操作完成后，操作人员应将工作区域内存放的物品全部清理整齐；6.关闭Hood或Clean Bench的UV灯。

后操作1.将Hood或Clean Bench的台面彻底消毒清洗，保证实验环境的洁净度；2.关闭Hood或Clean Bench的门，避免馀留细菌、病毒、灰尘等进入；3.将工作区域内的手套、口罩等防护用品进行正确处理。

保养规程日常保养1.实验操作前应清洁和消毒Hood或Clean Bench的台面和内部；2.定期使用消毒喷雾剂消毒和杀菌；3.定期检查Hood或Clean Bench的工作状态，如风速、震动、噪音等；4.定期更换过滤器；定期保养1.每半年进行一次Hood或Clean Bench内部全面清洁维护；2.检查电线、插头是否破损裂开，需要及时修复或更替；3.检查过滤器是否需要更换，或者需要更换其它配件。

细胞培养室工作守则及注意事项一、常规操作1. 穿着专用实验服。

自己的白大衣或厚外套，可脱在门外的衣帽架上。

2. 穿着专用拖鞋。

在缓冲间换下自己的鞋子，尽量避免在缓冲间走动、停留。

3. 细胞室最多可4个人同时使用。

尽量避免在内长时间逗留、交谈。

4. 不允许带无关人员进入，禁止往实验室带小鼠，食物等。

二、培养箱使用规则1. 从培养箱取放物品前，用酒精清洁双手（或手套），尽量缩短开门时间和减少开门次数。

注：培养箱中的空气是经过过滤的洁净空气。

长时间敞开或频繁开关培养箱，容易造成污染。

2. 培养瓶皿放入培养箱前，用酒精消毒表面，并稍等至酒精挥发后再放入，以免培养箱内滞留过多乙醇蒸气。

3. 2-3人共用一层培养箱，按预定位置摆放培养器皿，方便查找，以免长时间敞开培养箱。

4. 普通培养中的细胞，若非实验需要，每瓶/板细胞每天只需要观察生长状态一次，2人以上共用的细胞，可约好时间一起观察。

注：频繁将细胞拿出观察，容易给培养箱造成污染，同时也会影响细胞生长条件的恒定。

三、显微镜使用规则1. 显微镜使用前，用酒精棉从中间至周围擦拭载物台。

2. 离开细胞室时或较长时间不需使用时，及时关上电源，延长灯泡寿命。

尽量避免频繁开关显微镜电源。

四、超净台相关操作规则1. 超净台使用遵循预约原则。

无预约者若有必要在他人预约时段内使用，需先征得预约者的同意，否则应无条件让出工作台，以免耽误他人实验。

2. 超净台使用前用紫外灯照射15分钟灭菌，使用前、后需用酒精棉球擦拭工作区消毒，所有物品放入超净台内使用前均应消毒。

3. 点燃酒精灯前需检查瓶中酒精是否足够，液面应占瓶高1/3-2/3。

注：消毒用75%的酒精，酒精灯用95%的酒精，向喷壶或灯内添加酒精时请留意。

注：酒精和酒精棉球由值日生负责补给，发现细胞室内存放量不足时请及时通知值日生。

4. 超净台中应摆放废液杯和废品杯各一只，用于暂时存放废弃物，实验结束后将杯内垃圾倒入水池或垃圾桶中，并冲洗晾干备用。

培养基配制：DMEM+10%FBS+1%双抗PBS配方：配好后，用空气抽滤机抽滤，先放两层定型滤纸，再放一层微孔滤膜，过滤后，放入灭菌锅里灭菌。

细胞复苏：1、准备好培养基，吸管，培养瓶，同时将培养基37°预热，处理超净台。

2、将细胞快速从液氮瓶中取出，放入37°水浴锅中快速摇动，使细胞快速融化。

3、转入超净台，将细胞液从冷冻管中转移到15ml离心管中，同时加入3ML（5ml）培养液，离心。

4、弃上清，加入3ml培养液，吹打均匀，移入培养瓶中，观察培养。

5、隔3h观察是贴壁，8H后换液。

细胞培养：换液：直接倒掉旧的培养基，加入2-3ml新鲜培养基（如果长时间不管，死细胞太多时，先用PBS洗两遍）消化：先将旧的培养基倒掉，用PBS（2ml）左右洗一遍，再加入1ml胰酶进行消化，（待细胞边缘清晰，轮廓鲜明，但不要让细胞掉下来，即细胞消化好了），倒掉胰酶，再加入3ml 新鲜培养基进行吹打。

观察后进行分装，再取1.5ml入新瓶，各补1.5ml新的培养基。

冻存：1、配制含10%DMSO（或甘油），10-20%小牛血清（FBS）的冻存培养基。

2、消化细胞，加入3ml培养基，移至15ml离心管中.3、离心，1000rpm,5min.4、去除培养基，加入适量配置好的冻存培养基，用吸管吹打均匀，计数，调节细胞密度为5*106----1*107/ml5、将细胞分装入冷冻管中，每管1-1.5ml6、表明细胞名称，日期等7、冻存顺序为：先放入-20°冰箱2h,后放入-70°冰箱过夜，再放入液氮罐中保存。

冻存液的配制：配置好的培养基（含FBS和双抗的培养基）+10%DMSO材料处理：1、打孔器处理材料，使其能置于孔中。

2、紫外照射，每面2h.3、将支架置于24孔板中，3个平行，以空白玻片为对照试验。

4、每孔加入一定量75%酒精，浸泡消毒4h后，吸出，晾干。

5、用PBS溶液浸泡漂洗5次，每次1ml,每次>=12min.6、用培养基（无血清无双抗）浸泡材料半小时左右，放入CO2培养箱，过夜晾干，以备种植细胞。

细胞培养中细胞活力检测标准操作规程一、目的：建立用于细胞培养过程中染色排除法检测细胞活力的操作规范，以确保标准细胞在传代扩增前细胞活力达到一定标准。

二、范围：细胞复苏后冻存前三、仪器：超净工作台、倒置显微镜四、试剂及耗材：4%的台盼蓝染液、载玻片、盖玻片、计数器五、操作规程1.超净台紫外照射灭菌半小时，DMEM高糖完全培养基、1640完全培养基、PBS 溶液在37℃水浴锅中预热，0.25%胰酶平衡至室温。

2.从培养箱中取出培养至细胞丰度达80%以上的贴壁细胞的培养皿，用75%的乙醇喷洒后拿进超净台，用滴管移去培养皿中的培养液，用2mL的PBS溶液清洗细胞一遍，弃去，以洗掉残存的培养液。

3.用移液枪吸取2 mL 0.25%胰酶至培养皿中，轻轻摇晃使胰酶覆盖整个平皿，在显微镜下消化3-5 min，观察培养皿中的细胞直至细胞变圆，从培养皿脱落。

4.向培养皿中加入2 mL的DMEM高糖完全培养基，终止胰酶消化，用吸管吹打细胞至细胞成单分散状态。

将细胞悬液转移至15 mL离心管中，900 rpm离心3min，小心弃去全部上清液。

（若为悬浮细胞，上述步骤可省略。

用吸管轻轻吹打培养液后全部转移入15mL 离心管中，900 rpm离心4 min弃去上清即可。

）5.加入2mL PBS溶液将细胞沉淀吹打均匀，若为悬浮细胞，加入900µLPBS溶液稀释10倍；若为贴壁细胞，加入400µLPBS溶液稀释5倍。

6.取90µL稀释后的细胞悬液，按9:1的量加入10µL 0.4％台盼蓝染色液（终浓度为0.04%），充分混匀，静置3 min。

7.吸取10µL染色后的细胞悬液显微镜下观察，计数细胞总数及染色后细胞。

活细胞圆形透明，死细胞染成蓝色，用活细胞占计数细胞中的百分比表示细胞活力。

每种细胞测三次取平均。

活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%注意事项①染色时间不能太长，否则活细胞也会逐渐积累染料而染成颜色，使结果偏低。

细胞超净台的使用流程1. 细胞超净台简介细胞超净台，又称生物安全柜或细胞培养箱，是一种用于细胞培养和实验的重要设备。

它能提供洁净的工作环境，保持实验样品的无菌状态，防止实验样品受到外部污染和交叉感染。

2. 准备工作在使用细胞超净台之前，需要进行以下准备工作： - 确保细胞超净台的电源已连接，并且工作正常。

- 清理工作台面，确保表面洁净，无灰尘和杂物。

- 准备好所需的实验器具、试剂和培养物。

3. 进行细胞超净台的消毒细胞超净台在每次使用前都需要进行消毒，以确保工作环境的洁净。

具体步骤如下： 1. 打开细胞超净台的门，取出工作室内部的物品。

2. 使用消毒液或75%酒精擦拭工作面和侧壁，并确保完全湿润。

3. 等待15-30分钟，让消毒液充分发挥杀菌作用。

4. 使用无菌纸巾或干净的纸巾擦拭工作面和侧壁，将残留的消毒液擦拭干净。

5. 关闭细胞超净台的门，并等待数分钟，让空气中的蒸汽完全消散。

4. 开始实验在细胞超净台进行实验时，需要遵循以下步骤： 1. 戴上实验手套和口罩，以防止外部细菌和病毒的污染。

2. 打开细胞超净台的门，并将所需的实验器具和试剂放置在工作面上。

3. 打开超净台的紫外线灯，让紫外线照射工作面10-15分钟，以杀灭空气中的细菌和病毒。

4. 将培养物和样本放置在无菌条件下进行处理和操作。

5. 操作结束后，关闭细胞超净台的门，并关闭紫外线灯。

5. 细胞超净台的日常维护细胞超净台的日常维护非常重要，可以延长设备的使用寿命和确保实验结果的准确性。

以下是一些常见的日常维护工作： - 定期清洁细胞超净台的表面，使用无菌纸巾和消毒液进行擦拭。

- 检查和更换过滤器，保持其正常工作状态。

- 定期清理超净台的排水孔，防止污液积聚和细菌滋生。

- 每天都要进行消毒和紫外线灯照射，确保工作环境的洁净。

6. 安全注意事项在使用细胞超净台时，需要遵循以下安全注意事项： - 戴上实验手套和口罩，以保护人身安全。

Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。

观察时拧紧盖子。

2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。

3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。

不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。

取小离心管一个，置于架子上。

4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。

放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。

5．取待传代的细胞。

打开versene，用酒精灯外焰烧。

烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。

把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。

6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。

（加versene主要是为了将旧培养基洗去）。

在离心管中间部分将液体加入。

吸液体和加液体时都不要对着细胞。

7．打开胰酶，然后将versene弃掉。

换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。

加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。

8．将细胞放入37度孵箱。

放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。

使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。

别忘了用旧培养基中和。

9．取细胞，镜下观察消化情况。

消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。

用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。

然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。

10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。

11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。

换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。

12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。

不要把枪伸到离心管内。

13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。