RNA-Seq定量分析介绍

RNAseq定量分析方案RNAseq定量分析方案 1一、实验目的： 2二、实验大致流程 2三、实验前的准备活动 23.1准备数据 23.2确定涉及软件是否安装完毕，及其输入输出文件。

3四、实验过程 44.1.利用bowtie2-bulid命令根据提供的参考基因组序列建立对应的索引文件。

54.2.利用tophat命令将分别将代比较的reads maping到参考基因组序列上 64.3利用cufflinks软件分别将待测样品的转录组reads拼接起来，并同时计算每个样品各个基因的rpkm值 74.4.利用coffmerge和cuffdiff软件计算每个样品各个基因的fpkm值。

8五．利用R软件查看结果文件。

10一、实验目的：利用已有的水稻基因组数据对来自两棵不同的水稻进行转录组水平差异的研究。

二、实验大致流程1. 利用bowtie2-bulid命令根据提供的参考基因组序列建立对应的索引文件2. 利用tophat命令将分别将代比较的reads maping到参考基因组序列上3. 利用cufflinks软件分别将待测样品的转录组reads拼接起来，计算每个样品各个基因的fpkm值4. 利用coffmerge和cuffdiff软件计算每个样品各个基因的fpkm值。

5. 利用R软件查看比较结果。

三、实验前的准备活动3.1准备数据像大多数生物实验一样，做生物信息学实验之前也是需要事先准备好“药品”和“仪器”，不然到了关键时刻也是一样会手忙脚乱的。

现在我们先来谈一谈生物信息实验需要准备的“药品”—数据。

对于RNAseq实验而言，这里至少需要准备一下几个文件：1.参考基因组序列文件如 refrence.fa参考基因组数据：2.参考基因组注释文件如 refrence.gtfa参考基因组序列设为refrence.fa b参考基因注释设为refrence.gtfF1_sample_R1.fastq待比较样品F1：(为RNA测序数据) F1_sample_R1.fastqP1_sample_R1.fastq待比较样品P2：(为RNA测序数据) P1_sample_L007_R2.fastq3.2确定涉及软件是否安装完毕，及其输入输出文件。

RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理在开始详细讲解RNA测序之前，我们先来了解一下它的基本步骤：1.建库：提取RNA，富集mRNA或消除rRNA，合成cDNA和构建测序文库。

2.测序：然后在高通量平台（通常是Illumina）上进行测序（每个样本测序reads在DNA测序中，读数是对应于单个DNA片段的全部或部分的碱基对（或碱基对概率）的推断序列。

深度为10-30 Million reads。

）3.分析：先比对/拼装测序片段到转录本，通过计数、定量，样本间过滤和标准化，以进行样本组间基因/转录本统计差异分析。

大致了解这个过程之后，我们就先从建库开始了解建库的难点在于提纯出mRNA, 一般在我们抽离出的RNA中rRNA占比很大，其他还会有tRNA、microRNA等。

我们需要从抽离出的RNA中提取出mRNA，并建立cDNA文库。

这里以应用最广泛的Illumina公司的Truseq RNA的建库方法为例来进行介绍。

首先，利用高等生物的mRNA通常有poly(A)尾的（使mRNA更稳定，翻译不容易出错）特点，用带有poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交，这样磁珠就和带poly(A)尾巴的mRNA结合在一起了。

接下来，就回收磁珠，把这些带poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。

再用镁离子溶液（或者超声波）进行处理，把mRNA打成小段。

然后，利用这些被打断的mRNA片段，以随机引物进行逆转录，得到第一链cDNA。

再根据第一链cDNA合成出ds-cDNA。

对cDNA在平末端进行3’端加A碱基（腺苷酸）（adapter接头上带了T碱基头，为了和adapter配对）在双链cDNA的两端加分别上Y型接头再经PCR扩增经筛选的目的基因，就得到可以上机的测序文库了。

这个建库方法对RNA的完整度有较高的要求。

也就是说，只有在mRNA大部分是完整的状态下，才能得到比较好的效果。

因为带Poly(T)的磁珠，它所吸附的是带有Poly(A)的那些序列。

RNAseq汇总篇，一文掌握RNAseqRNA测序（RNA-seq）在过往十年里逐渐成为全转录组水平分析差异基因表达和研究mRNA差异剪接必不可少的工具。

RNA-seq帮助大家对RNA生物学的理解会越来越全面：从转录本在何时何地转录到RNA折叠以及分子互作发挥功能等。

1.RNA-seq相关名词详细介绍了RNA seq的专业词、高通量测序常用词、转录组测序问题等，是入门RNA seq较好的资料。

2.什么是RNA-seq？一文读懂了解了RNA-seq相关基础知识，需要进一步了解RNA seq究竟是什么？能做什么？一文读懂。

RNA-seq是一种集合实验方法和计算机手段的一种技术，它可以确定生物样本中RNA序列的特征性和丰度。

RNA-seq方法的产生源自于测序技术的世代革新。

RNA-seq数据可以让我们知道很多未知的东西，比如，我们可以识别出胚胎干细胞中编码新蛋白质的转录本，可以找到皮肤癌细胞中那些过表达的转录本。

3.RNA-seq测序基本知识一般来说，NGS测序特别是RNA-seq正在迅速改变实验的设计和执行方式。

由于技术的飞速发展，可以公平地说，对于一个特定问题没有单一的正确答案。

而且许多RNA-seq项目有多个目标，例如，可能需要鉴定样本中的新基因融合转录物，对已知基因的丰度进行量化，并鉴定已知基因中的任何SNP。

因此，根据研究设计原则提供指导是更为合理的，用户既可以对预期成果充满信心地计划项目，也可以理解为什么做出某些选择。

在一项研究中所使用的覆盖范围和平台的数量可能需要进行权衡，而且由于实验室资源有限，因此需要进行权衡。

4.RNA-Seq怎么做，又会遇到哪些问题这两年随着测序成本的下降和转录组研究的日渐火热，RNA-seq 俨然已经成为了分子生物学课题组推进项目的首选方向。

5.37个RNA-seq工具大PK，教你数据处理方法如何选择RNA-seq技术的广泛应用为转录组研究迎来了一个新时代。

根据研究内容的方向，精度、速度和成本要求不同，科研人员需要对包括采取何种具体测序方法流程、样品类型、所需的分析结果，以及基因组研究现状和计算数据处理可用资源等内容进行权衡。

RNA-seq⽅法原理、数据分析、数据库及⼯具介绍RNA-seq⽅法原理、数据分析、数据库及⼯具介绍能够对RNA序列数据进⾏分析的新⽅法可以让我们从头开始构建转录组。

对RNA进⾏测序⼀直以来都被认为是⼀种发现基因的有效⽅法，⽽且这种⽅法还被认为是对编码基因以及⾮编码基因进⾏注释的⾦标准。

与以前的⽅法相⽐，⼤规模平⾏RNA测序⽅法（massively parallel sequencing of RNA）极⼤增强了RNA测序技术的处理能⼒，使我们得以能够对转录组进⾏测序。

在本⽂中即将介绍到的这两种RNA测序⽅法就能以前所未有的精度对转录组进⾏分析。

Trapnell⼩组使⽤的⽅法是⼀种名为Cufflinks的软件。

这种软件能够随时发现⼩⿏⽣肌细胞（myoblast cell）内新出现的转录⼦，还能在细胞分化时对转录⼦表达⽔平进⾏监测，从⽽分析基因表达情况和剪接情况。

Guttman⼩组也使⽤了与 Trapnell⼩组相类似的软件⽅法，不过他们使⽤的是另⼀种名为Scripture的软件。

Scripture软件可以对源⾃三个⼩⿏细胞系的转录组进⾏再注释（reannotate），从⽽对数百个最近新发现的lincRNA（large intergenic noncoding RNA）进⾏完整的基因模式注释。

虽然RNA测序技术已经出现了将近20年，但直到最近才开始构建克隆⽂库。

对⼈类、⼩⿏以及其它重要模式⽣物进⾏全长基因克隆构建的科研项⽬需要⼏年的时间才能够完成。

但是有了最新的测序技术，我们将不再需要构建克隆⽂库，可以直接对cDNA⽚段进⾏测序。

我们现在可以只需要花费⼏天，仅⽤以往同类项⽬科研经费的很少⼀部分就能够得到⼀个⽐较满意的完整的细胞转录组。

但是这种新技术也存在⼀点问题。

不⽤构建克隆，我们就⽆法知道哪⼀个“结果（mRNA或蛋⽩）”来⾃哪⼀个转录⼦。

最近已经有⼈开始通过对已知的或者预测出来的转录⼦的短RNA序列进⾏测序的⽅式来对基因表达和可变剪接进⾏分析研究。

生物大数据技术在转录组水平差异分析中的方法介绍转录组水平差异分析是生物学研究中的重要环节，它可以用来研究不同样品之间基因表达的差异，从而揭示生物体在不同条件下的基因调控机制。

随着生物大数据技术的快速发展，转录组水平差异分析的方法也在不断提升和改进。

本文将介绍几种常用的生物大数据技术在转录组水平差异分析中的方法，包括RNA-seq、microarray和qRT-PCR。

首先，RNA-seq是当前最为常用的转录组水平差异分析方法。

RNA-seq是通过高通量测序技术，将转录组中的RNA分子转化为可测序的DNA片段，并在高通量测序平台上进行测序。

通过将测序得到的DNA片段比对到参考基因组上，可以得到每个基因的表达水平。

通过统计不同样品中基因的表达量差异，可以确定基因的差异表达。

RNA-seq的优势在于其高灵敏度、高分辨率和高通量。

由于RNA-seq测序可以涵盖转录组中的所有RNA类别，不受预设探针的限制，因此可以检测到低丰度的RNA以及新的基因表达。

此外，RNA-seq还可以通过比对到参考基因组上的DNA 片段来进行额外的分析，如寻找剪接变异、新转录本的发现等。

因此，RNA-seq在转录组水平差异分析中具有广泛的应用前景。

其次，microarray是一种早期广泛应用的转录组水平差异分析技术。

microarray 使用印刷在玻璃或硅片上的探针，通过测量RNA样品与探针的杂交信号来分析基因的表达水平。

这种技术具有高通量、平行性和高灵敏度的优点，可以同时分析成千上万个基因的表达。

然而，与RNA-seq相比，microarray也存在一些限制。

首先，microarray的准确性和灵敏度较差，受到探针设计和杂交效率的影响。

此外，microarray只能检测到预先设定的基因，无法捕获新的基因表达信息。

最重要的是，microarray需要提前设计探针，并且需要大量的RNA样品。

因此，在大规模生物大数据研究中，RNA-seq已逐渐取代了microarray成为首选的转录组水平差异分析方法。

RNA-Seq数据分析从原始的数据开始，进行reads回帖，到拼接转录本，计算表达量，分析差异表达，最后可视化分析结果。

TopHat是一个把reads回帖到基因组上的工具。

首先用Bowtie把reads 回帖到基因组上，然后通过拼接，我们就可以在基因组上看到一些reads堆叠起来的区域，称为consensus,这些consensus可能是一个真的外显子，也有可能是几个外显子拼在一起的，或者一些别的情况。

我们知道，经典的剪切位点一般都有GT和AG这样的序列标志，在consensus的边界和内部，TopHat会去找这样的剪切位点，并且得到他们可能的组合。

然后对于那些没有被Bowtie贴到基因组上的reads,TopHat会对他们建立索引，去和这些可能的剪切位点比对，这样就把跨越剪切位点的reads准确地贴到基因组上。

一些比较重要的命令行选项。

关于插入片段长度的选项：在RNA-Seq中，会把mRNA打断成小的片段，然后对片段长度进行iding筛选后拿去测序，如果选择的片段长度是300bp，两端各测序75bp的reads,中间的插入片段长度就应该设为150bp.下面是设置插入片段长度的标准差，如果选择的片段长度比较集中，这个值可以设置的小一些，反之应该设置得大一些。

-G选项是提供哦呢一个已有的注释文件。

如果你分析的基因组被注释得比较好了，最好能够提供这个文件，这时TopHat就会先把reads往转录组上贴，没有贴到转录组上的再往基因组上贴，最后把结果合并起来。

我们知道大多数的转录组都是比基因组小得多的，而且junction reads可以直接贴到转录本上，所以这样回帖的效力和准确度都可以得到提高。

标准的Illumina平台是不分链的，我们无法知道配对的reads哪个方向和转录本一致，哪个和转录本反向互补。

对于分链的数据，也有两种情况，在firststrand这种分链方法中，第二个read和转录本方向一致，第一个read和转录本反向互补，在另一种fr- secondstrand分链方法中，就刚好反过来了。

RNA-seq转录组的测序技术一、概述1. RNA-seq技术简介在过去的几十年中，研究人员利用转录组学技术对生物体中的RNA 进行研究，以揭示基因表达调控和基因功能等方面的信息。

而RNA-seq技术则是近年来兴起的一种高通量测序技术，逐渐替代了传统的microarray技术，成为了研究转录组学的主流方法之一。

二、RNA-seq的原理1. 测序库构建在进行RNA-seq实验之前，首先需要构建测序库。

通常采用聚合酶链式反应(PCR)或者DNA和RNA的逆转录(Reverse Transcription)来将RNA转录成双链DNA，并添加barcode标签，最后形成文库。

2. 高通量测序完成测序库的构建后，需要使用高通量测序技术对文库中的DNA 进行测序。

目前常用的测序评台包括Illumina、Ion Torrent、PacBio 等公司的测序仪器。

高通量测序技术能够快速、高效地获取大量的基因序列信息。

三、RNA-seq的优势1. 高灵敏度与传统的microarray技术相比，RNA-seq能够提供更高的灵敏度和动态范围，能够检测到低表达水平的基因，同时也能够覆盖更广泛的基因组区域。

2. 高分辨率RNA-seq能够提供单个碱基的分辨率，帮助研究人员更准确地识别基因的外显子、内含子和剪切异构体。

3. 无需先验信息相比于microarray技术需要先知道待检测基因的序列信息，RNA-seq技术能够在不依赖已知基因组信息的情况下进行测序。

四、RNA-seq的应用1. 基因表达水平分析RNA-seq能够帮助科研人员进行基因表达水平的定量和定性分析，揭示基因在不同组织、不同环境条件下的表达规律。

2. 剪切异构体分析通过RNA-seq技术可以发现和识别基因的各种剪切异构体，帮助了解基因的调控机制。

3. RNA编辑和融合蛋白质的细致分析RNA-seq技术也被广泛应用于RNA编辑和融合蛋白质的研究，为研究人员提供了一种便捷的方法。

转录组研究新技术RNASeq及其应用一、本文概述随着生物信息学和分子生物学的快速发展，转录组研究已成为解析生命活动重要机制的关键手段。

近年来，新一代测序技术（Next-Generation Sequencing，NGS）的崛起，特别是RNA测序（RNA Sequencing，RNA-Seq）技术的广泛应用，极大地推动了转录组学研究的深度和广度。

RNA-Seq技术以其高分辨率、高灵敏度和高定量的特性，在基因表达分析、非编码RNA研究、基因结构变异分析等领域展现出强大的潜力。

本文旨在全面介绍RNA-Seq技术的基本原理、实验流程、数据分析方法，以及其在生命科学各领域中的实际应用，以期为相关研究人员提供有益的参考和启示。

二、RNASeq技术概述RNA测序（RNASeq）是一种革命性的技术，极大地推动了转录组学的研究进程。

该技术基于下一代测序（Next Generation Sequencing, NGS）平台，可以对生物样本中的RNA进行全面、精确的测序和分析。

RNASeq不仅提供了转录本的序列信息，还能够揭示转录本的表达水平、剪接方式、变异情况以及基因结构等重要信息。

RNASeq的实验流程通常包括样本制备、文库构建、测序和数据分析等步骤。

在样本制备阶段，需要提取高质量的RNA，并通过一系列的处理步骤去除杂质和降解的RNA。

文库构建是RNASeq技术的核心，其目标是将RNA片段化、反转录成cDNA，并构建成适合测序的文库。

测序阶段则利用NGS平台对文库进行高通量测序，获得大量的序列数据。

数据分析是RNASeq技术的另一个关键环节。

通过对测序数据的处理和分析，可以鉴定出转录本、评估基因表达水平、发现可变剪接事件、识别基因融合以及探索非编码RNA等。

RNASeq技术还可以与表观遗传学、蛋白质组学等其他组学技术相结合，从多个层面揭示生命活动的复杂性和多样性。

RNASeq技术的应用范围非常广泛，涵盖了基础生物学研究、疾病机理探索、药物研发等多个领域。