甘草组培快繁技术优化的研究

植物组织培养的发展研究进展摘要：植物组织培养作为一种有效的技术手段，已经被广泛应用于生产实践的各个领域。

本文综述了植物组织培养的应用现状，指出其在雨中和优种块繁等方面的科技支撑作用。

同时概述了有关新技术的开发利用，及应用前景展望。

植物组织培养是从20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。

植物组织培养是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、胚胎、原生质体等，在人工配制的培养基上给予适宜的培养条件，进行繁殖的方法。

由于是在试管内培养，且培养的是脱离植株母体的培养物，故也称离体培养或试管培养。

目前，植物组织培养技术研究已经取得巨大的进展，在观赏植物，如菊花、牡丹、百合等方面有诸多应用。

同时，许多观赏植物已经实现产业化生产，建立了一套相对完善的快繁体系，取得了明显的经济和社会效益。

1 植物组织培养的过程组织培养的技术过程大致分为六步：植物培养材料的采集，培养材料的消毒预处理，制备外植体，接种和培养，根的诱导，炼苗移植。

以上个步骤均在无菌条件下进行。

2 植物组织培养的应用现状2.1 在植物育种方面的应用2.1.1单倍体育种单倍体植株往往不能结实，难以进行繁殖。

在培养中用秋水仙素处理，可使染色体加倍成纯合二倍体。

这种培养技术在育种上的应用多为单倍体育种。

单倍体育种具有高速、高效、基因型一次纯合等优点。

因此，通过花药或花粉的培养的单倍体育种已成为一种新的育种手段。

2.1.2 胚培养采用人工的方法在无菌条件县从种子中将成熟胚和未成熟的胚分离出来，然后放在人工合成的培养基上培养，使它发育成正常的植株，从而有效的克服远缘杂交不亲和的障碍，获得杂种植物。

目前，在这一方面获得成功的自交或远缘杂交不亲和性植物有怀地黄、矮牵牛、普通小麦、黑小麦等。

2.1.3 培养细胞突变体在组织培养过程中，细胞处于不断分生状态，易受培养条件和外界环境（如放射、化学物质）的影响而产生诱变，从中可以筛选出对人们有利的突变体，从而培育新品种。

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第52卷 第5期2024年5月西北农林科技大学学报(自然科学版)J o u r n a l o f N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y(N a t .S c i .E d .)V o l .52N o .5M a y 2024网络出版时间:2023-11-01 13:33 D O I :10.13207/j .c n k i .jn w a f u .2024.05.010网络出版地址:h t t ps ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /61.1390.S .20231031.1639.010君迁子组培体系的建立及优化[收稿日期] 2023-02-27[基金项目] 陕西省创新能力支撑计划项目(2022P T -25);陕西省重点研发计划项目(2022N Y -112) [作者简介] 吕中一(1998-),男,河南南阳人,在读硕士,主要从事果树育种与生物技术研究㊂E -m a i l :l v z h o n g yi @n w s u a f .e d u .c n [通信作者] 杨勇(1964-),男,山西新绛人,研究员,硕士生导师,主要从事柿种质资源研究㊂E -m a i l :y a n g .y o n g521@163.c o m 吕中一,闻家乐,刘泽远,张馨予,胡碧春,范芝蕊,关长飞,杨勇(西北农林科技大学园艺学院,陕西杨凌712100)[摘 要] ʌ目的ɔ建立君迁子(D i o s p yr o s l o t u s L .)组培快繁体系并进行优化,为君迁子组培苗的生产应用提供技术支持及理论依据㊂ʌ方法ɔ以污染率㊁褐化率㊁成活率为考察指标,设置体积分数10%H 2O 2消毒10,20,30m i n 和体积分数2%N a C l O 消毒5m i n +体积分数10%H 2O 2消毒10m i n 4个处理,筛选君迁子外植体适宜的消毒方法;分别以君迁子萌动芽㊁春梢㊁腋芽和休眠芽作为外植体,筛选最合适的外植体材料;分析D KW ㊁(1/2N )M S ㊁1/2M S ㊁M S 培养基对组培苗启动培养的影响,筛选组培苗生长的最适培养基;增殖培养中,激素Z T ㊁6-B A 均设0,1.0,2.0,3.0,4.0m g /L 5个水平,I A A 设0.05,0.1,0.2m g /L 3个水平,筛选组培苗继代增殖最适激素配比;最后分析不同质量浓度I B A (0,1.0,2.0,3.0m g/L )对组培苗生根的影响㊂ʌ结果ɔ君迁子外植体最适的消毒方法为体积分数2%N a C l O 消毒5m i n +体积分数10%H 2O 2消毒10m i n ;最佳外植体材料为萌动芽,其成活率可达60.00%;在(1/2N )M S 培养基上组培苗生长更加健壮,启动培养效果较好;增殖培养最佳的激素配比为3.0m g/L Z T+0.1m g/L I A A ,在此处理下,组培苗2级愈伤占比79.00%,显著高于其余处理,2级和3级株高占比分别为55.33%和44.67%,长势均匀且主茎粗壮,其增殖系数达5.83;君迁子生根培养较为适宜的I B A 质量浓度为1.0m g/L ,生根率可达83.33%㊂ʌ结论ɔ初步建立了较为完整的君迁子组培体系,有助于柿砧木无性系产业化扩繁的推进㊂[关键词] 君迁子;外植体;组织培养;褐化;生根[中图分类号] S 665.3[文献标志码] A[文章编号] 1671-9387(2024)05-0102-08E s t a b l i s h m e n t a n d o p t i m i z a t i o n o f a t i s s u e c u l t u r e a n d r a pi d p r o p a g a t i o n s y s t e m o f D i o s p yr o s l o t u s L .L ÜZ h o n g y i ,W E N J i a l e ,L I U Z e y u a n ,Z H A N G X i n yu ,HU B i c h u n ,F A N Z h i r u i ,G U A N C h a n g f e i ,Y A N G Y o n g(C o l l e g e o f H o r t i c u l t u r e ,N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y ,Y a n g l i n g ,S h a a n x i 712100,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔA t i s s u e c u l t u r e a n d r a p i d p r o p a g a t i o n s y s t e m w a s e s t a b l i s h e d a n d o pt i m i z e d t o p r o v i d e t e c h n i c a l s u p p o r t a n d t h e o r e t i c a l b a s i s f o r t h e p r o d u c t i o n a n d a p p l i c a t i o n o f t i s s u e c u l t u r e s e e d l i n gs o f D i o s p yr o s l o t u s L ..ʌM e t h o d ɔT a k i n g p o l l u t i o n r a t e ,b r o w n i n g r a t e a n d s u r v i v a l r a t e a s i n v e s t i g a t i o n i n -d e x e s ,4t r e a t m e n t s o f 10%H 2O 2di s i n f e c t i o n 10,20a n d 30m i n a n d 2%N a C l O f o r 5m i n c o m b i n e d w i t h 10%H 2O 2fo r 10m i n w e r e i n c l u d e d t o s c r e e n s u i t a b l e d i s i n f e c t i o n m e t h o d s f o r d a t e p l u m e x p l a n t s .W i t h d o r m a n t b u d ,s p r o u t i n g b u d ,s p r i n g s h o o t a n d a x i l l a r y b u d a s e x p l a n t s ,t h e b e s t e x pl a n t m a t e r i a l w a s s c r e e n e d .T h e e f f e c t o f D KW ,(1/2N )M S ,1/2M S a n d M S m e d i u m o n c u l t u r e w a s a n a l yz e d t o s c r e e n t h e o pt i m a l c u l t u r e m e d i u m.I n t h e p r o l i f e r a t i v e c u l t u r e ,h o r m o n e Z T a n d 6-B A a t 5l e v e l s o f 0,1.0,2.0,3.0a n d 4.0m g /L a n d I A A a t 3l e v e l s o f 0.05,0.1a n d 0.2m g /L w e r e u s e d t o o b t a i n t h e o pt i m a l h o r m o n e c o m b i n a t i o n s .T h e e f f e c t s o f I B A (0,1.0,2.0a n d 3.0m g /L )o n t h e r o o t i n g o f t i s s u e c u l t u r e s e e d l i n gsw e r e a l s o s t u d i e d.ʌR e s u l tɔT h e b e s t d i s i n f e c t i o n m e t h o d f o r e x p l a n t s w a s2%N a C l O f o r5m i n w i t h10% H2O2f o r10m i n.T h e b e s t m a t e r i a l w a s b u d d i n g b u d w i t h s u r v i v a l r a t e o f60.00%.T h e(1/2N)M S m e d i-u m h a d a g o o d e f f e c t o n t h e s t a r t-u p c u l t u r e o f t i s s u e c u l t u r e s e e d l i n g s.T h e o p t i m a l h o r m o n e c o m b i n a t i o n i n p r o l i f e r a t i o n c u l t u r e w a s3.0m g/L Z T+0.1m g/L I A A,w i t h t h e g r a d e2h e a l i n g r a t i o o f t i s s u e s e e d-l i n g s o f79.00%,w h i c h w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n o t h e r t r e a t m e n t s.T h e r a t i o s o f g r a d e2a n d3s t r a i n s w e r e55.33%a n d44.67%,r e s p e c t i v e l y,a n d t h e g r o w t h w a s u n i f o r m a n d t h e m a i n s t e m w a s s t r o n g w i t h p r o l i f e r a t i o n c o e f f i c i e n t o f5.83.T h e s u i t a b l e I B A c o n c e n t r a t i o n f o r t h e r o o t i n g c u l t u r e o f D i o s p y r o s l o t u s w a s1.0m g/L,a n d t h e o b t a i n e d r o o t i n g r a t e w a s83.33%.ʌC o n c l u s i o nɔA r e l a t i v e l y c o m p l e t e t i s s u e c u l-t u r e s y s t e m o f D i o s p y r o s l o t u s w a s i n i t i a l l y e s t a b l i s h e d,a n d i t w a s c o n d u c i v e t o t h e i n d u s t r i a l i z a t i o n a n d p r o p a g a t i o n o f p e r s i mm o n r o o t s t o c k c l o n e.K e y w o r d s:D i o s p y r o s l o t u s;e x p l a n t;t i s s u e c u l t u r e;b r o w n i n g;r o o t i n g君迁子(D i o s p y r o s l o t u s L.)属于柿科(E b e n-a c e a e)柿属(D i o s p y r o s L i n n.)植物,又名黑枣㊁软枣㊁野柿子等,可分为有核和无核2大类,原产于中国[1-3]㊂君迁子根系较为发达,耐寒㊁耐瘠薄,生活力强,寿命长,广泛分布于河南㊁河北㊁山东㊁山西㊁陕西等地,是柿树最主要的砧木[3-4]㊂君迁子多采用播种繁育,但效率较低㊁遗传一致性较差㊁出苗不整齐,且无核君迁子没有种子,自然繁殖较慢,因此砧木扩繁问题成为我国柿产业发展的关键影响因素㊂基于此建立及优化君迁子组培快繁体系对我国柿产业发展具有积极的促进作用[5]㊂日本早在1980年就对柿离体快繁技术展开了研究,中国㊁韩国㊁新西兰以及意大利等国家也在近30年对柿组培技术开始了探索,目前世界范围内对柿组培的研究已取得较大进展[6-11]㊂在柿属植物组织培养过程中,易褐化及生根困难是两项关键性难题,目前尚无明确的解决措施[12-14]㊂我国关于君迁子组培快繁体系的研究报道较少,相关学者曾以休眠芽㊁春梢为外植体材料成功建立了君迁子组织培养体系,但依然存在褐化率高㊁外植体成活率低㊁增殖系数较小且生根效率差等问题[14-18]㊂为此,本研究以君迁子为研究对象,设置不同消毒方法㊁外植体材料㊁培养基类型及激素组合处理,以污染率㊁褐化率㊁成活率为参考指标,筛选君迁子组培的初代培养组合,分析不同质量浓度3-吲哚丁酸(I B A)对组培苗生根的影响以及筛选增殖系数较高的激素组合与生根率最佳的激素水平,构建完整的君迁子组培体系,为国内柿产业发展提供理论依据与技术支撑㊂1材料与方法1.1试验材料于2022年3,4,7,12月,分别在西北农林科技大学国家柿种质资源圃采集君迁子萌动芽㊁春梢(春季新梢)㊁腋芽及休眠芽,作为供试材料㊂主要培养基和试剂:M S培养基(P M519-50L)㊁1/2M S培养基(大量元素减半的M S培养基, P M1061-50L)㊁(1/2N)M S培养基(N素减半的M S 培养基,P M1081-50L)㊁D KW培养基(P M1391-50L);聚乙烯吡咯烷酮(P V P;9003-39-8)㊁P V P-40玉米素(Z T;13114-27-7)㊁3-吲哚乙酸(I A A;87-51-4)㊁3-吲哚丁酸(I B A;133-32-4)和6-苄氨基嘌呤(6-B A;1214-39-7)㊂植物激素先进行过滤灭菌,培养基经高温灭菌后,待温度降至60ħ左右,在超净工作台中添加植物激素㊂1.2试验方法1.2.1外植体消毒方法的筛选将采集到的腋芽先用流水冲洗1h(若外植体材料表面污渍较多,冲洗前可在外植体表面洒上适量清洗液),冲洗干净后用吸水纸将表面水分吸干,喷洒体积分数75%酒精后,置于超净工作台,设置体积分数10%H2O2消毒10,20,30m i n,及体积分数2%N a C l O消毒5 m i n+体积分数10%H2O2消毒10m i n,共计4个处理,依次记为A㊁B㊁C㊁D㊂腋芽消毒后接种于含有1.0m g/L Z T+0.1m g/L I A A的(1/2N)M S培养基中㊂每处理30瓶,每瓶1个外植体,重复3次,30 d后统计污染率㊁褐化率和成活率㊂组培瓶中出现细菌及真菌即为污染,计算污染率:污染率=污染外植体数/接种总外植体数ˑ100%㊂外植体表面出现褐色斑点认定为褐化,计算褐化率:褐化率=褐化外植体数/接种总外植体数ˑ100%㊂成活率=成活外植体数/接种总外植体数ˑ100%㊂1.2.2最适启动培养基的筛选将腋芽消毒后分别接种于含有1.0m g/L Z T+0.1m g/L I A A的301第5期吕中一,等:君迁子组培体系的建立及优化D KW㊁(1/2N)M S㊁1/2M S和M S4种培养基中㊂每处理30瓶,每瓶3个外植体,重复3次,30d后统计污染率㊁褐化率和成活率,记录组培苗生长情况㊂1.2.3最佳外植体类型的筛选将采集的萌动芽㊁春梢㊁腋芽㊁休眠芽消毒后,接种于含有1.0m g/L Z T+0.1m g/L I A A的(1/2N)M S培养基中㊂每处理30瓶,每瓶3个外植体,重复3次,30d后统计污染率㊁褐化率和成活率㊂1.2.4增殖培养中Z T和6-B A最佳质量浓度的筛选以继代10次的君迁子组培苗为材料,将诱导出的嫩芽切下,接种于含植物激素的(1/2N)M S培养基中,其中Z T㊁6-B A均设1.0,2.0,3.0,4.0m g/L 4个水平,以不含激素处理为对照(C K)㊂每处理20瓶,每瓶3株,重复3次,45d后观察统计组培苗增殖系数㊁株高㊁愈伤大小及植株长势㊂株高和愈伤大小均分为1~3级,对应的株高和愈伤直径均依次为>0~<1.0c m,ȡ1.0~ɤ2.0c m,>2.0c m㊂增殖系数=增殖后芽数/接种外植体数㊂1.2.5增殖培养中I A A最佳质量浓度的筛选在增殖培养最适Z T和6-B A的基础上,设置3.0 m g/L Z T或2.0m g/L6-B A分别与0.05,0.1,0.2 m g/L I A A组合的处理㊂每处理20瓶,每瓶3株,重复3次,45d后观察统计组培苗增殖系数㊁株高㊁愈伤大小及植株长势㊂1.2.6生根培养中I B A最佳质量浓度的筛选选取在增殖培养基上生长高度超过2c m的组培苗进行生根处理,设I B A为0,1.0,2.0,3.0m g/L4个水平,接种初期进行5d暗培养㊂每处理30瓶,每瓶2株,重复3次,60d后统计生根率㊂1.3君迁子组培苗各阶段的培养条件君迁子在启动培养和增殖培养过程中,培养基中的蔗糖添加量为30.0g/L㊁琼脂添加量为7.0 g/L㊁P V P(酚类物质吸附剂)添加量为0.6g/L;进行生根培养时,蔗糖和琼脂添加量分别降至20.0 g/L及6.0g/L㊂培养基p H值为5.8,恒温25ħ,光照时间14h,光照度2000l x,相对湿度70%㊂1.4数据处理与分析试验数据采用M i c r o s o f t E x c e l2007进行整理统计,用S P S S25.0进行方差分析㊁L S D差异显著性检验及多重比较(P<0.05)㊂2结果与分析2.1君迁子外植体消毒方法的筛选图1表明,不同消毒方法对君迁子外植体的影响存在较大差异㊂用D方法消毒君迁子腋芽的成活率为38.33%,显著高于另外3个处理;C方法消毒效果最好,污染率仅为16.67%,显著低于A㊁B方法,但褐化率却显著高于其余3个处理;A㊁B方法消毒腋芽的污染率较高,成活率显著低于D方法㊂综上可知,君迁子外植体消毒效果越好则褐化率越高,消毒效果越差则污染率越高;用D方法消毒时,外植体的污染与褐化处于相对平衡状态,成活率最高,为君迁子外植体较为适宜的消毒方法㊂A,B,C.体积分数10%H2O2消毒10,20,30m i n; D.体积分数2%N a C l O5m i n+体积分数10%H2O210m i n㊂图柱上标不同小写字母表示同指标不同处理间差异显著(P<0.05)㊂A,B a n d C.D i s i n f e c t i o n w i t h v o l u m e f r a c t i o n10%H2O2f o r10, 20a n d30m i n,r e s p e c t i v e l y;D.V o l u m e f r a c t i o n2%N a C l O f o r5m i n+v o l u m e f r a c t i o n10%H2O2f o r10m i n.D i f f e r e n tl o w e r l e t t e r s i n d i c a t e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e nd i f fe r e n t t r e a t m e n t s a n d i n d i c a t o r s(P<0.05).图1君迁子外植体消毒方法的筛选F i g.1S c r e e n i n g o f d i s i n f e c t i o n m e t h o d s o fD i o s p y r o s l o t u s L.e x p l a n t s2.2君迁子外植体最适启动培养基的筛选不同类型培养基对君迁子腋芽启动培养的影响如表1所示㊂由表1可知,在4种培养基处理下,外植体污染率无显著差异,而褐化率㊁成活率及植株长势存在明显差异㊂其中,以(1/2N)M S培养基的外植体褐化率最低,为43.33%,且成活率明显高于另外3种处理;就植株长势而言,(1/2N)M S培养基处理组培苗也更为健壮,有利于后续增殖培养㊂因此,君迁子启动培养选择(1/2N)M S培养基㊂2.3君迁子最佳外植体类型的筛选由表2可以看出,君迁子不同外植体材料在污染率㊁褐化率及成活率上存在差异㊂君迁子休眠芽的污染率为32.22%,显著高于腋芽;而腋芽的褐化率为43.33%,显著高于萌动芽和春梢㊂整体而言,401西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷以萌动芽的成活率最高,可达60.00%,显著高于休眠芽和腋芽,其次为新梢,成活率为55.55%㊂因此确定君迁子最适外植体类型为萌动芽㊂表1 君迁子外植体最适启动培养基的筛选T a b l e 1 S c r e e n i n g o f o p t i m a l p r i m e m e d i a f o r D i o s p yr o s l o t u s L .e x p l a n t s 培养基类型T y pe of c u l t u r e m e d i u m 污染率/%P o l l u t i o n r a t e褐化率/%B r o w n i n g ra t e 成活率/%S u r v i v a l r a t e植株长势P l a n t g r o w t hD KW 20.00ʃ5.0055.00ʃ3.21a 25.00ʃ5.23a b 叶片黄绿㊁较大且伸展,主茎纤细L e a v e s a r e y e l l o w -g r e e n ,l a r g e a n d s p r e a d i n g,a n d t h e m a i n s t e m i s s l e n d e r (1/2N )M S 18.33ʃ2.8943.33ʃ3.89c 38.33ʃ2.88a 叶片偏绿㊁伸展,主茎健壮L e a v e s g r e e n i s h s t r e t c h i n g ,s t r o n g ma i n s t e m 1/2M S 21.67ʃ5.7845.00ʃ5.01ab 33.33ʃ4.41a b 叶片微黄偏小㊁微卷曲,主茎健壮L e a v e s a r e y e l l o w i s h ,c u r l e d ,a n d t h e m a i n s t e m i sr o b u s tM S26.67ʃ2.8051.67ʃ7.64a b 21.67ʃ7.37c 叶片严重卷曲且部分褐化,主茎存在褐化L e a v e s a r e s e v e r e l y c u r l a n d p a r t i a l l y br o w n a n d a r e b r o w n i n t h e m a i n s t e m注:同列数据后标不同小写字母表示不同处理间差异显著(P <0.05)㊂下表同㊂N o t e :D i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s m e a n s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e a m o n g tr e a t m e n t s (P <0.05).T h e s a m e b e l o w.表2 不同类型君迁子外植体的培养T a b l e 2 E x p l a n t t r e a t m e n t o f d i f f e r e n t t y p e s o f D i o s p yr o s l o t u s L .外植体E x p l a n t 污染率/%P o l l u t i o n r a t e 褐化率/%B r o w n i n g r a t e 成活率/%S u r v i v a l r a t e 萌动芽S p r o u t i n g b u d 24.44ʃ3.85a b 23.33ʃ4.64b 60.00ʃ5.78a 春梢S p r i n g s h o o t 23.33ʃ3.33a b 28.89ʃ1.92b 55.55ʃ3.41a b 腋芽A x i l l a r y b u d 18.33ʃ2.89c 43.33ʃ3.89a 38.33ʃ2.88d 休眠芽S t a t o b l a s t32.22ʃ6.94a32.22ʃ5.10a b48.89ʃ5.09c2.4 Z T 和6-B A 对君迁子组培苗增殖培养的影响由表3可知,与对照相比,不同质量浓度Z T 均可显著提高君迁子组培苗的增殖系数,而不同质量浓度6-B A 处理组培苗的增殖系数与对照无显著差异㊂其中3.0m g/L Z T 处理组培苗增殖系数为5.20,显著高于其余处理;6-B A 处理中则以质量浓度2.0m g/L 时增殖系数最大,为2.87㊂1级株高在Z T 处理下未出现,在6-B A 超过1.0m g/L 时出现;Z T 为3.0m g /L 时,组培苗3级株高占比最高,可达87.33%;6-B A 处理3级株高占比均显著低于Z T 各处理和对照,表明6-B A 对君迁子组培苗主茎生长具有一定的抑制作用,而Z T 可促进君迁子组培苗主茎生长,有利于植株长高㊂表3 Z T 和6-B A 处理对君迁子组培苗增殖培养的影响T a b l e 3 E f f e c t o f Z T a n d 6-B A o n p r o l i f e r a t i o n c u l t u r e o f D i o s p yr o s l o t u s L .t i s s u e c u l t u r e d s e e d l i n g s 处理T r e a t m e n t激素H o r m o n e 质量浓度/(m g ㊃L -1)M a s s c o n c e n t r a t i o n增殖系数M u l t i p l i c a t i o n c o e f f i c i e n t 各级株高占比/%P l a n t h i gh r a t i o o f l e v e l s 123各级愈伤占比/%C a l l u s r a t i o o f l e v e l s123无N o 2.13ʃ0.32d e048.33ʃ4.73c d51.67ʃ4.73c 78.67ʃ5.13a 21.33ʃ5.13c0Z T 1.03.47ʃ0.59b c038.00ʃ4.58d e 62.00ʃ4.58b c 59.67ʃ4.16b 40.33ʃ4.16b02.03.83ʃ0.25b034.00ʃ6.01e66.00ʃ6.01b 58.12ʃ4.51b 41.88ʃ4.51b 03.05.20ʃ0.56a012.67ʃ6.52f87.33ʃ6.52a 34.00ʃ5.57c 66.00ʃ5.57a04.04.17ʃ0.40b 047.67ʃ6.81c d52.33ʃ6.81c7.00ʃ3.01d 71.00ʃ7.21a22.00ʃ4.36a6-B A1.02.08ʃ0.17e63.67ʃ6.03b36.33ʃ6.03d 40.00ʃ8.89c 60.00ʃ8.89a02.02.87ʃ0.35c d 20.33ʃ5.50a 62.00ʃ7.21b17.67ʃ7.51e 82.33ʃ4.93a 17.67ʃ4.93c03.02.65ʃ0.14d e 9.00ʃ1.10b 57.67ʃ7.51b c 33.33ʃ7.02d 77.33ʃ2.52a 22.67ʃ2.52c04.02.40ʃ0.25d e6.33ʃ2.51b 84.67ʃ4.16a9.00ʃ4.58e 79.67ʃ4.51a 20.33ʃ4.51c一般情况下,愈伤越大越有利于组培苗养分的吸收,但柿属植物单宁含量较高,愈伤大时会分泌更多酚类物质,易导致组培苗褐化,进而危害组培苗的生长㊂由表3可知,君迁子组培苗1级愈伤比例在6-B A 为2.0m g/L 时最高,为82.33%;2级愈伤比例在6-B A 为1.0m g /L 及Z T 为3.0和4.0m g/L 时显著高于其余处理,且只有4.0m g/L Z T 处理才出现3级愈伤㊂综合而言,Z T 可促进愈伤组织的发育,而6-B A 则无这种效果,结合各处理组培苗的生长情况(表4)可知,Z T 为3.0m g/L 时组培苗的增殖培养效果最佳,植株叶片呈现健康的翠绿色,主茎长且粗壮㊁分蘖较多;对于君迁子增殖培养而言,Z T501第5期吕中一,等:君迁子组培体系的建立及优化处理效果远优于6-B A (图2)㊂表4 Z T 和6-B A 处理君迁子组培苗的长势情况T a b l e 4 G r o w t h s t a t u s o f D i o s p yr o s l o t u s L .t i s s u e c u l t u r e d s e e d l i n g s t r e a t e d w i t h Z T a n d 6-B A 处理T r e a t m e n t激素H o r m o n e 质量浓度/(m g㊃L -1)M a s s c o n c e n t r a t i o n植株长势P l a n t g r o w t h无N o叶片大且绿,主茎粗壮,无分蘖L e a v e s a r e l a r ge a n d g r e e n ,a n d t h e m a i n s t e m i s t h i c k w i t h o u t t i l l e r Z T1.0叶片微内卷㊁黄绿,主茎较长,分蘖少L e a v e s a r e s l i g h t l y i n v o l u t i o n ,y e l l o w -g r e e n ,t h e m a i n s t e m i s l o n ge r a n d l e s s t i l l e r 2.0叶片伸展㊁黄绿,主茎较长,分蘖多L e a v e s a r e e x t e n d e d ,y e l l o w -g r e e n ,t h e m a i n s t e m i s l o n ge r w i t h m o r e t i l l e r s 3.0叶片翠绿,主茎长且粗壮,分蘖多L e a v e s a r e g r e e n ,t h e m a i n s t e m i s l o n g a n d s t r o n g ,a n d t h e r e a r e m a n y ti l l e r s 4.0叶片小且偏黄㊁易脱落,主茎短,分蘖多L e a v e s a r e s m a l l a n d y e l l o w i s h ,e a s yt o f a l l o f f ,a n d t h e m a i n s t e m i s s h o r t w i t h m o r e t i l l e r s 6-B A1.0叶片黄绿易脱落,主茎纤细,无分蘖L e a v e s a r e y e l l o w -g r e e n a n d e a s y to f a l l o f f ,a n d t h e m a i n s t e m i s s l e n d e r w i t h o u t t i l l e r s 2.0叶片黄绿略有脱落,主茎较短,分蘖少L e a v e s a r e y e l l o w -g r e n s l i g h t l y of f ,t h e m a i n s t e m i s s h o r t e r w i t h l e s s t i l l e r 3.0叶片发黄脱落较多,主茎细短,分蘖少L e a v e s a r e y e l l o w a n d f a l l o f f m o r e ,t h e m a i n s t e m i s s h o r t w i t h l e s s t i l l e r4.0叶片发黄脱落严重,主茎细短,分蘖少L e a v e s a r e y e l l o w a n d f a l l o f f s e r i o u s l y,t h e m a i n s t e m i s s h o r t w i t h l e s s t i l l e rA.3.0m g /L Z T ;B .2.0m g/L 6-B A 图2 Z T 和6-B A 单独处理君迁子组培苗的表型(45d)F i g .2 P h e n o t y p e s o f D i o s p yr o s l o t u s L .t i s s u e c u l t u r e s e e d l i n g s f o r 45d a y s u n d e r Z T a n d 6-B A t r e a t m e n t s 2.5 I A A 对君迁子组培苗增殖培养的影响在最适Z T 和6-B A 条件下,分析I A A 对君迁子组培苗增殖培养的影响,结果见表5㊂表5 Z T ㊁6-B A 与I A A 配施处理对君迁子组培苗增殖培养的影响T a b l e 5 E f f e c t o f Z T ,6-B A a n d I A A a p p l i c a t i o n o n p r o l i f e r a t i o n c u l t u r e o f D i o s p yr o s l o t u s L .t i s s u e c u l t u r e d s e e d l i n g s 处理T r e a t m e n t增殖系数M u l t i p l i c a t i o n c o e f f i c i e n t各级株高占比/%P l a n t h i gh r a t i o o f l e v e l s 123各级愈伤占比/%C a l l u s r a t i o o f l e v e l s1230.05m g/L I A A 4.50ʃ0.40b 045.00ʃ4.00d55.00ʃ4.00a 14.67ʃ2.31d 78.33ʃ1.53a7.00ʃ3.01a3.0m g /L Z T0.1m g /L I A A 5.83ʃ0.35a 055.33ʃ4.51c44.67ʃ4.51b 21.00ʃ2.65d 79.00ʃ2.65a00.2m g/L I A A 4.97ʃ1.00a b 069.33ʃ5.13b30.67ʃ5.13c 36.67ʃ5.86c 63.33ʃ5.86b00.05m g/L I A A 1.97ʃ0.21d 21.00ʃ3.61a 69.67ʃ4.16b 9.33ʃ5.51e 97.00ʃ2.65a 3.00ʃ2.65d 02.0m g/L 6-B A0.1m g /L I A A 2.90ʃ0.20c d 079.00ʃ3.61a 21.00ʃ3.61d 92.67ʃ3.06a 7.33ʃ3.06d 00.2m g/L I A A 2.96ʃ0.15c 061.33ʃ7.16b c 38.67ʃ7.16b c 79.00ʃ3.61b 21.00ʃ3.61c 0表5结果显示,相较于单独使用Z T 和6-B A ,配施0.05m g/L I A A 会一定程度降低组培苗的增殖系数,但随着I A A 质量浓度升高,组培苗增殖系数有所上升㊂3.0m g /L Z T+0.1m g/L I A A 处理对组培苗增殖最有利,增殖系数最高达5.83㊂I A A 与6-B A 搭配使用有利于提升组培苗2级株高占601西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷比,但6-B A 抑制愈伤组织发育的问题仍然存在㊂结合组培苗生长状况(表6)可知,在各处理条件下,Z T 对君迁子组培苗增殖培养的促进效果均远优于6-B A ,且最适组合为3.0m g /L Z T+0.1m g/L I A A ;该处理君迁子组培苗叶片翠绿㊁主茎粗壮,生长状态良好(图3)㊂表6 Z T ㊁6-B A 与I A A 配施处理君迁子组培苗长势情况T a b l e 6 G r o w t h s t a t u s o f D i o s p yr o s l o t u s L .t i s s u e c u l t u r e d s e e d l i n g s t r e a t e d w i t h Z T ,6-B A a n d I A A 处理组合T r e a t m e n t c o m b i n a t i o n植株长势P l a n t g r o w t h3.0m g/L Z T 0.05m g/L I A A 叶片数多㊁黄绿,主茎较粗,分蘖较多T h e n u m b e r o f l e a v e s i s m o r e ,y e l l o w -gr e e n ,t h e m a i n s t e m i s t h i c k e r w i t h m o r e t i l l e r s 0.1m g/L I A A 叶片呈绿色,主茎长且粗壮,分蘖多L e a v e s a r e g r e e n ,t h e m a i n s t e m i s l o n g an d t h i c k w i t h m o r e t i l l e r s 0.2m g/L I A A 叶片微黄绿,主茎长偏纤细,分蘖少L e a v e s a r e y e l l o w i s h -gr e e n ,t h e m a i n s t e m i s s l e n d e r w i t h l e s s t i l l e r s 2.0m g/L 6-B A 0.05m g/L I A A 叶片大㊁黄绿,主茎纤弱,分蘖少L e a v e s a r e l a r g e a n d y e l l o w -g r e e n ,a n d t h e m a i n s t e m i s w e a k w i t h f e w t i l l e r s 0.1m g/L I A A 叶片大㊁黄绿,主茎较粗,分蘖少L e a v e s a r e l a r g e ,y e l l o w -gr e e n ,t h e m a i n s t e m i s t h i c k e r w i t h f e w t i l l e r s 0.2m g/L I A A 叶片伸展㊁黄绿,主茎粗壮,分蘖少L e a v e s a r e e x t e n d e d ,y e l l o w -gr e e n ,a n d t h e m a i n s t e m i s t h i c k w i t h l e s s t i l l e r s A.2.0m g /L 6-B A+0.1m g /L I A A ;B .3.0m g /L Z T+0.1m g/L I A A 图3 6-B A ㊁Z T 与I A A 组合处理君迁子组培苗的表型(45d)F i g .3 P h e n o t y p e s o f D i o s p yr o s l o t u s L .t i s s u e c u l t u r e s e e d l i n g s f o r 45d a y s u n d e r 6-B A ,Z T a n d I A A c o m b i n e d t r e a t m e n t s 2.6 君迁子生根培养的最适I B A 质量浓度筛选用I B A 培养君迁子组培苗60d 后,0,1.0,2.0,3.0m g/L I B A 处理组培苗的生根率分别为32.43%,83.33%,59.67%和55.89%,可知随着I B A 质量浓度的提高,生根率呈现先升高后下降的趋势㊂且1.0m g/L I B A 处理的生根率高于其余处理,对君迁子生根最为有利(图4)㊂A ㊁B .1.0m g/L I B A 处理50d 的组培苗;C .移栽30d 后的组培苗㊂A ,B .T i s s u e c u l t u r e d s e e d l i n g s u n d e r 1.0m g /L I B A t r e a t m e n t f o r 50d ;C .30d a f t e r t r a n s p l a n t i n g o f t i s s u e c u l t u r e d s e e d l i n gs .图4 1.0m g/L I B A 处理下君迁子组培苗的生长情况F i g .4 G r o w t h o f D i o s p yr o s l o t u s L .t i s s u e c u l t u r e d s e e d l i n g s u n d e r 1.0m g /L I B A 701第5期吕中一,等:君迁子组培体系的建立及优化3讨论君迁子组培快繁的关键难题是组培苗褐化,而褐化亦是植物组织培养的三大难题之一,其形成原因主要是酚类物质氧化[19-21]㊂相对于一般木本植物,柿属植物含有更多单宁,因此组培苗褐化现象更严重[11,22]㊂君迁子作为柿属植物,同样面临组培苗褐化严重的问题,目前相关学者主要以在培养基中添加吸附剂(如P V P㊁A C等)解决此问题[14-16,23]㊂本研究发现,不同外植体材料褐化率存在显著差异,同时,消毒方法㊁启动培养基类型对组培苗褐化也存在影响,且以萌动芽为外植体,经体积分数2%N a-C l O5m i n+体积分数10%H2O210m i n消毒后接种于(1/2N)M S培养基进行培养,其褐化现象得到明显缓解㊂君迁子组培常用的外植体为休眠芽,本试验采集了各个时期不同类型的材料,拓宽了君迁子外植体的选择范围㊂柿属植物组培苗在早期培养过程中需要较低的矿质元素,尤其是N素,N素含量过高不利于芽的启动及增殖培养,在柿属植物组培常用的培养基中,N素含量由高到低依次为M S㊁D KW㊁(1/2N)M S[15-17,24]㊂本研究发现,在(1/2N) M S培养基上,君迁子组培苗的生长状况优于其余培养基,这与前人研究结果[25]一致㊂木本植物增殖培养最常用的细胞分裂素为6-B A,但研究发现,6-B A并不适用于柿属植物的组织培养,柿属植物组培最适宜的细胞分裂素为Z T[9]㊂有学者认为,在君迁子继代培养中最适宜的培养基配方为2.0m g/L Z T+0.1m g/L I A A[16];也有学者认为,0.5m g/L Z T+0.1m g/L I A A更有利于君迁子的增殖培养[3]㊂本试验用6-B A㊁Z T搭配I A A处理君迁子组培苗,结果表明,Z T对组培苗的增殖效果远优于6-B A,且以3.0m g/L Z T+0.1 m g/L I A A处理组培苗的增殖系数最高,可达5.83㊂生根是判断组培体系建立完善程度的关键指标,柿属植物普遍存在组培苗生根困难的现象[25-27]㊂生根培养中常选用1/2M S或(1/2N)M S培养基,同时减少培养基中蔗糖及琼脂的含量,降低或去除细胞分裂素,并在初期进行一段时间(3~10d)的暗培养[14-17]㊂柿组培生根常用的植物生长调节剂为I A A㊁I B A和N A A㊂不同柿品种生根所需的条件有较大差异,但在组培初期,大部分柿品种难以生根,因此柿属植物组织培养生根一般在多次继代后进行[27]㊂本试验以继代培养10次以上的组培苗为材料进行生根处理,生根培养中蔗糖添加量为20.0 g/L㊁琼脂添加量为6.0g/L,初期进行5d暗培养,结果显示,1.0m g/L I B A处理组培苗生根率最高,可达83.33%㊂试验前期以继代3次的君迁子组培苗进行生根处理发现,各I B A处理均不能生根,进一步证实柿属植物组培苗需多次继代复幼以后才会有较高的生根率㊂4结论君迁子组培快繁体系最适宜的外植体为萌动芽,用体积分数2%N a C l O5m i n+体积分数10% H2O210m i n消毒,接种于(1/2N)M S培养基进行培养,君迁子外植体的成活率可达60.00%;其增殖培养最适激素配方为3.0m g/L Z T+0.1m g/L I A A,组培苗增殖系数可达5.83;生根培养最适宜的I B A质量浓度为1.0m g/L,生根率可达83.33%㊂[参考文献][1] Y a m a g i s h i M,M a t s u m o t o S,N a k a t s u k a A,e t a l.I d e n t i f i c a t i o no f p e r s i mm o n(D i o s p y r o s k a k i)c u l t i v a r s a n d p h e n e t i c r e l a t i o n-s h i p s b e t w e e n D i o s p y r o s s p e c i e s b y m o r e e f f e c t i v e R A P D a n a l-y s i s[J].S c i e n t i a H o r t i c u l t u r a 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组培快繁创业计划书第一部分：项目背景一、项目简介组培快繁是一种利用植物离体组织在无菌条件下进行培养繁殖的技术，将其应用于植物繁育和种苗繁植领域，以提高植物繁育效率、加速新品种选育、推动绿色种植产业的发展。

我们团队有丰富的植物生物技术和快速繁殖技术经验，准备利用组培快繁技术建立一套完整的植物繁殖体系，为农业生产和园艺种植业提供一揽子解决方案。

二、项目市场需求组培快繁技术作为一种高效的植物繁殖方法，能够快速繁殖大批量高质量的植株，应用广泛。

目前，全球农业生产和园艺种植业对高产、优质、抗性强的新品种需求日益增长。

而传统的种子繁殖和扦插繁殖方法存在繁殖周期长、产量低、品质不稳定等问题。

因此，组培快繁技术作为一种新型的植物繁殖技术，其市场需求十分巨大。

项目的目标市场主要包括各类农作物和园艺植物的种苗繁育企业、大型农场、家庭农场、花卉苗圃、林木苗圃等，这些需要大量高质量植株的客户。

同时，组培快繁技术还可以应用于区域性种植产业和特色农产品的推广，为农业生产提供新的增长点。

第二部分：市场分析一、行业现状目前，我国种苗产业的发展一直受到多个问题的困扰：传统的繁殖方法效率低、繁殖周期长、品质不稳定等，这些问题严重制约了高质量种苗的生产和供应。

而组培快繁技术正是解决这些问题的有效途径。

目前，国内对组培快繁技术的需求增长迅速，许多地方已经开始尝试并推广这种技术。

但由于技术门槛高，运营成本大等原因，导致目前市场上对组培快繁技术服务的供应仍然较为匮乏。

二、市场机会对植物繁殖技术的需求迫切，市场机会巨大。

组培快繁技术可以有效破解传统繁殖方式存在的问题，提高植物繁育效率、缩短繁殖周期、提升产品质量，受到市场的欢迎。

同时，随着人们对绿色食品和优质生活的需求增加，对新品种的追求也日益强烈，这为组培快繁技术提供了广阔的市场空间。

三、市场竞争目前，虽然国内对组培快繁技术的需求增长迅速，但市场上供应商相对匮乏，技术服务水平参差不齐。

而在国外，欧美等发达国家对组培快繁技术的研究和应用比较成熟，他们在这一领域的积累和推广也领先于国内。

欧李优系组培快繁技术研究1. 引言1.1 研究背景植物组培快繁技术是一种通过离体培养方式，利用植物的再生能力进行快速繁殖的技术方法。

在农业生产和科研领域，快速繁殖经济作物和珍贵植物种类具有重要的应用价值。

欧李优系组培快繁技术是一种全新的繁殖技术，具有独特的优势和潜力。

当前，植物资源日益枯竭，而利用组培快繁技术可以快速大批量地繁殖珍贵植物，在一定程度上缓解了植物资源的紧缺状况。

研究欧李优系组培快繁技术具有重要的现实意义。

随着科技的进步和人工智能技术的不断发展，组培快繁技术在植物繁殖领域扮演着越来越重要的角色。

以欧李优系为代表的组培快繁技术，具有操作简单、效率高、繁殖快速等优势，受到了广泛的关注和应用。

通过对欧李优系组培快繁技术的深入研究，可以为我国农业生产提供更多的优质种苗资源，推动植物繁殖领域的发展，为构建美丽乡村和生态环境做出贡献。

开展对欧李优系组培快繁技术的研究具有重要的意义。

1.2 研究目的研究目的是为了探索欧李优系组培快繁技术在植物生长和繁殖过程中的应用潜力，以及为植物种质资源的保护与利用提供新的途径。

通过对该技术的深入研究和实践应用，可以提高植物繁殖速度，促进植物品种的保存和更新，加快新品种选育的进程，为农业生产提供更加快捷、高效的技术支持。

研究目的还包括探索欧李优系组培快繁技术在解决植物疾病、害虫和环境胁迫等方面的应用潜力，为改善农作物产量和品质提供一种新的方法和技术支持。

通过深入研究欧李优系组培快繁技术，可以更好地理解其工作原理，并为其在农业生产和植物科学研究领域的应用奠定理论基础。

1.3 研究意义欧李优系组培快繁技术的研究意义主要体现在以下几个方面：该技术能够大幅提高植物繁殖效率，加快繁殖周期，节省时间和成本。

通过组培快繁技术，可以在较短的时间内获得大量健康的植株，满足市场需求，并为种植业的发展提供支持。

欧李优系组培快繁技术可以有效克服传统繁殖方法中存在的病虫害传播、资源浪费等问题，保证繁殖过程的纯净性和稳定性。