转PuP5CS基因烟草对低温胁迫的生理响应_徐博

低温诱导胁迫下不同烟草品种电导率及抗氧化酶活性的变化尹航;王欣亚;金大翔;万悦;朴世领【摘要】为筛选抗寒烟草品种,选择具有代表性的6种烟草品种为试材,研究了低温诱导胁迫下烟草叶片的相对电导率、半致死温度、抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量等生理生化指标的变化规律.结果表明:随着低温胁迫的加剧相对电导率呈递增趋势,6种烟草的半致死温度由大到小依次为云烟87、NC95、建平大人头、吉烟九号、漂河一号和延晒七号;随着温度的下降抗氧化酶活性均呈先增长后下降的趋势,抗氧化酶活性增幅越大或降幅越低,则抗寒性越强,增幅由大到小依次是延晒七号、漂河一号、吉烟九号、建平大人头、NC95和云烟87;随着低温胁迫加剧MDA含量也呈先升高后下降趋势,且各烟草品种含量达到峰值的温度有所差异,其峰值越早或增幅越大,则抗寒性越弱.其中,云烟87在8℃时达到峰值且增长幅度最大,NC95和建平大人头均在6℃时达到峰值且增长幅度次之,而延晒7号、漂河1号和吉烟9号均较晚,在4℃时达到峰值,且增长幅度均较低.结合烟草叶片相对电导率、半致死温度、抗氧化酶活性和MDA含量生理生化指标的表现来看,延晒7号、漂河1号抗寒能力较强;吉烟9号、建平大人头抗寒性中等;云烟87和NC95抗寒能力较弱.【期刊名称】《延边大学农学学报》【年(卷),期】2018(040)001【总页数】7页(P46-52)【关键词】低温胁迫;抗氧化酶;MDA;半致死温度;烟草【作者】尹航;王欣亚;金大翔;万悦;朴世领【作者单位】延边大学农学院,吉林延吉133002;延边大学农学院,吉林延吉133002;延边大学农学院,吉林延吉133002;延边大学农学院,吉林延吉133002;延边大学农学院,吉林延吉133002【正文语种】中文【中图分类】S572低温胁迫是植物体受到胁迫的一种，容易导致农作物细胞内生理生化指标失衡，急剧胁迫下更会导致农作物死亡从而减产，是除土壤成分和水成分以外农作物生长与产量的另一个重要影响因素[1]。

植物对低温胁迫的感知与利用机制研究低温是植物生长发育过程中的一个重要环境因素，对于植物的生存和适应具有重要影响。

过去的研究中发现，植物能够感知到低温胁迫并启动相应的适应机制，以保护自身免受低温的损害。

本文将探讨植物对低温胁迫的感知与利用机制的研究进展。

一、感知机制1. 温度感受蛋白研究发现，植物中存在许多与温度感应相关的蛋白质。

其中一个重要的蛋白质是冷感受器（cold sensor），它能够感知到环境的低温信号并转导到植物细胞内，从而启动一系列的应答反应。

2. 磷脂信号通路磷脂信号通路在植物的低温应答中起着重要的作用。

当植物受到低温胁迫时，磷脂信号通路能够被激活，并引导植物细胞产生一系列与低温适应有关的物质和蛋白质。

二、利用机制1. 冷适应蛋白冷适应蛋白是植物在低温环境中产生的一类特殊蛋白质。

这些蛋白质能够改变植物细胞的代谢途径和构建细胞膜的物理性质，从而增强植物对低温胁迫的适应能力。

2. 非编码RNA近年来的研究表明，非编码RNA在低温胁迫应答中起着重要的作用。

这些RNA分子能够调控植物基因表达的过程，并帮助植物适应低温环境。

3. 生长素调控生长素是植物生长发育的重要激素，它在植物对低温胁迫的应答中也发挥着重要的作用。

研究发现，生长素能够调节植物的细胞伸长、根系发育等过程，从而帮助植物适应低温环境。

三、未来展望虽然我们已经取得了一些对植物对低温胁迫感知与利用机制的研究进展，但仍有许多问题需要进一步探索。

例如，植物对不同温度的感知和适应机制是否存在差异？低温胁迫对植物生长发育的影响是否会随着时间的延长而增加？未来的研究可以通过综合运用生物学、生物化学和分子生物学等研究手段，深入探究这些问题。

总之，植物对低温胁迫的感知与利用机制研究为我们了解植物的适应能力和生存策略提供了重要线索。

通过对这些机制的深入研究，我们可以为农业生产和环境保护提供科学依据，同时也为植物遗传改良和育种提供新思路和方法。

希望未来能够有更多的科学家致力于这一领域的研究，为人类和地球的可持续发展做出更大的贡献。

植物生长对温度胁迫的生理与分子机制研究随着全球气候变暖的加剧，温度胁迫对植物生长和发育的影响日益引起关注。

温度胁迫对植物造成的生理和分子机制变化是导致植物适应性降低和产量减少的重要原因之一。

因此，深入了解植物生长对温度胁迫的生理和分子机制对于提高植物抗逆性和农作物产量具有重要的理论和实践意义。

温度胁迫会导致植物产生一系列生理响应，包括叶绿素含量、老化和凋落、呼吸作用、光合作用和叶片膜透性的变化。

研究表明，温度胁迫影响光合作用的速率、光系统Ⅱ的活性以及氮代谢和光合底物供应等过程。

另外，温度胁迫还引起了植物细胞的离子失衡、蛋白质降解、DNA和脂质氧化等损伤。

在分子层面上，温度胁迫引起的信号通路主要包括拟南芥中的热激蛋白（HSPs）突变、拟南芥低温响应基因（LTI）的激活以及拟南芥热激蛋白通路（HSP90-HSF1）的启动。

热激蛋白在温度胁迫下被激活，并参与蛋白质的折叠和降解。

低温响应基因LTI的激活则有助于植物在高温环境下保持正常生长和发育。

此外，HSP90-HSF1的启动也参与温度胁迫信号的传导，并调节抗逆相关基因的表达。

研究还发现，温度胁迫通过抑制植物激素的合成和信号传导来影响生长和发育。

例如，温度胁迫下，拟南芥中ABA（脱落酸）的合成和作用被抑制，导致植物发育受到抑制。

而在其他一些植物如水稻和玉米等中，温度胁迫会增加ABA的合成和释放，从而实现植物对温度胁迫的适应。

最近的研究还发现，温度胁迫会导致植物基因表达的变化，包括转录因子和调控基因的表达水平的改变。

通过RNA测序技术，研究人员发现在温度胁迫下，大量基因表达发生变化，这些基因与囊泡运输、细胞壁合成、底物转运和DNA甲基化等生物过程密切相关。

此外，温度胁迫还会通过DNA甲基化的改变来影响植物基因表达模式。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，研究人员发现在温度胁迫下，一些甲基化酶的活性发生变化，并导致基因的DNA甲基化水平的改变。

这些变化会进一步影响植物基因的表达和功能。

植物低温胁迫响应及研究方法进展随着全球气候的变化，低温胁迫成为制约植物生长和发育的重要因素之一。

植物为了应对低温压力，会产生一系列的生理和分子响应，以维持正常的生长和发育。

因此，深入研究植物低温胁迫响应机理是非常必要的。

植物低温胁迫响应机理的研究可分为以下几个方面：低温信号的识别、转导途径、基因调控及相关代谢物的积累。

目前，研究者主要通过分析寒冷条件下不同级别激素的变化、信号转导途径、基因表达水平、蛋白质组学、代谢物组学等方法来探究植物低温胁迫响应机制。

低温信号的识别是低温胁迫响应机制的第一步，该过程中植物通过感受寒冷刺激后，产生一系列内部信号以应对低温压力。

研究发现，植物低温信号的产生可能与细胞壁的重构、钙离子代谢、膜蛋白的变化有关。

例如，低温条件下细胞壁的蛋白酶活性增强，导致细胞壁重构，这种重构有助于植物细胞对低温的适应。

此外，低温条件下细胞膜可能会通过脂类组分的变化来改变其性质，从而影响低温信号转导的过程。

低温信号的转导途径是低温胁迫响应机制的中心环节，它是将低温信号转化为植物的生理和分子响应的重要过程。

研究表明，低温信号的传递可能通过钙离子、激酶/磷酸酯酶等信号分子来实现。

例如，当植物感受到低温刺激时，可以通过抑制钙离子泵来使细胞内钙离子浓度升高，从而引起一系列生理和分子响应。

此外，丝氨酸/苏氨酸激酶家族（MAPK）在低温胁迫响应中也起到了重要的作用，这些信号分子可以通过激活下游的转录因子和RNA水平调控基因表达。

基因调控是植物低温胁迫响应机制的核心环节之一，它是将低温信号转化为植物的生理和分子响应的关键过程。

研究表明，低温条件下植物会启动大量基因表达的调控，这些基因调控可以分为直接和间接响应两种。

直接响应基因是指在低温条件下直接被激活或抑制的基因，而间接响应基因则是指不直接响应低温的基因，但是在低温胁迫下被其他的基因调控所影响。

此外，研究还发现，一些基因在低温条件下会发生表观遗传的改变，包括DNA甲基化和组蛋白乙酰化等过程。

干旱胁迫诱导下植物基因的表达与调控X杜金友 陈晓阳X X李伟 高琼(北京林业大学林木花卉遗传育种与基因工程实验室,北京 100083)摘 要: 干旱胁迫能够诱导植物表达大量的基因,研究这些基因的表达与调控,为植物抗旱的定向育种创造条件。

本文系统介绍了在干旱胁迫条件下,植物体内渗透调节物质和可溶性糖合成有关的基因、离子和水分通道及Lea 蛋白基因的表达,以及与这些基因表达相关的调控元件和因子,干旱胁迫信号转导等方面的最新研究进展。

关键词: 植物 干旱胁迫 基因表达调控 信号传导Expression and Regulation of Genes Induced byDrought Stress in PlantDu Jinyou Chen Xiaoyang X X Li Wei Gao Qiong(Kay Laboratory f or Genetic imp rovemen t in Tr e es and Or namental p lants ,M OE ,BeijingForestry Univers ity ,Beijing 100083)A bstra ct : Understanding expression and Regulation of numerous genes induced by drought str ess will be help to broaden the possibilities for genetically engineering plants.Here we try to give an overview of t he gene expression pro 2gr ammes that are triggered by drought stress or dehydration,with particular reference to the regulation of their expression and single tr ansduct ion of dr o ught or dehydr at ion.K e y words : Plant Drought stress Gene expr ession and regulation Single transduction干旱是影响植物生长和发育的主要环境因子之一。

烟草低温胁迫下的转录组和代谢组整合分析
近年来，烟草抗逆基因研究越来越受到重视，因其在农作物逆境下生长和发育
方面至关重要。

本研究旨在解析烟草在低温胁迫下的转录组和代谢组表达调控模式。

研究人员采集了烟草叶片的RNA样品，分流并结合低温胁迫和相关的代谢产物，使用高通量测序平台对整个基因组进行了测序分析。

研究发现，烟草的低温胁迫调节转录组上游的代谢变化。

低温胁迫分为“能量代谢”、“benzene/aromatic芳香
族化合物代谢”、“nitrogen/磷氮元素代谢”、“salt/离子代谢”和“antioxidant/抗氧化物质代谢”几大类下的294个代谢途径，其中乙酰乙醇、羟基乙醇、乙醇酰乙醛等几个关键代谢途径受到低温胁迫调节。

研究还发现，低温胁迫引起烟草转录组表达调控的表达模式主要存在四种类型：一类从高到低表达相关基因，表明低温胁迫可以抑制关键的代谢途径；另一类从低到高表达相关基因，表明低温胁迫可以加强相应的介质代谢；第三类是非活性的叶肉质基因的表达调节；最后的一类是与膜蛋白的细胞信号转导有关的调节。

总体来讲，低温胁迫会引起烟草转录组和代谢组表达模式的变化，进而影响烟草低温逆境下的生长和发育。

综上所述，这项系统研究显示，烟草低温胁迫下的转录组和代谢组的表达调控
机制的深度解析，可以提供不断完善的烟草抗逆基因研究，有助于烟草作物对低温环境的抗逆性基因选择。

植物低温胁迫响应及研究方法进展植物是一类复杂的生物体，它们在生长发育过程中会受到各种内部和外部环境的影响。

温度是植物生长发育中一个至关重要的环境因素，而植物低温胁迫则是指植物在遭受低温环境下所产生的生理和生化变化。

随着气候变化的加剧，植物低温胁迫已经成为了制约植物生长发育和产量的重要环境因素之一。

对植物低温胁迫响应及其研究方法的不断深入，对于揭示植物在低温环境下的生理生化机制，提高植物抗低温胁迫能力，以及培育耐低温植物品种等方面具有重要意义。

植物低温胁迫响应及其研究方法的进展主要包括以下几个方面：一、植物对低温胁迫的生理生化响应1. 低温胁迫对植物生长发育的影响：低温胁迫对植物生长发育产生着广泛而复杂的影响，包括抑制生长、妨碍营养物质的吸收和运输、影响叶绿素合成和光合作用等。

低温胁迫还会引发植物细胞膜的脂质过氧化，导致细胞膜的损伤和渗漏。

2. 低温胁迫对植物生理生化过程的影响：低温胁迫会改变植物的代谢通路和酶活性，导致能量代谢和物质合成的紊乱，影响植物的正常生理生化过程。

低温胁迫还会引发氧化应激反应，导致活性氧的产生和积累。

3. 低温胁迫对植物的信号传导及适应机制：植物在受到低温胁迫时会产生一系列的信号传导通路，触发一系列的适应性反应。

这些反应包括适应性蛋白的合成、抗氧化酶的活化、活性氧的清除等，帮助植物更好地适应低温环境。

1. 生物学方法：生物学方法是研究植物低温胁迫响应的常用方法之一。

通过对植物在低温胁迫下的形态结构、生理生化过程以及产生的适应性变化进行观察和分析，可以揭示植物在低温环境下的生理生化机制。

4. 遗传工程方法：遗传工程方法是利用转基因技术，通过引入特定基因或调控基因表达，提高植物对低温胁迫的抗性。

通过对植物抗低温相关基因进行克隆、表达和功能研究，可以揭示植物应对低温胁迫的分子机制，为培育具有抗低温性状的植物品种提供理论依据。

三、植物低温胁迫响应研究的前景与挑战在植物低温胁迫响应及其研究方法的研究中，已取得了一系列重要的成果。

第52卷 第5期2024年5月西北农林科技大学学报(自然科学版)J o u r n a l o f N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y(N a t .S c i .E d .)V o l .52N o .5M a y 2024网络出版时间:2023-11-01 12:13 D O I :10.13207/j .c n k i .jn w a f u .2024.05.014网络出版地址:h t t ps ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /61.1390.S .20231031.1645.013桂花O fW R K Y 120基因鉴定及盐胁迫响应功能研究[收稿日期] 2023-03-02[基金项目] 国家自然科学基金面上项目(32071828);江苏高校优势学科建设工程资助项目 [作者简介] 宰舟颖(1999-),女,安徽天长人,在读硕士,主要从事园林植物遗传育种研究㊂E -m a i l :a z d z w y36@163.c o m [通信作者] 杨秀莲(1970-),女,浙江诸暨人,教授,博士,主要从事园林植物生理和栽培应用研究㊂E -m a i l :x l y @n jf u .e d u .c n 宰舟颖1,王柳1,丁卉芬1,杨展栋1,王良桂1,2,岳远征1,杨秀莲1(1南京林业大学风景园林学院,江苏南京210037;2南方现代林业协同创新中心,江苏南京210037)[摘 要] ʌ目的ɔ根据前期基因家族鉴定分析得到O f W R K Y120,对该基因盐胁迫响应的功能进行分析,为桂花盐胁迫下的调控机制研究奠定基础㊂ʌ方法ɔ利用生物信息学方法对O f W R K Y120保守结构域㊁系统进化进行分析,并采用q R T -P C R 技术研究盐胁迫下O f W R K Y 120在桂花叶片中的相对表达量㊂构建O f W R K Y 120超表达载体,使用亚细胞定位㊁酵母自激活检测等探究其特性,将该基因瞬时转化本氏烟草后,对烟草进行盐处理,利用D A B ㊁N B T 染色和相关生理指标的测定,解析瞬时转化O f W R K Y 120对本氏烟草耐盐性的影响㊂ʌ结果ɔO f W R K Y120基因全长为1422b p ,编码474个氨基酸,存在WR K Y s u p e r f a m i l y 保守结构域㊂盐胁迫能够激活桂花叶片中O f-W R K Y 120的表达,在72h 时相对表达量最高,与对照有显著差异㊂亚细胞定位结果表明,O f WR K Y 120定位于细胞核㊂酵母自激活结果显示O f WR K Y 120无自激活活性㊂盐胁迫后,O f W R K Y120瞬时过表达植株的超氧阴离子(O -㊃2)和脯氨酸含量显著高于空载对照,且D A B 和N B T 染色表现出更深的颜色㊂本氏烟草中的q R T -P C R 结果显示,O f W R K Y120显著降低了N b C A T 的表达,而显著提高了N b P 5C S 1㊁N b P 5C S 2和N b P 5C R 的表达㊂ʌ结论ɔO f W R K Y120过表达增加了盐胁迫下本氏烟草中活性氧(R O S )的含量,导致植物对盐胁迫的敏感性提高㊂[关键词] 桂花;O f W R K Y120基因;盐胁迫;抗逆育种[中图分类号] S 685.13[文献标志码] A[文章编号] 1671-9387(2024)05-0144-11I d e n t i f i c a t i o n a n d s a l t s t r e s s r e s po n s e o f O f W R K Y 120g e n e i n O s m a n t h u s f r a gr a n s Z A I Z h o u y i n g 1,WA N G L i u 1,D I N G H u i f e n 1,Y A N G Z h a n d o n g 1,WA N G L i a n g gu i 1,2,Y U E Y u a n z h e n g 1,Y A N G X i u l i a n 1(1C o l l e g e o f L a n d s c a p e A r c h i t e c t u r e ,N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y ,N a n j i n g ,J i a n gs u 210037,C h i n a ;2C o -I n n o v a t i o n C e n t e r f o r S u s t a i n a b l e F o r e s t r y ,N a n j i n g ,J i a n gs u 210037,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔA c c o r d i n g t o p r e v i o u s g e n e f a m i l y i d e n t i f i c a t i o n a n a l ys i s ,a WR K Y g e n e o f O s -m a n t h u s f r a g r a n s n a m e d O f WR K Y120w a s o b t a i n e d a n d t h e r e s p o n s e t o s a l t s t r e s s w a s a n a l y z e d t o p r o -v i d e b a s i s f o r f u r t h e r a n a l y s i s o f t h e r e g u l a t o r y me c h a n i s m u n d e r s a l t s t r e s s .ʌM e t h o d ɔT h e c o n s e r v e d d o -m a i n a n d p h y l o g e n e t i c s of O f WR K Y120w e r e a n a l y z e d b y b i o i n f o r m a t i c s m e t h o d s ,a n d q R T -P C R w a s u s e d t o a n a l y z e t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n o f O f WR K Y 120i n O .f r a gr a n s l e a v e s u n d e r s a l t s t r e s s .A s u p e r -e x p r e s -s i o n v e c t o r o f O f WR K Y120w a s c o n s t r u c t e d a n d s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n a n d a u t o a c t i v a t i o n d e t e c t i o n w e r e c a r r i e d o u t t o e x p l o r e t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e g e n e .T h e e f f e c t o f O f WR K Y120o n s a l t t o l e r a n c e w a s a n a -l y z e d b y t r e a t i n g N i c o t i a n a b e n t h a m i a n a w i t h s a l t ,d e t e r m i n i n g r e l e v a n t p h y s i o l o gi c a l i n d e x e s ,a n d p e r -f o r m i ng D A B&N B T s t a i n i n g.ʌR e s u l tɔTh e O f WR K Y120g e n e w a s1422b pi n l e n g t h,e n c o d i n g474a m i-n o a c i d s w i t h a c o n s e r v e d WR K Y s u p e r f a m i l y.S a l t s t r e s s a c t i v a t e d t h e e x p r e s s i o n o f O f WR K Y120i n O.f r ag r a n s,a n d th e r e l a ti v e e x p r e s s i o n w a s t h e h i g h e s t a t72h w i t h s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m t h e c o n t r o l. 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o f r e a c t i v e o x yg e n s p e c i e s(R O S)i n N.b e n th a mi a n a u n d e r s a l t s t r e s s a n d i m p r o v e d s e n s i-t i v i t y o f p l a n t s t o s a l t s t r e s s.K e y w o r d s:O s m a n t h u s f r a g r a n s;O f WR K Y120g e n e;s a l t s t r e s s;b r e e d i n g f o r s t r e s s t o l e r a n c e土壤盐碱化是限制植物生长与分布最主要的环境因素之一,易溶性盐分在土壤表层积累,达到胁迫程度时会造成植物氧化胁迫㊁离子失衡以及营养流失等一系列问题,进而损害植物的细胞㊁组织和器官,阻碍植物生长,从而导致植物生物量锐减㊂桂花(O s m a n t h u s f r a g r a n s)是四季常绿㊁集园林观赏与经济效益于一体的著名香花树种㊂我国盐碱化土地分布广泛,盐碱化土壤严重影响桂花的生长㊂目前桂花研究主要集中在花香[1-2]㊁花色[3-4]上,但有关调控盐胁迫分子机制的研究较少㊂WR K Y蛋白根据WR K Y结构域的数量和锌指结构的类型分为3组,其中具有2个WR K Y域的属于Ⅰ类,具有一个WR K Y域,且锌指结构C2-H2属于Ⅱ类,Ⅲ类WR K Y蛋白具有一个WR K Y域,锌指结构C2-H C[5]㊂目前已经在许多物种中发现了WR K Y转录因子家族[6-8],其成员通过调控渗透胁迫㊁活性氧系统等途径参与胁迫响应[9-11]㊂模式植物拟南芥中已经鉴定出74个WR K Y基因家族成员,这些基因参与调控多种非生物胁迫,其中A t-WR K Y25和A t WR K Y33双突变体对N a C l敏感,并且任何一方的过表达都赋予了植物对盐胁迫的耐受性[12]㊂盐胁迫下,过表达小麦T a WR K Y93能够通过加强渗透调节等途径来提高植物耐盐性[13]㊂来自棉花的G h WR K Y39基因则是参与多种信号通路调节活性氧系统,正向调控植物对盐胁迫的反应[14]㊂V v WR K Y30在调节活性氧清除和渗透物质积累中都发挥了作用,因此具有显著提高植物盐胁迫抗性的功能[15]㊂另外,WR K Y也可以激活下游与植物抗逆性相关的功能基因,从而间接参与植物盐胁迫调控,如在拟南芥中过表达Z mWR K Y33可以激活胁迫诱导基因R D29A表达,提高植物的耐盐性[16]㊂另外,一些WR K Y转录因子负调控植物耐盐性,增加植物对盐的敏感度㊂例如玉米Z m-WR K Y17作为一个负调控因子参与盐胁迫响应[17]㊂棉花G h WR K Y17通过增加植物细胞活性氧的产生来提高植物对盐胁迫的敏感性[18]㊂与野生型相比,C mWR K Y17转基因拟南芥中抗逆相关基因的相对表达量减少,表明菊花C mWR K Y17作为抑制因子参与植物对盐胁迫的响应[19]㊂虎茎蓼的WR K Y转录因子P c WR K Y33通过下调应激相关基因的诱导和增加细胞R O S水平,降低了转基因拟南芥的耐盐性[20]㊂现有的桂花耐盐研究大多集中于盐胁迫下不同桂花品种的生长与生理特性分析[21],也有研究发现O f G T3/42/46可以提高烟草的耐盐性[22]㊂桂花的O f S P L11基因通过促进生长和减少氧化损伤增强拟南芥对盐的耐受性[23]㊂但是目前对于桂花WR K Y基因在盐胁迫响应机制中的功能研究尚未见报道㊂本研究将桂花O f WR K Y120瞬时转化本氏烟草,分析其在盐胁迫下的功能,期望为桂花的抗逆育种提供潜在基因资源㊂1材料与方法1.1试验材料桂花材料为四季桂品种日香桂2年生扦插苗,盐处理采用含有250mm o l/L N a C l的1/2霍格兰氏营养液浸泡,对照(C K)为1/2霍格兰氏营养液浸泡,分别于处理后0,6,24,72h采样㊂本氏烟草(N i c o t i a n a b e n t h a m i a n a)种子于南京林业大学风景园林学院分子实验室保存㊂亚细胞定位材料和瞬时转化材料均为30d苗龄的本氏烟草,生长条件为14h光/10h暗,光照强度150μm o l/(m2㊃s),温度541第5期宰舟颖,等:桂花O f W R K Y120基因鉴定及盐胁迫响应功能研究23ħ,相对湿度60%~70%㊂p S u p e r1300表达载体㊁P19辅助载体和p-G B K T7载体,均由南京林业大学风景园林学院分子实验室保存;大肠杆菌T r e l i e f T M5α感受态细胞,购于擎科公司;根癌农杆菌菌株G V3101,购于唯地公司;R N A快速提取试剂盒,购于艾德莱公司;反转录试剂盒,购于全式金公司㊂过氧化氢测试盒和超氧阴离子测试盒,购于苏州科铭生物技术有限公司㊂1.2 O f WR K Y120生物信息学分析以课题组前期的日香桂转录组数据为基础,通过权重基因共表达网络分析,在与盐胁迫高度相关的模块中,根据基因表达量挑选出一个WR K Y候选基因,根据桂花WR K Y基因家族分析[1]的命名方法将其命名为O f WR K Y120㊂在N C B I网站(h t t p s://w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/)中的b l a s t p 对O f WR K Y120氨基酸序列的同源蛋白进行检索,获得其他物种的W R K Y同源序列,将这些序列在D N A M A N中进行多重比对分析㊂从T A I R网站中获取拟南芥W R K Y基因家族成员的氨基酸序列,在M E G A10软件中构建进化树,进化树的构建采用邻接法(n e i g h b o r-j o i n i n g),b o o t s t r a p重复设置为1000㊂1.3O f WR K Y120的克隆与表达载体的构建剪取生长健壮的日香桂叶片,在液氮中研磨后用R N A快速提取试剂盒提取总R N A,然后按照反转录试剂盒的步骤进行反应㊂反应体系为2ˑT S 反应混合液10μL,O(D T)18引物1μL,g D N A酶1μL,混合酶1μL,总R N A7μL㊂反应程序为42ħ30m i n;85ħ5s㊂反应结束后得到c D N A,产物保存在-80ħ冰箱㊂从全基因组数据中获得桂花O f WR K Y120基因序列,O f WR K Y120基因全长克隆引物见表1㊂以日香桂叶片的c D N A作为模板进行P C R扩增,设置3个退火温度梯度(58,59,60ħ),经1.2%琼脂糖电泳检测后选择长度正确且亮度较高的目的条带切胶回收㊂用H i n dⅢ和S m aⅠ内切酶对p S u p e r1300表达载体双酶切使其线性化,将O f WR K Y120目的片段和载体的回收产物连接后转化大肠杆菌T r e l i e f T M5α感受态细胞,挑取单菌落进行P C R检测并送至斯普金公司测序,将测序正确的大肠杆菌提取质粒,然后利用冻融法转化农杆菌G V3101,P C R鉴定确保最终使用的农杆菌单菌落条带正确㊂未连接目的片段的p S u p e r1300空载体质粒转化农杆菌G V3101作为空载体对照㊂转化p S u p e r1300-O f WR K Y120和空载体的农杆菌菌液均保存于-80ħ冰箱㊂1.4农杆菌介导的瞬时遗传转化取200μL转入了p S u p e r1300-O f WR K Y120融合载体和空载体的农杆菌菌液,于20m L含k a n a 的液体L B培养基中振荡培养至菌液O D600为0.6~0.8,离心,倒去上层液体,保留菌体,加入助侵染液(150μm o l/L乙酰丁香酮,10mm o l/L吗啉乙磺酸,10mm o l/L M g C l2)重悬,调整O D值至0.6,目的基因和空载对照分别与p19辅助载体1ʒ1混合,室温避光静置3h,用1m L规格针管将上述菌液从叶片背面注射入本氏烟草㊂1.5 O f WR K Y120蛋白的亚细胞定位分析首先使用W o L F P S O R T预测O f WR K Y120蛋白的亚细胞定位,然后参照农杆菌介导的瞬时遗传转化法注射本氏烟草,瞬时转化后的本氏烟草暗培养10h,接着正常培养2d,D A P I室温避光条件下染色10m i n,清水漂洗2~3次后用纸巾吸干表面水分,使用激光共聚焦显微镜观察㊂1.6 O f WR K Y120蛋白的酵母自激活分析根据O f WR K Y120基因序列设计引物(表1),使用日香桂c D N A作为模板,构建p G B K T7-O f-WR K Y120重组质粒并转化至A H109酵母感受态细胞中,对照为未连接目的基因的p G B K T7载体质粒转化酵母㊂待含有重组载体和空载体的酵母长出后,选取菌检正确的单菌落稀释成5个梯度(100, 10-1,10-2,10-3,10-4),并点于S D/-T r p㊁S D/ -T r p-A d e和S D/-T r p-A d e+X-α-g a l缺素培养基上,30ħ倒置培养3~5d,观察并记录结果㊂1.7盐处理转O f WR K Y120基因烟草的染色及相关指标测定待本氏烟草生长30d,挑选长势一致的烟草植株,采用农杆菌介导的瞬时转化法,将含有p S u-p e r1300-O f WR K Y120重组质粒和空载体对照(E V)的菌液注射入烟草叶片,注射后暗培养8h,然后正常条件下生长2d后,用500mm o l/L盐水处理(浇灌植株),每盆浇水300m L,处理24h后采样,设置3组重复,每组4株植株㊂相对电导率测定取鲜样,其余样品液氮速冻后于-80ħ保存㊂过氧化氢(H2O2)含量和超氧阴离子(O-㊃2)含量测定分别采用过氧化氢测试盒和超氧阴离子测试盒㊂丙二醛(M D A)含量测定采用硫代巴比妥酸法[24],过氧化物酶(P O D)活性测定采用愈创木酚法[24],过氧化氢酶(C A T)活性测定采用紫外吸收法[24],脯氨酸含量和相对电导率测定参考文献[25]641西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷的方法㊂超氧化物㊁H 2O 2和M D A 染色分别用四唑氮蓝(N B T )㊁二氨基联苯胺(D A B )和S c h i f f 溶液进行目视检测[26]㊂选择500mm o l /L 盐处理24h 后的转基因植株相同部位的叶片,用N B T 和S c h i f f 溶液浸渍烟草叶片2h 或D A B 溶液浸渍本氏烟草叶片8h ,然后在90ħ无水乙醇中脱色30m i n㊂1.8 盐胁迫后本氏烟草的实时荧光定量分析以瞬时转化O f WR K Y120基因并经过盐胁迫处理后的本氏烟草叶片c D N A 稀释10倍后作为模板,对照为转p S u p e r 1300空载的本氏烟草c D N A ㊂O f WR K Y120在本氏烟草中瞬时过表达后,根据烟草中生理数据测定的结果,用q R T -P C R 检测抗逆相关的功能基因(N b P 5C S 1㊁N b P 5C S 2㊁N b P 5C R ㊁N b P O D 和N b C A T )是否被诱导表达,引物见表1,利用2-ΔΔC t阈值比较法计算基因的相对表达量㊂表1 本研究中的引物碱基序列T a b l e 1 B a s e s e q u e n c e s o f p r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d y引物用途P r i m e r a p pl i c a t i o n 引物名称P r i m e r n a m e引物序列(5'ң3')P r i m e r s e qu e n c e (5'ң3')O f WR K Y120基因的全长克隆F o r f u l l -l e n g t h c l o n i n g o f O f WR K Y120g e n e S 1300-FS 1300-RA A C G C T T T A C A G C A A G A A C G G A A T G T A G G T C A G G G T G G T C A C G A G G G TWR K Y 120-F c a a a t c g a c t c t a g a a a gc t t A T G G C T -G C T T C T T C A G G A A G T C WR K Y 120-Rt a t t t a a a t g t c g a c c c c g g g G C T C G A G A -G A G C A T A G A G T T T A T T G A 酵母转录自激活A u t o n o m o u s t r a n s c r i pt i o n a l a c t i v a t i o n T 7T A A T A C G A C T C A C T A T A G G G 3B DT T T T C G T T T T A A A A C C T A A G A G T C A T 7-WR K Y 120-F a g g c c g a a t t c c c g g g g a t c c A T G G C T -G C T T C T T C A G G A A G T C T 7-WR K Y 120-Rg g t t a t g c t a g t t a t g c g g c c g c G C T C G A -G A G A G C A T A G A G T T T A T T G A R A N -FA G A A C C G A C A G G T G A A G G C A A 桂花中q R T -P C R 分析的基因G e n e s f o r q R T -P C R a n a l y s i s i n O .f r a gr a n s R A N -R T G G C A A G G T A C A G A A A G G G C T q WR K Y 120-F A C C C A A C A A T C A A C A T C A C C C q WR K Y 120-R T A A A C C A G G T G G A A T A G C G A A G N b a c t i n -F A T C C T C A C A G A G C G T G G T T A C N b a c t i n -R C A C T G A G C A C T A T G T T T C C G T N b P 5C S 1-F A T C T T G A T G G C A A G G C T T G T G C T G N b P 5C S 1-R A A G C T G A G C T G A G G T T A C G T C C A A N b P 5C S 2-F C C T G T T C T T G G T C A T G C T G A T G G T 烟草中q R T -P C R 分析的基因G e n e s f o r q R T -P C R a n a l ys i s i n N .b e n t h a m i a n a N b P 5C S 2-R G C A T T G C A G G C T G C T G G A T A A T C A N b P 5C R -F T G G A G A A G G C T G G A T T T C G T G G T A N b P 5C R -R T T C C G G C T G G T C C A C C A C T T A N b P O D -F A G G C T C A G G G G A C A A C A A C T N b P O D -R T C A C A A A A T C A G T G G C G A A A N b C A T -F C A C A G C C A C G C T A C T C A A G A C N b C A T -RC C A C C C A C C G A C G A A T A A A G1.9 数据分析表型统计㊁叶片化学染色和q R T -P C R 均进行3次生物学重复㊂桂花盐胁迫后O f WR K Y 120在叶片中的表达分析采用单因素方差分析,其他数据使用S P S S 24软件进行独立样本t 检验㊂用E x c e l 进行数据分析,A d o b e P h o t o s h o p CS 5软件用于绘图㊂2 结果与分析2.1 O f WR K Y 120生物信息学分析通过基因克隆获得O f WR K Y 120,其包含1个全长为1422b p 的完整开放阅读框,编码474个氨基酸㊂N C B I 分析结果(图1)显示,O f WR K Y 120具有2个保守结构域,属于Ⅰ型WR K Y 转录因子㊂通过N C B I 蛋白数据库搜索到与桂花O f WR K Y 120氨基酸序列相似的同源氨基酸分别来自欧洲油橄榄(O l e a e u r o p a e a v a r .s yl v e s t r i s ,X P _022863407.1)㊁泡桐(P a u l o w n i a f o r t u n e i ,K A I 3450269.1)㊁中果咖啡(C o f f e a c a n e ph o r a ,C D P 04081.1)㊁蓝果树(N ys s a s i n e n s i s ,K A A 8549473.1)㊁洋紫荆(B a u -h i n i a v a r i e ga t a ,K A I 4305373.1)㊁狭叶油茶(C a -m e l l i a l a n c e o l e o s a ,K A I 7984300.1)㊁中华猕猴桃(A c t i n i d i a c h i n e n s i s v a r .C h i n e n s i s ,P S S 09530.1)㊁夏威夷棉(G o s s y p i u m t o m e n t o s u m ,T Y H 81112.1)㊁君迁子(D i o s p yr o s l o t u s ,X P _052210128.1)和木豆(C a j a n u s c a ja n ,X P _020226257.1)㊂多序列比对结果(图2)表明,桂花O f WR K Y 120氨基酸与欧洲油橄榄WR K Y 氨基酸的相似性最高,为83.71%,而与木豆WR K Y 氨基酸的相似性最低,741第5期宰舟颖,等:桂花O f W R K Y120基因鉴定及盐胁迫响应功能研究仅为61.2%㊂进一步构建系统发育树,结果(图3)显示,桂花O f WR K Y 120与欧洲油橄榄WR K Y 亲缘关系最近㊂图1 O f WR K Y 120保守结构域F i g.1 O f WR K Y 120c o n s e r v e d d o m a in X P _022863407.1.欧洲油橄榄;K A I 3450269.1.泡桐;C D P 04081.1.中果咖啡;K A A 8549473.1.蓝果树;K A I 4305373.1.洋紫荆;K A I 7984300.1.狭叶油茶;P S S 09530.1.中华猕猴桃;T Y H 81112.1.夏威夷棉;X P _052210128.1.君迁子;X P _020226257.1.木豆㊂深蓝色背景表示图上物种100%的氨基酸序列相同,粉色表示(100%,75%]氨基酸序列相同,浅蓝色表示(75%,50%]氨基酸序列相同,<50%氨基酸序列相同则不涂色㊂X P _022863407.1.O l e a e u r o p a e a v a r .s y l v e s t r i s ;K A I 3450269.1.P a u l o w n i a f o r t u n e ;C D P 04081.1.C o f f e a c a n e ph o r a ;K A A 8549473.1.N y s s a s i n e n s i s ;K A I 4305373.1.B a u h i n i a v a r i e ga t a ;K A I 7984300.1.C a m e l l i a l a n c e o l e o s a ;P S S 09530.1.A c t i n i d i a c h i n e n s i s v a r .C h i n e n s i s ;T Y H 81112.1.G o s s y p i u m t o m e n t o s u m ;X P _052210128.1.D i o s p y r o s l o t u s ;X P _020226257.1.C a j a n u s c a ja n .D a r kb l u e b ac k g r o u nd i n d i c a te s t h a t 100%of t h e s e q u e n c e s a r e i d e n t i c a l ,p i n k m e a n s t h a t (100%,75%]o f t h e s e qu e n c e s a r e t h e s a m e ,l i g h t b l u e m e a n s t h a t (75%,50%]o f t h e s e qu e n c e s a r e t h e s a m e ,a n d b e l o w 50%i t i s n o t c o l o r e d .图2 O f WR K Y 120与其他物种氨基酸序列比对结果F i g .2 A m i n o a c i d s e q u e n c e a l i g n m e n t b e t w e e n O f WR K Y 120a n d o t h e r s pe c i e s 841西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷将O f WR K Y120氨基酸序列与模式植物拟南芥(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a)的Ⅰ类WR K Y基因家族成员构建系统进化树,结果(图4)发现,O f-WR K Y120与拟南芥A t WR K Y25㊁A t WR K Y26㊁A t WR K Y33同源性较高,其中与A t WR K Y26最相近㊂图3 O f WR K Y120与其他物种WR K Y蛋白的系统进化树F i g.3 P h y l o g e n e t i c t r e e o f O f WR K Y120a n d WR K Y p r o t e i n s f r o m o t h e r s p e c i e sA t WR K Y s代表拟南芥Ⅰ类WR K Y氨基酸序列㊂A t WR K Y s r e p r e s e n t A r a b i d o p s i s c l a s s I WR K Y a m i n o a c i d s e q u e n c e s.图4 O f WR K Y120与拟南芥Ⅰ类WR K Y氨基酸序列的系统进化树F i g.4 P h y l o g e n e t i c t r e e o f O f WR K Y120a n d WR K Y c l a s sⅠs u b f a m i l y a m i n o a c i d s e q u e n c e o f A.t h a l i a n a2.2盐胁迫下O f WR K Y120基因在桂花叶片中的表达将日香桂2年生扦插苗在盐胁迫下处理0,6, 24,72h,检测O f WR K Y120基因在盐胁迫下的相对表达量,结果(图5)显示,盐胁迫处理72h后O f-WR K Y120的相对表达量显著高于其他处理时间及对照(C K),表明该基因在盐胁迫处理72h后被激活表达㊂2.3 O f WR K Y120蛋白的亚细胞定位和酵母自激活验证利用本氏烟草叶片对O f WR K Y120-G F P融合蛋白在细胞中的定位情况进行分析,在激光共聚焦显微镜下观察(图6A)发现,过表达O f WR K Y120的烟草细胞核有绿色荧光信号,并且与D A P I荧光染料的蓝色荧光信号基本重合,表明O f WR K Y120蛋白定位在细胞核上㊂图柱中不同小写字母表示不同处理时间之间以及与对照之间差异显著(P<0.05)㊂D i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n d i f f e r e n t p r o c e s s i n g t i m e s a n d i n c o m p a r i s o n w i t h c o n t r o l(P<0.05).图5盐胁迫下O f W R K Y120基因在桂花叶片中的相对表达量F i g.5 E x p r e s s i o n O f W R K Y120i n O.f r a g r a n sa f t e r s a l t s t r e s s941第5期宰舟颖,等:桂花O f W R K Y120基因鉴定及盐胁迫响应功能研究O f WR K Y 120酵母转录自激活结果(图6B )显示,O f WR K Y 120::pG B K T 7和阴性对照均能在S D /-T r p 缺陷型培养基上生长,但是在S D /-T r p-A d e 缺陷型培养基上均无法生长,并且两者都无法使X -α-ga l 变蓝㊂说明O f WR K Y 120无转录自激活活性㊂35S ::G F P 为空载对照,B D ::pG B K T 7为阴性对照㊂35S ::G F P e m p t y v e c t o r ,B D ::p G B K T 7n e ga t i v e c o n t r o l .图6 O f WR K Y 120蛋白亚细胞定位(比例尺=50μm )(A )和酵母转录自激活验证(B )结果F i g .6 S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n (B a r =50μm )(A )a n d a u t o n o m o u s t r a n s c r i pt i o n a l a c t i v a t i o n (B )o f O f WR K Y 1202.4 转O f WR K Y120基因烟草的染色及相关生理指标表现由图7可以看出,瞬时转化O f WR K Y120的烟草植株可以表达桂花O f WR K Y 120基因,而转化空载体的植株未表达,瞬时转化烟草中均可以表达内参基因,证明O f WR K Y120成功地转入本氏烟草中㊂D A B ㊁N B T 和S c h i f f 化学染色通常用于分析植物中的过氧化氢㊁超氧阴离子和M D A 的变化[26]㊂由图8A 可以看出,D A B 和N B T 染色后,O f-WR K Y 120过表达转基因烟草叶片较对照都表现出更深的颜色,但是S c h i f f 染色后两者无明显差异㊂M.M a r k e r ㊂N b a c t i n 是本氏烟草的内参基因㊂M.M a r k e r .N b a c t i n i s a n i n t e r n a l r e f e r e n c e g e n e o f N .b e n t h a m i a n a .图7 空载体(L 1,L 2,L 3)和O f W R K Y120(L 4,L 5,L 6)瞬时转化本氏烟草的表达分析F i g .7 E x p r e s s i o n a n a l y s i s o f e m p t y v e c t o r (L 1,L 2,L 3)a n d O f W R K Y120(L 4,L 5,L 6)i n t r a n s i e n t l y tr a n s f o r m e d N .b e n t h a m i a n a 051西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷由图8B-D 可以看出,过表达O f WR K Y120烟草植株的过氧化氢㊁超氧阴离子和M D A 含量均较对照增加,并且超氧阴离子较对照差异极显著㊂说明相较于空载体对照,瞬时转化O f WR K Y 120的本氏烟草中积累了更多活性氧㊂A.D A B ㊁N B T 和S c h i f f 溶液对盐处理后本氏烟草叶片染色;B ㊁C 和D .本氏烟草中过氧化氢㊁超氧阴离子㊁丙二醛含量的测定㊂E V 表示瞬时转化空载体的本氏烟草,O f WR K Y 120表示瞬时转化桂花O f WR K Y 120基因的本氏烟草㊂**表示差异极显著㊂A.D A B ,N B T a n d S c h i f f s o l u t i o n s t a i n i n g o f N .b e n t h a m i a n a l e a v e s a f t e r s a l t t r e a t m e n t ;B ,C a n d D.D e t e r m i n a t i o n o f h y d r o ge n p e r o x i d e ,s u p e r o x i d e a n i o n a n d m a l o n d i a l d e h y d e c o n t e n t s i n N .b e n t h a m i a n a .E V (e m p t y v e c t o r )r e pr e s e n t s i n s t a n t a n e o u s t r a n s f o r m a t i o n o f p S u p e r 1300,O f WR K Y120r e p r e s e n t s N .b e n t h a m i a n a w i t h t r a n s i e n t t r a n s f o r m e d O .f r a g r a n s O fWR K Y 120g e n e .**i n d i c a t e s s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e .图8 转基因烟草盐胁迫后的D A B ㊁N B T 和S c h i f f 染色以及相关生理指标表现F i g .8 D A B ,N B T a n d S c h i f f s t a i n i n g o f t r a n s ge n i c N .b e n t h a m i a n a af t e r s a l t s t r e s s a n d d e t e c t i o n o f r e l a t e d p h y s i o l o gi c a l i n d e x e s 由图9可以看出,与空载体对照相比,盐胁迫后O f WR K Y120过表达转基因植株的脯氨酸含量㊁P O D 活性和相对电导率均表现出上升趋势,其中脯氨酸含量和P O D 活性较对照差异显著或极显著,而C A T 活性呈现下降趋势,但差异不显著㊂2.5 O f WR K Y120在烟草中异源瞬时表达后的实时荧光定量分析从生理指标测定可以看出脯氨酸含量与过氧化物酶活性发生了显著变化,因此通过q R T -P C R 分析脯氨酸合成途径基因(N b P 5C S 1㊁N b P 5C S 2㊁N b P 5C R )㊁过氧化物酶基因(N b P O D )和过氧化氢酶基因(N b C A T )在瞬时过表达O f WR K Y 120和空载体对照烟草中的相对表达量,结果(图10)显示,过表达O f WR K Y120的烟草植株,N b P 5C S 1㊁N b P 5C S 2㊁N b P 5C R 和N b P O D 的相对表达量显著高于对照,而N b C A T 的相对表达量显著低于对照㊂151第5期宰舟颖,等:桂花O f W R K Y120基因鉴定及盐胁迫响应功能研究*表示差异显著(P <0.05);**表示差异极显著(P <0.01)㊂下同㊂*i n d i c a t e s s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.05)a n d **i n d i c a t e s v e r y s i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.01).T h e s a m e b e l o w.图9 盐胁迫下瞬时转化O f W R K Y120和E V 株系的脯氨酸含量㊁相对电导率及P O D 和C A T 活性F i g .9 P r o l i n e c o n t e n t ,r e l a t i v e e l e c t r i c a l c o n d u c t i v i t y ,P O D a c t i v i t y a n d C A T a c t i v i t y o f O f W R K Y120t r a n s ge n i c a n d E V p l a n t s af t e r s a l t t r e a t m e nt 图10 转基因烟草盐胁迫后的抗逆相关基因表达分析F i g .10 E x p r e s s i o n a n a l ys i s o f r e s i s t a n c e -r e l a t e d g e n e s i n t r a n s ge n i c t o b a c c o af t e r s a l t s t r e s s 3 讨 论WR K Y 转录因子参与多种信号途径,是植物许多生物学过程中的关键调控因子[27]㊂桂花中共鉴定出154个WR K Y 基因家族成员[1]㊂本研究的O f WR K Y120有2个WR K Y 保守结构域,属于Ⅰ型WR K Y 转录因子,与欧洲油橄榄同源性最高㊂对菊花的研究发现,WR K YⅠ类成员D g WR K Y 5在盐胁迫下表达上调,通过增强R O S 清除和诱导抗逆基因上调表达参与对盐胁迫的抵御[28]㊂拟南芥中与O f WR K Y120相似性最高的Ⅰ类WR K Y 基因A t WR K Y 25㊁A t WR K Y 26和A t WR K Y 33受低温和高盐的诱导[29],并且可以正向调节乙烯激活蛋白和热休克蛋白信号通路之间的合作,在植物耐热性中发挥协同作用[30]㊂本研究发现,桂花O f WR K Y120受到盐胁迫显著诱导,因此推测该基因在盐胁迫中发挥功能㊂本研究亚细胞定位的结果显示,O f -WR K Y 120定位于细胞核,酵母自激活结果表明O f WR K Y 120无自激活活性,说明该基因在细胞核内发挥作用,可能通过与其他基因互作来发挥功能㊂活性氧是植物体内的信号代谢分子,包括超氧阴离子和过氧化氢等,当活性氧过量时胞内稳态受到严重破坏,影响植物正常生长[31]㊂本研究中,D A B 和N B T 染色后,O f WR K Y120过表达转基因烟草叶片较空载体对照均表现出更深的颜色,同时超氧阴离子含量极显著高于对照,H 2O 2含量有升高趋势,说明O f WR K Y 120过表达转基因植株中活性氧含量较高㊂C A T 是植物体内有效清除R O S 的抗氧化酶,在植物应对非生物胁迫时起关键作用[32]㊂本研究中,盐胁迫后转基因烟草C A T 活性较对照降低,这可能导致过氧化氢清除效率下降造251西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷成活性氧的积累㊂有研究发现P O D含量与植物木质素合成有正相关关系,老化的组织中含有更多的P O D[33]㊂本研究发现,P O D活性较对照极显著升高,推测转基因植株在盐胁迫条件下加快了叶片变黄㊁老化进度,因此植物组织中合成更多P O D以应对逆境㊂脯氨酸一般被认为是植物细胞质内的渗透调节物质,在植物抗氧化方面起着积极作用,与未受胁迫的植物相比,胁迫下脯氨酸积累水平通常显著增加[34]㊂但是在盐胁迫下研究发现,高盐浓度长时间处理后,损伤更严重植株的脯氨酸含量更高[35],干旱研究中也有类似发现[36]㊂推测本研究中植物在遭遇严重胁迫时,O f WR K Y120过表达转基因植株较对照对盐胁迫更为敏感,受到更严重的胁迫危害,因此在组织中积累了更多的脯氨酸,其中具体机理还需要进一步研究㊂植物在盐胁迫时,转录因子会激活或抑制抗逆相关功能基因的表达,例如O s WR K Y54通过与O s-H K T1启动子W-b o x m o t i f区域结合对耐盐基因O s HK T1的表达进行调控,提高了水稻耐盐性[37]㊂O f G T3/42/46诱导R O S相关基因N b A P X表达增加,正向调控了烟草的耐盐性[22]㊂过表达C a C P1的转基因烟草在盐胁迫后耐盐能力减弱,并且抗盐相关基因N t NHX1和N t S O S1的表达量显著低于野生型[35]㊂本研究中,转基因植株的N b P5C S1㊁N b P5C S2㊁N b P5C R和N b P O D的相对表达量显著或极显著高于对照,而N b C A T的相对表达量显著低于对照,与相关生理指标的测定结果一致,说明过表达O f WR K Y120在基因水平对本氏烟草响应盐胁迫产生了调控作用㊂综上所述,桂花O f WR K Y120基因受到盐胁迫诱导,瞬时过表达该基因能够增加本氏烟草活性氧的积累,提高植物对盐胁迫的敏感性㊂[参考文献][1] D i n g W J,O u y a n g Q X,L i Y L,e t a l.G e n o m e-w i d e i n v e s t i g a-t i o n o f WR K Y t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i n s w e e t o s m a n t h u s a n d t h e i r p o t e n t i a l r e g u l a t i o n o f a r o m a s y n t h e s i s[J].T r e e P h y s i o l-o g y,2020,40(4):557-572.[2]施婷婷,杨秀莲,王良桂.3个桂花品种花香组分动态特征及花被片结构解剖学观测[J].南京林业大学学报(自然科学版), 2020,44(4):12-20.S h i T T,Y a n g X L,W a n g L G.D y n a m i c c h a r a c t e r i s t i c s o f f l o-r a l f r a g r a n c e c o m p o n e n t s a n d a n a t o m i c a l o b s e r v a t i o n o f t e p a l s t r u c t u r e i n t h r e e o s m a n t h u s c u l t i v a r s[J].J o u r n a l o f N a n j i n gF o r e s t r y U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n),2020,44(4):12-20.[3] C h e n H G,Z e n g X L,Y a n g J,e t a l.W 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植物对盐胁迫的响应、调控和适应机理胡灵芝;胡江琴;王利琳;张栩佳;陈哲皓【摘要】盐胁迫是世界范围内限制作物产量和农业生产的主要非生物胁迫.探索盐胁迫对植物的影响,研究并利用植物的耐盐机制,选育和开发耐盐作物品种,对于更合理有效地利用有限的耕地具有重要的研究和应用价值.从降低盐胁迫的损伤程度,建立内部渗透平衡和钠离子内稳态,调控自身生长状态这三个方面综述了最新的植物耐盐机制,旨在为进一步推动耐盐作物选育、加快盐土地开发提供参考.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2015(054)001【总页数】7页(P1-7)【关键词】植物;盐胁迫;响应;调控;适应【作者】胡灵芝;胡江琴;王利琳;张栩佳;陈哲皓【作者单位】杭州师范大学生命与环境科学学院,杭州310036;杭州师范大学生命与环境科学学院,杭州310036;杭州师范大学生命与环境科学学院,杭州310036;杭州师范大学生命与环境科学学院,杭州310036;杭州师范大学生命与环境科学学院,杭州310036【正文语种】中文【中图分类】Q948.113在阻碍植物正常生长发育的逆境条件中，盐胁迫是最严重的非生物胁迫之一。

根据联合国粮食及农业组织提供的数据，2005年全世界共有3.97亿hm2的土地受到盐胁迫影响，到2008年受影响的土地已经增加到了8亿hm2，而到2010年，这一数值已达到 9.5 hm2，接近全世界地表面积的 10%［1－3］。

在遭受盐胁迫的土地中，农业用地中的灌溉地受到的影响尤其巨大，统计数据表明全世界约有50%的灌溉地受其影响［3］。

盐胁迫对全球土地的影响越来越严重，包括处于干旱和半干旱状态的土地长期积累的大量盐分，沿海地区土壤中由于雨水和风等自然因素增加的盐分等［4］。

而除此之外，不合理的开荒和灌溉等人为因素也严重造成了农业用地中盐含量的增加［2］。

植物受到盐胁迫的严重影响，土壤中过多的盐分和因此产生的高离子浓度农业用水均会影响植物正常的代谢和生长发育，减少作物的经济产量［5］。