生化试验技术

实验一基因的PCR扩增技术一、实验目的与原理简介聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。

因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。

常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。

通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。

二、复性。

降低温度使DNA单链分子同引物结合。

温度为55℃，时间1min。

三、延深。

升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。

同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。

经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。

PCR反应包含的七种基本成分：1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg.2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。

3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。

每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。

4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。

Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。

5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。

在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。

一、实验目的1. 掌握血糖测定的原理和方法。

2. 熟悉血糖测定仪器的操作流程。

3. 了解血糖在人体代谢中的重要性。

二、实验原理血糖测定是通过检测血液中的葡萄糖浓度来评估血糖水平。

常用的血糖测定方法有葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法和葡萄糖氧化酶-氧电极法等。

本实验采用葡萄糖氧化酶法进行血糖测定。

葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖与氧气反应生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的催化下分解为水和氧气，氧气在电极上还原，产生电流，电流大小与葡萄糖浓度成正比。

三、实验设备与试剂1. 实验设备：血糖测定仪、微量移液器、移液管、一次性采血针、酒精棉球、消毒液等。

2. 实验试剂：葡萄糖氧化酶试剂盒、葡萄糖标准品、蒸馏水等。

四、实验步骤1. 标准曲线绘制（1）准备标准溶液：将葡萄糖标准品用蒸馏水稀释成不同浓度的标准溶液。

（2）按照试剂盒说明书设置血糖测定仪，将标准溶液分别加入测定管中。

（3）开启血糖测定仪，依次测定各标准溶液的血糖浓度，记录数据。

（4）以葡萄糖浓度为横坐标，测定值为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 血糖测定（1）用酒精棉球消毒采血部位，用一次性采血针对准静脉，待血液流出后，用消毒液消毒采血针。

（2）用微量移液器吸取适量血液，加入测定管中。

（3）按照试剂盒说明书设置血糖测定仪，将测定管放入测定仪中。

（4）开启血糖测定仪，待测定仪显示血糖浓度后，记录数据。

五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制绘制标准曲线，得到线性方程：y = 0.0037x + 0.0035，R² = 0.9987。

2. 血糖测定本次实验测得血糖浓度为4.5 mmol/L。

六、实验讨论1. 本实验采用葡萄糖氧化酶法进行血糖测定，操作简便、快速，准确性较高。

2. 在实验过程中，要注意控制操作误差，如准确配制标准溶液、正确设置测定仪等。

3. 血糖测定对于糖尿病等疾病的诊断和治疗具有重要意义，本实验有助于加深对血糖测定原理和方法的理解。

生化分离与分析的实验技术生化分离与分析，是指对复杂的生物体或某个生物组织中的分子或化学物质进行分离、提取、纯化和鉴定的过程。

分析化学中的分离和定量方法主要是采用物理和化学方法，而生化技术则依靠生物化学和分子生物学等多个学科的综合应用，以分离和鉴定生物体内代谢物、大分子化合物、酶、蛋白质、细胞等物质。

生化分离技术包括电泳、色谱、相转移等，分析技术包括质谱分析、核磁共振分析、光谱分析等。

生物医学的许多研究都要求对复杂的生物体或其组织中的某些分子或化学物质进行分离、提取、纯化和鉴定，从而为治疗某些疾病和疾病的诊断提供依据。

电泳技术是目前最常用的生化分离技术之一，通过直流电场和各种形式的凝胶中蛋白质、核酸和碳水化合物的电泳分离，不仅可以分析分子量大小，还可以确定它们的化学性质。

不同种类的凝胶（聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等）结合不同的分离手段（水平凝胶电泳、垂直凝胶电泳等）可以突显不同的生物学特性，为生物医学研究提供了基础。

色谱技术是一种自动化的分离技术，根据物质在特定固相材料上的不同亲和性，可将物质分为各个组分，一般用于化合物和蛋白质的分离和纯化。

水相与有机相的组合使用，可有效地降低样品的复杂度。

现在已经广泛应用于代谢产物、生物大分子的分离和分析中，其中最为常见的是高效液相色谱技术（HPLC）。

相转移或者液相液相萃取（LLE）是从有机溶液或水溶液中提纯物质的常用方法。

它通常涉及相对互不相容的溶剂对溶液的添加和倾倒，通过可控制的酸、碱、盐等添加而将目标物至于有机溶剂的一层中，防止其溶入水相。

这是许多蛋白质，抗生素和生物分子分离和纯化过程中的一个重要步骤。

质谱是分析和鉴定化合物结构和化学反应的技术，通过通过分析离子在加速电场中运动的质量和质量-电荷比，以评估化合物结构。

因此，它是新药物在药理学领域中的发展所必需的技术。

质谱技术已经广泛用于发现新药物、生物标识物和蛋白质翻译后修饰等方面的研究。

在定量上，核磁共振（NMR）和光谱学（UV/Vis，荧光等）是最常用的技术之一。

生化实验五大技术一.分光光度技术1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。

而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。

2.基本原理:（图1-1光吸收示意）透光度T=It/lo吸光度A=lg(lo/ I1)朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLcK 为吸光率，L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度(mol/L)]摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为I.cm 的吸光度。

c=A/ε3. 定量分析:(1)标准曲线(工作曲线)法(2) 对比法元-KCLCxS SX X S X S X S X C A A C C C L KC L KC A A *,===即(3)计算法: e=A/ε(4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀)(5) 多组分湖合物测定4.技术分类分子吸收法&原子吸收法:可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法；5.应用方向有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法二电脉技术1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行脉动。

使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。

2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。

v=Q/6xrη3.影响电泳迁移率的因素:电场强度电场强度大，带电质点的迁移率加速溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗4:技术分类:自由电泳(无支持体)区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压)，博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等5. 电泳分析常用方法及其特点:小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳⑴醋酸纤维素薄膜电泳①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现的“拖尾”现象②分离理应快，电泳时间短③样品用最少:④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球蛋白)⑵玻脂糖凝胶电泳①琼脂糖凝胶孔径较大，对般蛋白质不起分子筛作用②琼脂糖凝胶弹性差，不适含管状电泳------用于等电液鱼、免疫电话、血清脂蛋白等蛋白质电脉，以及DNA、RNA、核苷酸的分析(3)聚丙烯肤胶凝胶电泳①可调节孔径大小②机械强度好，有弹性③分辨率高，用途广④无电涉----------用于不同分子量蛋白质的电泳分离⑶ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳该种电泳使蛋白分子相对迁移率R的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子a的标准蛋白的对数和相对迁移所作的标准曲线中求出供试品的分子量----------最常用定性分析蛋白质的电脉方法，特别用于蛋白质纯度检测&分子量制定⑷等电聚焦电泳技术利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质---------由于其分辨率可达 0.01pH单位，因此特别适合于分离分子相近而等电点不同的蛋白质组分。

生理生化实验技术的原理与应用生理生化实验技术是研究生命体系中各种生理生化现象的基础和手段，它包括了很多方面的知识，如细胞生物学、分子生物学、生物化学、生态学等。

本文将就生理生化实验技术原理和应用方面做一个简要介绍。

一、生理生化实验技术的原理1、细胞培养技术细胞培养是生命科学中最重要的实验技术之一，它是一种基于体外条件下生物体细胞的文化技术，能够提供大量具有特定形态、功能和分化状态的细胞，为细胞生命现象的研究和临床治疗提供了重要手段。

2、分子克隆技术分子克隆技术是对DNA分子进行切割和重组的过程，它切割出所需的基因片段进行重组，形成新的DNA序列。

分子克隆技术是现代生命科学中最具有影响力的技术之一，它不仅可以揭示DNA序列中的基因、启动子等元件，还能够对基因进行修饰、克隆和重组等。

3、蛋白质分离技术蛋白质分离是研究蛋白质物质结构和功能的重要手段，它基于蛋白质的理化性质，利用质量、电荷、亲和性等差异进行分离，能够纯化出需要的蛋白质。

4、蛋白质测序技术蛋白质测序是分离蛋白质后进一步分析其氨基酸序列的方法，能够揭示蛋白质结构和功能，为新药物开发和疾病诊断提供了可靠的数据。

现代科技的进步使得蛋白质测序技术更加精确和高效。

二、生理生化实验技术的应用1、基础研究生理生化实验技术是现代生物学基础研究中不可或缺的手段。

它能够揭示生命现象的根本规律和机制，如DNA复制、蛋白质合成和分泌以及信号传导等。

2、药物研发药物研发的关键是了解药物在生物体内的作用机制和代谢路径，而生理生化实验技术能够提供药物作用靶点、药物代谢途径等重要数据，并为药物研发提供了细胞活性、分子结构鉴定和药效评价等对策。

3、疾病诊断生理生化实验技术在诊断疾病方面扮演着不可替代的角色，例如免疫诊断技术能够检测出某些感染性疾病的抗体或抗原，PCR技术则能够检测出某些遗传性疾病的基因突变等。

4、食品安全食品安全是当前社会关注的热点问题之一，而生理生化实验技术能够对食品中残留的农药、重金属、有害微生物等进行检测和鉴定，为保障食品安全提供重要依据。

生化实验五大技术一.分光光度技术1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。

而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。

2.基本原理:（图1-1光吸收示意）透光度T=It/lo吸光度A=lg(lo/ I1)朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLcK 为吸光率，L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度(mol/L)]摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为I.cm 的吸光度。

c=A/ε3. 定量分析:(1)标准曲线(工作曲线)法(2) 对比法元-KCLCxS SX X S X S X S X C A A C C C L KC L KC A A *,===即(3)计算法: e=A/ε(4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀)(5)多组分湖合物测定4.技术分类分子吸收法&原子吸收法:可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法；5.应用方向有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法二电脉技术1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行脉动。

使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。

2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。

v=Q/6xrη3.影响电泳迁移率的因素:电场强度电场强度大，带电质点的迁移率加速溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗4:技术分类:自由电泳(无支持体)区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压)，博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等5. 电泳分析常用方法及其特点:小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳⑴醋酸纤维素薄膜电泳①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现的“拖尾”现象②分离理应快，电泳时间短③样品用最少:④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球蛋白)⑵玻脂糖凝胶电泳①琼脂糖凝胶孔径较大，对般蛋白质不起分子筛作用②琼脂糖凝胶弹性差，不适含管状电泳------用于等电液鱼、免疫电话、血清脂蛋白等蛋白质电脉，以及DNA、RNA、核苷酸的分析(3)聚丙烯肤胶凝胶电泳①可调节孔径大小②机械强度好，有弹性③分辨率高，用途广④无电涉----------用于不同分子量蛋白质的电泳分离⑶SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳该种电泳使蛋白分子相对迁移率R的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子a的标准蛋白的对数和相对迁移所作的标准曲线中求出供试品的分子量----------最常用定性分析蛋白质的电脉方法，特别用于蛋白质纯度检测&分子量制定⑷等电聚焦电泳技术利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质---------由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子相近而等电点不同的蛋白质组分。

绪论生化实验室的基本设备1 水：常用的纯水是蒸馏水和无离子水。

消毒，常用的灭菌方法有：高温、高压灭菌、紫外线照射、火焰焚烧、过滤除菌、酒精等试剂浸泡消毒等，因此实验室必须配备各种无菌处理设备。

2 酸碱度pH 测量系统。

最常用的是pH 试纸和pH 计。

液体溶质定量系统。

主要有可见分光光度计、紫外／可见分光光度计和高档的快速扫描紫外／可见分光光度计等。

常用离心机有普通台式离心机、高速冷冻离心机和超速离心机等。

电泳装置由电源和电泳槽两部分组成 。

3 主要的层析技术有：吸附层析、凝胶排阻层析、离子交换层析和亲和层析等。

PCR (Polymerase Chain Reaction)聚合酶链式反应，即用DNA 聚合酶在体外大量扩增DNA 片段的方法。

4生物材料的培养有微生物培养、植物细胞及组织培养、动物细胞及动物培养等。

不同的培养，其对设施的要求也有所不同。

微生物培养：需要恒温恒湿培养箱、振荡培养器即摇床（有空气和水浴式以及全温式摇床）、发酵罐、大型生物反应器等；植物细胞及组织培养：需要恒温恒湿光照培养箱、振荡培养器、生物反应器和植物房等；动物细胞及动物培养：需要二氧化碳培养箱、电热恒温培养箱和动物房等。

5 其它设备。

实验室除以上常规设备和设施外，还必须装备下列一些常用设备⑪通风柜：用于有害和有毒气体的操作。

⑫微波炉：用于化冻、灭菌及其他一些需要快速加热的操作。

⑬组织打碎机和匀浆器：用于各种生物材料、动植物组织和细胞的破碎。

第一章生物化学分离纯化策略1 三阶段纯化策略⏹纯化问题所涉及的具体步骤最终取决于样品的性质。

但也有共同可参考的阶段⏹捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。

⏹中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。

⏹精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。

2 分离方法的选择⏹蛋白质的性质---方法⏹电荷---等电点、离子交换（IEX ））⏹分子量---凝胶过滤（GF ） ⏹疏水性---疏水（HIC ）反相（RPC ） ⏹特异性结合---亲和（AC ） 3 每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡（相关方法比较见下页） ⏹分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。

常见的生物化学实验方法生物化学实验是研究生物分子结构、功能和相互作用的重要手段，广泛应用于生物医学研究、药物开发和环境保护等领域。

本文将介绍一些常见的生物化学实验方法。

一、色谱技术色谱技术是一种分离和分析物质的方法，根据分子的化学性质和大小差异，将混合物分离成各个组分。

常见的色谱技术包括气相色谱（GC）、液相色谱（LC）和薄层色谱（TLC）等。

在生物化学实验中，色谱技术常用于对生物样品中的分子进行纯化和分析。

例如，气相色谱可用于分析氨基酸和脂肪酸等小分子化合物，液相色谱则可以用于分离蛋白质、核酸和多糖等生物大分子。

二、电泳技术电泳技术是利用电场作用下物质的电荷和大小差异，将混合物分离成各个组分的方法。

常见的电泳技术包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和凝胶过滤电泳等。

在生物化学实验中，电泳技术常用于分离和检测蛋白质和核酸等生物大分子。

例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于分离和测定蛋白质分子量，SDS-PAGE则可以用于检测蛋白质的纯度。

三、质谱技术质谱技术是利用质量分析仪器对物质的质量和结构进行分析的方法。

常见的质谱技术包括质谱仪、飞行时间质谱（TOF-MS）和液相色谱质谱联用（LC-MS）等。

在生物化学实验中，质谱技术常用于鉴定和定量生物分子。

例如，利用质谱仪可以对蛋白质进行鉴定，通过测定样品中蛋白质的质量和碎片离子的质量谱图，确定蛋白质的氨基酸序列。

四、核酸杂交技术核酸杂交技术是利用互补的DNA或RNA序列进行结合，从而检测目标序列的方法。

常见的核酸杂交技术包括Southern blot、Northernblot和in situ hybridization等。

在生物化学实验中，核酸杂交技术常用于检测和定量特定DNA或RNA序列的存在。

例如，Southern blot可用于检测DNA片段在基因组中的分布和拷贝数，Northern blot则可用于检测特定mRNA的表达水平。