人脐血间充质干细胞来源的外泌体_分离鉴定及生物学特性_张娟

人脐带间充质干细胞体外分离培养及其生物学特性的研究韩潇;白海;赵强;杨柯;欧剑锋【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2016(045)007【摘要】Objective To identify a detailed biological characterization of mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from hu‐man umbilical cord(UC) tissue regarding their morphology ,immunophenotype ,purity and proliferative capacity and establish a rea‐sonably cultured and amplified system .Methods After stripping off arteries and veins ,the remaining parts of umbilical cord were cut into 1 mm3 small sections and cultured with DMEM/F12 containing 10% fetal bovine serum .Adhere cells were obtained and the morphology of the cells was observed under inverted phase contrast microscope .The growth curves of them were drawn by CCK‐8 and the cell cycle and surface antigens(CD29 ,CD73 ,CD90 ,CD105 ,CD31 ,CD14 ,CD34 ,CD45 ,CD11b ,HLA‐DR) were detected by flow cytometry .Results Seven to ten days after primary culture ,adhere cells came out of fragments .The MSCs harvested were a high purity and mainly presented as a fibroblast‐like morphology .UC‐MSCs had a strong ability of proliferation through the cell growthcurve .The special surface antigens CD29 ,CD73 ,CD90 ,CD105 were positive expression ,while CD31 ,CD14 ,CD34 ,CD45 , CD11b ,HLA‐DR were negative .More than 80% cells of MSCs were found at G0/G1phase .Conclusion Human UC‐MSCs could be cultured and proliferated in vitro .%目的：研究人脐带间充质干细胞（MSCs）详细的生物学特性，包括其细胞形态、免疫表型、纯度及增殖能力，从而建立稳定的MSCs体外分离培养体系。

人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定王娟;陆琰;何冬梅;张洹【期刊名称】《暨南大学学报（自然科学与医学版）》【年(卷),期】2009(030)004【摘要】目的:从人脐带中分离、培养并鉴定间充质干细胞(MSCs).方法:用胶原酶消化法分离脐带间充质干细胞,差速贴壁法进行纯化;MTT法检测细胞增殖活性,并绘制生长曲线;流式细胞仪检测其表面标志和细胞周期;地塞米松、抗坏血酸、磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,并用碱性磷酸酶染色鉴定;地塞米松、胰岛素、吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,用油红O染色鉴定;将脐带MSCs注射到BALB/c裸鼠肾被膜下,观察有无致瘤性.结果:从人脐带中分离出的同充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞表达CD29、CD44,低表达CD106,不表达CD14、CD31、CD34、CD45和HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能;将脐带MSCs移植到BALB/c裸鼠肾被膜下,未观察到致瘤性.结论:从脐带中成功分离培养的细胞,具有间充质干细胞生物学特性.【总页数】6页(P367-372)【作者】王娟;陆琰;何冬梅;张洹【作者单位】暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632【正文语种】中文【中图分类】Q813【相关文献】1.人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定 [J], 王玲玲;马峰;张玉成;杜珍武;张桂珍2.睾丸Leydig干细胞分离、纯化及鉴定的体外研究 [J], 肖斌;王晓云;周广东;周英晋;毕宏达;朱吉;张敬德;邢新3.大鼠雪旺细胞体外分离培养纯化及鉴定 [J], 张春燕;张自强;刘玉梅;邓雯;王玉琴4.猴头菌素分离纯化、结构鉴定及体外活性研究 [J], 何晋浙;樊鹏;孙培龙5.胎猪胰腺导管干细胞的体外分离、纯化、培养及鉴定 [J], 李云龙;郭欣;杨晓波;黄跃南因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定概述脐带血间充质干细胞（Wharton’s jelly mesenchymal stem cells, WJ-MSCs）是一类来源于脐带的干细胞。

WJ-MSCs具有较强的增殖能力、多向分化潜能、免疫调节功能等，是目前研究领域中备受关注的干细胞类型之一。

在该文档中，我们将介绍如何从脐带血样中分离出WJ-MSCs，并进行相关的细胞培养和鉴定。

分离过程脐带血样获取首先需要从人体获得脐带血样。

脐带血样一般可以在婴儿出生后通过脐带穿刺等方式获取。

获取脐带血样需要得到母亲的同意，并通过相关机构进行规范化处理。

分离WJ-MSCs脐带血样获取后，需要将其中的WJ-MSCs进行分离。

具体分离步骤如下： 1.将脐带血样转移至离心管中； 2. 加入相同体积的PBS，并轻轻混合； 3. 通过低速离心分离脐带血样中的血细胞等成分； 4. 取下沉后的WJ组织，加入胶原酶等酶类消化物进行消化，离心分离细胞； 5. 通过细胞培养等方式扩增细胞数量。

细胞培养在分离得到WJ-MSCs之后，需要进行相关的细胞培养。

具体培养步骤如下：1. 将分离得到的WJ-MSCs转移至新的培养皿中； 2. 加入含有10% FBS的DMEM低糖培养基； 3. 定期更换培养基，并记录生长状况。

鉴定方法确定分离的细胞为WJ-MSCs的方法很多，常用的方法如下： #### 形态学鉴定通过显微镜观察细胞形态、吸附能力等，判断细胞是否符合WJ-MSCs的特征。

免疫学鉴定通过使用针对WJ-MSCs标记的分子抗体（如CD73、CD90等）对细胞进行标记，并使用流式细胞仪等方法进行检测。

活力检测通过MTT法、细胞增殖实验等，检测WJ-MSCs是否具备较强的增殖能力。

多向分化鉴定通过对WJ-MSCs进行分化培养，如脂肪细胞培养、软骨细胞培养等，检测WJ-MSCs是否显示多向分化的潜能。

结论通过脐带血样的分离，可以获得WJ-MSCs，并通过相关的培养和鉴定方法，确定其为WJ-MSCs，并进一步应用于生物医学实验中，具有潜在的临床应用前景。

外泌体提取方法及鉴定分析研究进展外泌体是细胞分泌的一种微小膜泡，包含了多种生物活性分子，如蛋白质、核酸和脂质等。

近年来，随着生物技术的不断发展，外泌体提取方法和鉴定分析研究取得了显著的进展。

本文将对外泌体提取方法及鉴定分析研究进展进行简要综述。

外泌体是由细胞分泌的一种直径约30-100nm的膜泡，由细胞内吞摄取并加工处理形成。

外泌体在细胞间通讯、物质运输以及疾病诊断等方面具有重要作用。

化学法是一种常用的外泌体提取方法，主要采用离心和沉淀相结合的方法。

首先将细胞培养液进行高速离心，去除细胞和较大的膜泡，然后加入沉淀剂沉淀获得外泌体。

该方法的优点是操作简单、提取量较大，适合大量样本的处理。

但是，该方法纯度较低，可能会影响后续的鉴定和分析。

生物法是一种利用细胞表面标志物进行免疫吸附的外泌体提取方法。

将外泌体进行免疫吸附，再通过洗脱得到纯度较高的外泌体。

该方法的优点是纯度高、对细胞损伤小，适用于珍贵样本的提取。

但是，该方法操作复杂，提取量较小，需要大量的抗体。

基因工程法是一种利用细胞表达特定基因的外泌体提取方法。

将目的基因转染到细胞中，通过表达特定膜蛋白，诱导细胞分泌出外泌体，再对其进行纯化和提取。

该方法的优点是纯度高、提取量较大，适用于具有特定功能的外泌体提取。

但是，该方法需要特定的基因工程技术和细胞系，操作较为复杂。

蛋白质组学在外泌体研究中的应用不断深入。

通过蛋白质组学技术，可以鉴定外泌体中的蛋白质种类、相对丰度以及修饰情况等。

通过比较不同条件下外泌体蛋白质组学的差异，可以研究外泌体的生物学特征和功能。

随着二代测序技术的不断发展，基因序列分析在外泌体研究中也得到广泛应用。

通过对外泌体中的核酸进行测序，可以鉴定其中的基因序列和表达水平。

通过比较不同条件下外泌体基因序列的差异，可以研究外泌体在细胞间通讯和疾病诊断等方面的作用。

转录组测序转录组测序可以分析外泌体中的mRNA、lncRNA和miRNA等转录本。

人脐血间充质干细胞体分离、培养及向脂肪细胞分化的实验研究邓寅业;陶艳玲【期刊名称】《陕西医学杂志》【年(卷),期】2010(039)005【摘要】目的:探讨脐血间充质干细胞(UCB-MSCs) 的分离培养及向脂肪细胞的分化潜能.方法:从足月儿脐血中获得间充质干细胞,体外培养传代,流式细胞检测细胞表面及抗原细胞周期;予10-6M地塞米松、100 μg/ml 1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤(IBMX)、50 μg/ml抗坏血酸的IMDM培养基,对MSCs进行诱导向脂肪细胞分化,油红-O染色染色鉴定.结果:成功建立了脐血间充质干细胞分离及培养扩增的方法;流式细胞仪检测结果显示, 贴壁细胞均表达CD105、CD29和CD44,不表达造血细胞表型CD34、CD45和内皮细胞表型CD31;经脂肪培养液诱导后在细胞胞浆里可见颗粒状红色脂滴形成.结论:脐血间充质干细胞能进行体外分离培养,并能诱导分化为脂肪细胞.【总页数】3页(P541-543)【作者】邓寅业;陶艳玲【作者单位】广西壮族自治区人民医院儿科,南宁,530021;黑龙江省哈尔滨血液病肿瘤研究所【正文语种】中文【中图分类】R720.5【相关文献】1.人脐血间充质干细胞体外分离培养的实验研究 [J], 陈晓岚;黄仁彬;汤银娟;莫艳秀;张建湘2.人脐血间充质干细胞分离、培养及向成骨细胞分化的实验研究 [J], 陶艳玲;张颢3.人脐血间充质干细胞分离培养及向成骨细胞分化的研究 [J], 农丕地;黄海玲;解继胜4.人脐血间充质干细胞的分离培养与向神经元样细胞诱导分化的实验研究 [J], 喻永涛;惠国桢;陈镭;陆华;苗宗宁5.大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及向脂肪细胞分化的实验研究 [J], 赵媛;徐立因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research2087·综述·杨沁馨，女，1993年生，四川省宜宾市人，汉族，遵义医科大学在读硕士，主要从事干细胞与创面修复基础研究。

文献标识码:A来稿日期：2019-10-15 送审日期：2019-10-17 采用日期：2019-11-19 在线日期：2020-01-17Yang Qinxin, Master candidate, Department of Burn and Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China间充质干细胞源性外泌体的检测方法杨沁馨，王达利，卫 雪(遵义医科大学附属医院烧伤整形外科，贵州省遵义市 563000) DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2063 ORCID: 0000-0003-3297-2587(杨沁馨)文章快速阅读：文题释义：外泌体：早期由多泡体通过膜内陷包裹内容物形成并在多泡体与细胞膜融合过程中被释放到胞外，是一类粒径为30-120 nm ，内含来源细胞中部分蛋白质、核酸、脂质等成分的蝶形膜性囊泡。

外泌体能分泌及转运多种生物活性成分并参与一系列生理病理过程。

间充质干细胞源性外泌体：由间充质干细胞旁分泌所得，具有来源细胞的特性。

间充质干细胞源性外泌体能促进受损区域细胞自我修复与组织再生，恢复组织内稳态，加速创面修复。

不仅如此，间充质干细胞源性外泌体在血管损伤修复、急性肺损伤、缺血性脑卒中、骨关节炎、心肌梗死等各个系统疾病中都具有重要作用。

摘要背景：间充质干细胞源性外泌体因其众多优点被应用于多种疾病的诊断与治疗，因此精确有效以及低成本检测出间充质干细胞源性外泌体对将来疾病的诊断和治疗至关重要。

CHINESE COMMUNITY DOCTORS 实验研究中国社区医师2020年第36卷第34期外泌体(exosomes)天然存在于体液中，含有丰富的蛋白质、RNA 和DNA 等，并能通过与靶组织受体结合或与质膜融合的方式介导细胞间信息交流，在多种疾病的发展过程中发挥关键作用[1]。

外泌体作为一种无细胞(cell-free)的治疗方式，经过修饰等方式还可以利用其包裹药物靶向输送至特定部位，具有较高的应用潜能和价值[2]。

目前临床将MSC 外泌体作为药物递送的理想载体进行研究[3]。

对于外泌体的提取目前的方法都有一定的局限性，如流失率较高、形态损伤较大、提取产量较低等，很难满足临床实际需求。

脐带间充质干细胞(HUCMSC)来源的外泌体表现出在创伤修复和组织重建、炎症反应、缺血性疾病等方面丰富的治疗潜能[4]，且脐带组织来源丰富、取材较为容易。

因此本实验拟对HUCMSC 外泌体的提取及鉴定进行研究，以验证HUCMSC 可作为外泌体体外大量制备的一种选择方法。

资料与方法足月产新生儿脐带均来源于我院，经捐赠者知情同意，本研究经过医院医学伦理委员会批准。

材料：DMEM/F12培养基、青霉素/链霉素双抗溶液、0.25%EDTA 胰酶(GE，美国)；胎牛血清(FBS)、磷酸盐缓冲液(PBS)，均为Gibco 公司产品(美国)；RIPA 裂解液、二氧化碳培养箱(Thermo，美国)；2.5%戊二醛固定液(leagene，美国)；T25培养瓶(Corning，美国)；透射电子显微镜(FEI，美国)；倒置显微镜(Olympus，日本)；超速离心机、超速离心管(Beckman，美国)。

方法：①HUCMSC 的分离和培养：取新鲜的足月剖宫产新生儿脐带，用含有青霉素/链霉素双抗的PBS 缓冲液反复冲洗，去除残留血液。

将脐带组织剪成1mm 3左右大小的碎片后转移到培养皿中，用含10%去外泌体胎牛血清(将FBS 置于超速离心管中，4℃、120000g 离心18h，吸取上层液体，-80℃分装保存备用)，1%双抗(100U/mL 青霉素、100mg/mL 链霉素)的高糖DMEM 培养基培养，放置在37℃5%CO 2培养箱中24h，加入5mL 培养基，每2～3d 换液1次，7d 后细胞生长状态利用倒置显微镜观察，汇合度达到80%～90%时，用0.25%EDTA 胰酶消化，1∶3传代。