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利用表面等离子体共振生物传感器快速检测牛乳中的三聚氰胺邓绍立;崔大付;廉双秋【摘要】牛乳中残留的三聚氰胺对人类健康具有重要危害.利用表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)技术,建立一种快速定量检测牛乳中三聚氰胺的方法.以纳米金为媒介将三聚氰胺(melamine,MEL)连接到SPR传感芯片表面,优化最佳抗体用量和再生条件,测试芯片稳定性和方法的准确性.在无污染的牛乳中添加系列质量浓度的MEL,采用竞争抑制法建立抑制标准曲线,并对实际样品进行检测.结果表明:芯片重现性好,重复检测60次相对标准偏差为5.05％,方法检测限为3.24 ng/mL,远低于国际食品法典委员会和国家有关部门规定的残留量.该方法在30 min内完成样品的前处理和检测,适合牛乳生产现场快速定量检测.【期刊名称】《乳业科学与技术》【年(卷),期】2015(038)001【总页数】4页(P18-21)【关键词】表面等离子体共振;三聚氰胺;牛乳;定量检测【作者】邓绍立;崔大付;廉双秋【作者单位】北京中龙益诚科技有限公司,北京 100071;中国科学院电子学研究所,传感技术国家重点实验室,北京 100080;北京中龙益诚科技有限公司,北京 100071【正文语种】中文【中图分类】TS207.5表面等离子体共振；三聚氰胺；牛乳；定量检测三聚氰胺（melamine，MEL）原本是一种非常重要的有机化工原料，广泛应用于树脂、阻燃剂、减水剂和清洁剂等产品的生产，为改善人类的生产生活水平做出了应有的“贡献”。
但在利欲熏心的不法分子手里三聚氰胺却成了危害人类和动物生命安全［1-3］的“无情杀手”。
动物饲料和婴幼儿奶粉中非法添加的三聚氰胺曾于2007年3月—2008年9月先后在美国和我国甘肃、江苏等多地造成宠物中毒和婴儿肾结石等严重后果，这不仅导致了中国乳制品行业诚信危机，还给国家带来严重的经济损失［4］。
因此，三聚氰胺含量检测已成为乳制品质量检测的重要环节，中国政府相关部门和国际食品法典委员会（Codex Alimentarius Commission，CAC）迅速发布并先后修订了乳制品中三聚氰胺的限量标准。
利用表面等离子体共振技术检测猪尿中盐酸克伦特罗
作者：廉双秋崔大付邓绍立
来源：《肉类研究》2014年第11期
摘要：利用表面等离子体共振技术检测猪尿液中的盐酸克伦特罗。
将盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白偶联物作为传感芯片特异识别探针结合到生物芯片表面，通过溶液竞争法结合表面等离子体共振技术检测盐酸克伦特罗。
标准曲线被建立并且检测盐酸克伦特罗的检测限能够达到1.03 ng/mL，与莱克多巴胺、沙丁胺醇无交叉反应，具有良好的特异性，猪尿的回收率为98.2%～107.0%，变异系数在可接受范围内。
所采用的表面等离子体共振方法对于检测猪尿中的盐酸克伦特罗具有灵敏性，准确性，精密性。
关键词：表面等离子体共振；盐酸克伦特罗；免疫反应；快速检测。
克伦特罗ELISA快速检测有哪些方法克伦特罗属于-兴奋剂类药物，可以提高脂肪型动物的瘦肉率和加速动物生长。
8.3 当板间差异性大时，可能原因是板与板之间孵育时间相差太大，板与板之间洗涤不一致，移液枪使用不当，温度不同等。
克伦特罗属于-兴奋剂类药物，可以提高脂肪型动物的瘦肉率和加速动物生长。
目前由于多起克伦特罗中毒事件且出现了死亡案例，因此被禁止使用。
克伦特罗ELISA快速检测试剂盒与经典色谱法相比，具有操作过程简单、样品处理快捷，可同时分析多个样品，分析时间短、成本低、灵敏度高且对环境污染小等优点。
1 原理ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。
此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
2 试样的准备2.1 对于尿样可直接用于检测，或者样品比较浑浊时，可适当离心。
当尿样冷冻时，应将尿样回温再测。
2.2 饲料样品要按照说明书的处理步骤进行。
当然，为保证样品充分被提取，可适当延长涡旋时间、离心时间及离心转数。
3 试剂的准备3.1 不同批次的试剂盒不能混用，因为抗体和微孔板具有盒与批次的特异性。
3.2 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。
ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的应为新鲜的和高质量的。
自配的缓冲液应用pH计测量较正。
3.3 从冰箱中取出的实验用试剂应待温度与室温平衡后使用。
试剂盒中本次实验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
3.4 检测过程中应尽量保持室温20~25℃，避免在通风口操作，温度过低、过热或蒸发都会影响检测数据的准确性。
同样不应再阳光直射下实验，防止过热或蒸发带来影响。
4 加样4.1 在ELISA中一般有4次加样步聚，即加标本或样品、酶结合物、底物、终止液。
加样时应将所加物加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡，当有气泡时可用干净的枪头小心刺破。
4.2 加标准及样品时一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中，每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。
克罗特伦快速检测实验报告盐酸克伦特罗 (Clenbuterol,CLB) ,又名瘦肉精,分子式为C12H18Cl2N2O•HCl,药品名为克喘素、氨哮素等,为白色或类白色的结晶粉末,无臭、味苦,易溶于水、甲醇、乙醇,微溶于丙酮、氯仿,不溶于乙醚和苯,化学性质稳定;它是一种人工合成的B-肾上腺素受体激动剂,具有扩张支气管的作用,常用来防治哮喘、肺气肿等肺部疾病(Mersmann,1998)。
当其应用剂量达到治疗量的5~10倍时,又具有能量重分配作用,可使肌肉合成增加,脂肪沉积减少,因此将其俗称为瘦肉精,在养猪业中一些非法使用者将其作为一种生长促进剂添加到饲料中(Kuip-er,1998),用以改善胴体的品质,但同时也造成了猪肉中盐酸克伦特罗的残留。
当人们食用含有盐酸克伦特罗残留的肉品后,常常造成心动过速,低血钾,低磷酸盐血症,肌肉震颤,头晕,口干,失眠甚至于瘫痪等中毒症状,对心脏病患者更有生命危险。
国家农业部农牧发[2002]1号文5关于发布食品动物禁用的兽药及其他化合物清单的通知6中,盐酸克伦特罗被列为所有食品动物禁止使用。
实验步骤（1）使用前将待测样本溶液恢复至室温（2）取出检测卡平放，用移液枪吸取待测样品溶液100ul，垂直加于加样孔，开始计时（3）结果应在3~5min读取，其他时间判读无效，根据示意图判定结果。
阴性(-): 两条紫红色条带出现。
表示样品中盐酸克伦特罗浓度低于3 ng/mL,或不含有。
阳性(+): 检测T线无显色，则表示样品中盐酸克伦特罗浓度高于3 ng/mL。
无效:未出现质控C线，表明操作过程不正确或检测卡已失效。
结果与讨论若待测样品溶液中不含盐酸克伦特罗,当样品溶液进入测试端,盐酸克伦特罗金标单抗在硝酸纤维素膜上层析泳动,被硝酸纤维素膜上检测印迹处的盐酸克伦特罗-BSA偶联物拦截形成盐酸克伦特罗-BSA偶联物)金标盐酸克伦特罗单抗复合物,并在该印迹处形成红色的条带(检测线);测试端多余的金标盐酸克伦特罗单抗在硝酸纤维素膜上继续层析可被对照印迹羊抗鼠IgG单克隆抗体捕获形成红色的对照条带(对照线)。
动物源性食品中兽药残留快速检测技术研究进展随着畜牧业规模化和产业化，为了防止群体染病事件的发生，同时为了追求利益的最大化，养殖过程中兽药的使用量和使用范围逐渐被扩大化，国家对于兽药的安全使用有很多规定，但因为养殖者对法律法规及相关标准的不了解或受到利益的驱动，滥用、误用兽药，极易造成兽药残留超标。
食品安全监控体系不断发展完善，但兽药残留依然是动物源性食品中安全监管的重点和热点。
我国国家标准中兽药残留的检测方法有气相色谱法、液相色谱法、薄层色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法等[1]，但是这些方法存在预处理复杂、需要配备昂贵的大型仪器、操作繁琐、对人员素质要求高、试验成本高等缺点，不利于进行食品安全监管的现场快速检测；而一些快检技术具有快捷、简便、成本低等特点，被广泛运用。
对近几年动物源性食品中兽药残留快速检测技术进行综述，重点介绍了酶联免疫技术、生物芯片技术、生物传感器技术、拉曼光谱检测技术等快速检测技术，并对快速检测技术在食品分析领域中，尤其是动物源性食品中兽药残留的应用前景进行了展望。
1 免疫技术酶联免疫技术酶联免疫技术是由免疫技术与现代测试手段相结合而建立的一种超微量测定技术[2]，对于兽药残留的检测一般采用3种竞争分析模式，即抗体包被直接竞争、抗原包被直接竞争和间接竞争[3]。
Wang L等人[4]进行胶体金吸附和酶联免疫吸附交叉试验，这种方法获得良好的相关性，可以快速测试动物源食品中14种磺胺残留。
王忠斌等人[5]建立了氨基糖苷类抗生素多残留的直接竞争ELISA分析方法，快速检测新霉素、卡那霉素、庆大霉素、链霉素等兽药中常用的氨基糖苷类抗生素。
王自良等人[6]研制的苯巴比妥ELISA试剂盒，线性检测范围广，达～ng/mL，灵敏度高，检测限低。
王选年等人[7]研制的盐酸克伦特罗ELISA试剂盒，线性检测范围为～ng/mL，与肾上腺素、去甲肾上腺素、莱克多巴胺及多种抗生素均无交叉反应性。
克伦特罗检测方法
1. 嘿，你知道吗？克伦特罗检测方法有一种超级简单的，就像我们找东西一样。
比如说，用专门的检测试剂，就跟我们凭感觉就能找到熟悉的东西似的。
2. 哇塞，还有一种检测方法是通过仪器分析呢！这就好比孙悟空的火眼金睛，一下子就能把克伦特罗给揪出来。
比如在那些食品样本里，仪器就能精确地找到它。
3. 嘿呀，你想想，用免疫分析法检测克伦特罗也很厉害呀！就好像警察抓坏人，一抓一个准儿。
在那些复杂的样本中也能准确识别。
4. 哎呀呀，还有色谱法检测呢！这就像走迷宫一样，能把克伦特罗的踪迹给摸得清清楚楚。
比如在一些药物里，这个方法可好用啦。
5. 哇哦，生物传感器检测克伦特罗也挺牛的吧！就如同我们的鼻子能闻到香味一样敏感。
在一些特定的环境下，它就能发挥大作用。
6. 嘿嘿，最后一种，质谱法检测！这简直就是检测中的大绝招，就像武林高手的必杀技。
比如在面对很难检测的情况时，它就能轻松搞定。
总之呢，这么多种克伦特罗检测方法，各有各的厉害之处，我们可得好好了解，这样才能保障我们的健康和安全呀！。
表面等离子体共振生物芯片快速检测克伦特罗李莹1,2，齐攀1,3，马骁1,4，钟金钢1,4，陈江韩5，张冠文5（1.暨南大学光电信息与传感技术广东普通高校重点实验室，广东广州510632）（2.暨南大学预科部，广东广州510610）（3.广东交通职业技术学院电子工程系，广东广州 510650）（4.暨南大学光电工程系，广东广州 510632）（5.中国广州分析测试中心，广东广州 510070）基金项目：国家自然科学基金资助项目（41206081）；海洋赤潮灾害立体监测技术与应用国家海洋局重点实验室资助项目（MATHAB20120208）；粤港关键领域重点突破招标资助项目（2005A20501001）作者简介：李莹（1976-），女，博士，副教授，主要从事生物医学信息技术研究通讯作者：钟金钢（1964-），男，博士，教授，博导，主要从事生物医学信息技术研究又称“瘦肉精”，属于β2-肾上腺素受体激动剂（β2-addrenoeeptor agonists）。
克伦特罗引起的食物中毒事件近年来在国内外时有发生，1983年西班牙首次发生克伦特罗食物中毒事件，1998年和2006年分别在香港和上海发生克伦特罗食物中毒事件。
1997年，中华人民共和国农业部下达文件，严禁β-肾上腺素类激素在饲料和畜牧生产中使用，在禁用激素类列表中，2747盐酸克伦特罗高居榜首。
克伦特罗既不是兽药，也不是饲料添加剂，但是可明显促进动物生长，并增加瘦肉率，抑制脂肪的合成，因此一些饲养者或者饲料厂仍在非法使用克伦特罗，提高肉用动物的瘦肉率，残留在动物性食品中的克伦特罗严重危害人类健康。
与其它β-兴奋剂相比，克伦特罗的生物利用度高，更易出现中毒反应。
食用含有盐酸克伦特罗的食品可能会出现血糖升高、心律失常、腹痛、腹泻、过敏等不良反应，其毒性高于具有相同功能的莱克多巴胺，所以，必须要对克伦特罗在动物养殖过程中的非法使用进行监控和检测。
2002年9月10日农业部、卫生部、国家药品监督管理局发布了《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》，盐酸克仑特罗和莱克多巴胺等7种“瘦肉精”被列为禁用药品。
目前，检测盐酸克伦特罗的主要方法是气相色谱-质谱法（Gas Chromatograph-Mass Spectrometer-computer，GC-MS）[1]、高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）[2~3]、酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[4]、液相色谱-质谱/质谱法（HPLC-MS/MS）[5]。
这些方法的缺点是样品处理时间长，检测过程烦琐、难于操作，污染环境，仪器价格昂贵，在实际应用中受到限制[6]。
表面等离子体共振生物芯片不需要标记就可对分子间的相互作用进行实时监测，已被广泛用于药物分析、食品分析、环境监测等许多领域[7~14]。
本研究利用自行研制的便携式表面等离子体共振（Surface plasmon resonance，SPR）生物传感器，根据免疫反应的特异性，研究克伦特罗抗原、抗体的相互作用，分析动力学反应过程，建立标准曲线，并提出克伦特罗的连续检测法和快速检测法。
连续检测法是连续检测多个样品后再对生物芯片表面通入再生液，实现芯片再生，从而简化了检测过程，提高了芯片的使用寿命。
快速检测法是通过动态设置检测参数，在免疫反应阶段提高单次检测速度，获取更多数据，提高灵敏度；在芯片制备阶段延长单次检测时间，去除冗余数据。
与传统生化分析方法相比，本研究利用便携式仪器，提出的方法操作简便，无需标记，非破坏性，成本低，可进行现场大量样品的实时连续检测和快速筛选，适用于超市、集市、工厂等需要实时检测的场所，进行质量监控。
1 实验部分1.1 仪器、试剂与材料自行研制了便携型SPR检测仪，由光路系统、机械扫描系统、样品输送系统、生物传感芯片、控制及分析软件组成，用电学方法控制入射光角度的改变，由光电池检测反射光光强的变化，灵敏度高，方法简便易行。
盐酸克伦特罗标准品（Clenbuterol Hydrochloride，100 g/mL的乙醇溶液）由农业部环境保护科研监测所提供，分子量为313.7；克伦特罗-牛血清白蛋白（CLB-BSA）耦联物、克伦特罗抗体（anti-CLB）购于广州弗赛生物科技有限公司；猪肉中提取的克伦特罗样品由中国广州分析测试中心提供；巯基十一酸（HS(CH2)10COOH）、巯基己酸（HS(CH2)6OH）、N-羟基琥珀酰亚胺（N-Hydroxysuccinimide,NHS）、碳二亚胺（N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcardbodiimid hydrochlorid, EDC）、乙醇胺（Eth）、十二烷基硫酸钠（SDS）购于美国Sigma公司；其它试剂购于北京化学试剂公司。
免疫反应的缓冲液是PBS缓冲液（2 mmol/L NaH2PO4, 2 mmol/L Na2HPO4, 150 mmol/L NaCl, pH 7.4），盐酸克伦特罗标准品（CLB）、克伦特罗衍生物（CLB-BSA）、克伦特罗抗体用PBS缓冲液稀释成相应浓度的溶液。
1.2 生物芯片制备图1 克伦特罗免疫检测示意图Fig.1 Scheme of Clenbuterol(CLB) immune detection 在直径20 mm厚度1 mm的圆形玻璃片上沉积50 nm的金。
将镀有金膜的传感芯片固定到仪器上，安装好流通系统，通入PBS缓冲液，基线稳定几分钟后进行生物芯片的自组装，流通池中通入1 mM的HS(CH2)10COOH（巯基十一酸）和HS(CH2)6OH（巯基己酸）的乙醇溶液，质量比（M/M）是1:9，对金膜表面进行化学修饰2 h，然后通入PBS缓冲液清洗。
基线稳定后加入0.1 mol/L的NHS和0.1 mol/L的EDC 混合液（1:1, V/V），活化芯片表面15 min，之后用PBS 冲洗2 min，这时的基线比活化前略有升高。
然后进行生物探针的固定。
连续检测法和快速检测法，均在生物芯片表面固定克伦特罗衍生物（CLB-BSA），作为生物探针，固定时克伦特罗衍生物浓度为83 mg/L，此时SPR响应值明显升高，30 min后通入PBS冲洗2 min，响应值只有小幅下降，说明探针固定效果较好。
2748加入1 mol/L的乙醇胺（pH 8.5）封闭灭活剩余的酯键，5~7 min，PBS冲洗后，生物芯片制备完成，可用于下一步的免疫检测。
如图1所示，克伦特罗免疫反应的示意图。
2 结果与讨论2.1 连续检测克伦特罗免疫反应完成后，通入SDS-HCl可实现抗原-抗体结合物从芯片表面解离，但是对芯片表面有很强的破坏性，影响芯片的检测次数和使用寿命，并且会改变基线的位置，影响检测结果的准确性。
因此要尽量减少使用酸或碱洗脱、再生芯片的次数。
图2 表面等离子体共振生物芯片检测克伦特罗的免疫曲线Fig.2 Sensorgram showing the immune response curve of the SPR for Clenbuterol on the biosensorSPR检测克伦特罗免疫反应得到的曲线为对数增长的曲线，先快后慢，逐渐趋于平缓，最后免疫反应达到饱和。
如图2所示，克伦特罗免疫反应速度较慢，在起始阶段（8 min内）待测物与芯片表面探针结合的相对响应值与时间近似呈线性关系，通常8 min以后反应速度才趋于平缓，15 min后才会达到平衡，并且当生物芯片表面固定的生物探针较多，待测样品的浓度不高时，起始阶段探针与待测物的结合数量少，只占芯片表面探针的小部分，对后面加入的样品中待测物与芯片探针的结合影响很小。
解离速度与抗体本身的性质、温度以及缓冲液成分有关。
克伦特罗免疫反应完成后，通入PBS缓冲液使抗原-抗体结合物解离，解离速度很慢。
基于以上分析，本文提出连续检测克伦特罗的方法。
检测时交替通入待测样品和PBS缓冲液，可得到克伦特罗连续检测曲线，一组样品检测完成后才通入SDS-HCl使抗原-抗体结合物解离，实现芯片再生。
该方法减少了用酸或碱洗脱的次数，简化了实验步骤，节省反应时间，延长芯片的使用寿命和使用次数，大大降低了成本。
图3 利用表面等离子体共振生物芯片连续检测克伦特罗的动力学曲线Fig.3 Sensorgram of continuous detection method for Clenbuterol with surface plasmon resonance(SPR) biosensor 注：1.PBS；2. 2 mg/L的anti-CLB；3. 4 mg/L的anti-CLB；4. 8 mg/L的anti-CLB；5. 16 mg/L的anti- CLB；6. 32 mg/L的anti-CLB；7. SDS-HCl。
图4 连续法检测不同浓度克伦特罗的SPR曲线对比Fig.4 Responses of Clenbuterol with different concentrations b ycontinuous detection method生物芯片表面固定克伦特罗衍生物CLB-BSA，交替通入含有不同浓度CLB抗体的待测溶液和PBS缓冲液，动态检测曲线如图3所示。
其中包括五个连续检测的过程，平台1是反应前PBS缓冲液形成的基线，2~6五个上升部分分别对应CLB抗体浓度为2 mg/L、4 mg/L、8 mg/L、16 mg/L和32 mg/L。
每个上升阶段后的平台或略有下降的部分是通入PBS缓冲液时CLB抗体从芯片表面解离的过程，解离速度较慢。
2~5过程，随着样品中抗体浓度增大，反应速度逐渐增快。
图中6对应的样品浓度虽然比5高，但是SPR响应值上升的速度比5略慢，原因是芯片表面的抗原（CLB-BSA）一部分与样品中的抗体结合了，芯片表面剩余的抗原数量减少，虽然样品中有更多抗体，但是抗原-抗体结合速度下降，检测曲线上升趋势放缓。
现场实际检测中，如果减少单个样品的检测时间，可以对更多组别的样品进行连续检测。
该方法省略酸或碱洗脱的步骤，减少了实验步骤，简化了芯片再生过2749程，降低测量成本，有利于推广到大量样品的现场检测。
图5 连续检测CLB抗体的标准曲线Fig.5 Calibration curves of anti- Clenbuterol with thecontinuous detection method注：CLB抗体浓度是2 mg/L、4 mg/L、8 mg/L、16 mg/L 和32 mg/L。
图4是这一组样品SPR检测的共振曲线（扫描范围为2°），随样品浓度的增大，生物芯片表面抗原-抗体结合物的质量增加，共振角增大，SPR响应值增大。
