分子诊断检测的标准化与自动化 2011-08-18王兆强

1.分子诊断在法医学中主要解决亲子鉴定和个体识别的问题：✧ 2.亲子鉴定(parentage testing)是通过对人类遗传标记的检测，根据遗传规律分析，对有争议的父母与子女血缘关系的鉴定。

亲子鉴定中，需要确定与小孩有无亲子关系的男子/女子称为有争议的父亲/母亲，或假设父亲/母亲，或被控父亲（alleged father,AF）/被控母亲（alleged mother,AM）3.亲子鉴定可参考的指标：非遗传特征和遗传特征。

.非遗传特征：如根据妊娠期限推测受精日期，若能证明受精期内，AF不可能与小孩生母有性关系，则可排除AF的父权。

.遗传特征包括如毛发颜色、皮肤颜色、脸型及短指或多指畸形等多基因决定的遗传性状和单基因座决定的遗传标记。

用于亲子鉴定的指标或遗传标记，应该是一种简单的遗传性状，经过家系调查已确定遗传方式按孟德尔定律遗传，群体调查证明具有遗传多态性，具有比较高的排除非亲生父亲的能力。

在出生时，该遗传标记已完全表现，并且终生不变，不受年龄、疾病及其他环境因素的影响。

4.短串联重复序列●目前在亲子鉴定中应用最广的长度多态性遗传标记。

●重复单位短，仅2~6bp，四核苷酸（AATG）STR基因座最常用●长度多态性来源于重复单位拷贝数的个体差异STR基因位点在人类基因组中分布广泛,占5%左右,可采用多基因同时复合扩增,灵敏度高,扩增结果稳定,重复性好,并可进行自动化分型。

5.亲子鉴定的基本原理1、在肯定孩子的某个等位基因是来自生父，而AF并不带有这个基因的情况下，可以排除他是孩子的生父。

检查的遗传标记越多，非生物学父亲被排除的概率就越大。

2、在肯定孩子的某些等位基因是来自生父，而AF也带有这些基因的情况下，不能排除他是孩子的生父。

这时可以计算如果判断他是孩子生父，理论上的把握度究竟有多大。

●孩子不可能带有双亲均无的等位基因。

●孩子必定得到双亲各方的一对等位基因中的一个。

6.非父排除概率(probability of exclusion，PE):指不是小孩生父的男子能被遗传标记排除的概率,是衡量遗传标记系统在亲子鉴定中实用价值大小的客观指标。

分子鉴定报告-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述分子鉴定作为一种高效、准确的生物学手段，已在各个领域得到广泛应用。

通过分析和解读生物体内的分子信息，如DNA、RNA和蛋白质等，分子鉴定可以用于确定生物种类、检测疾病、研究进化关系等方面。

随着分子生物学和基因工程的发展，分子鉴定技术的应用也越来越广泛。

利用PCR、序列比对、基因芯片等方法，我们可以快速、准确地进行物种鉴定、病原体检测、亲子鉴定等工作。

尤其在生物多样性保护、疾病防控和食品安全等方面，分子鉴定技术发挥着重要作用。

分子鉴定的优势之一是无需依赖外部特征或人工经验判断，只需分析和比较生物体内部的分子序列，可避免主观因素对结果的影响。

此外，分子鉴定技术具有高度的灵敏性和特异性，可以在极小的样本量中检测到目标分子，甚至在混合样本中识别不同的成分。

然而，分子鉴定技术也存在一定的局限性。

例如，部分生物物种的分子序列存在差异较小、相似性较高，可能导致鉴定结果的不确定性。

另外，分子鉴定技术在样品的提取、PCR扩增等步骤中，受到外部环境和实验条件的影响，可能产生误差。

这些问题在实际应用中需要进行有效的控制和解决。

随着分子鉴定技术的不断发展，未来的趋势将更加突出在快速、高通量、自动化方面的特点。

新一代的测序技术如高通量测序（Next Generation Sequencing，简称NGS）的广泛应用，将进一步推动分子鉴定技术的发展。

此外，结合人工智能、大数据分析等技术，分子鉴定将更加准确、可靠，并在更多领域发挥重要作用。

总之，分子鉴定作为一种先进的生物学手段，具有广阔的应用前景和巨大的发展空间。

通过不断的研究和创新，将进一步提高分子鉴定技术的准确性和效率，为生物科学研究和实践应用提供更多的支持。

1.2 文章结构文章结构：本篇长文将围绕分子鉴定展开详细的叙述。

为了让读者全面了解该领域的概念、应用、优势和局限性以及未来的发展趋势，文章将分为引言、正文和结论三个部分。

1.分子诊断学:是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法来研究人体内源性或外源性生物大分子和2.SNP：单核苷酸多态性，指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。

3．基因(gene)：是有功能的DNA片段，含有合成有功能蛋白质多肽链或RNA所必学的全部核苷酸序列，是遗传的结构和功能单位。

分为结构基因和调控基因。

4．结构基因：编码蛋白质或RNA的编码序列调控基因：保证转录功能起调控作用的非编码序列5．操纵子（operon）操纵基因与其控制下的结构基因共同组成的功能单位6．断裂基因：指基因的内部存在间隔区，间隔区的DNA序列与该基因所决定的蛋白质没有关系。

间隔区又称为内含子。

出现在成熟RNA中的有效区段为外显子。

7.重叠基因：指基因的开放阅读框（ORF）存在一个或多个核苷酸重叠的基因8.跳跃基因：又称转座子，基因在染色体上的位置不固定，能由一条染色体跳到另一条染色体上。

9.必须基因：生物体中存在的一些维持生物细胞生长所必需的基因，缺少或突变这些基因均能导致生物体死亡10.基因组（genome）：细胞中一套完整单倍体的遗传物质的总和.11.基因组结构主要指不同的DNA功能区在DNA分子中的分布和排列12．多顺反子（polycistron）：操纵子中常常有一至多个功能相关的结构基因串连一起，受同一个调控区调控，转录在同一个mRNA分子中。

13.黏性末端：基因组双链两端具有能够互补的单链DNA部分14.末端正向重复序列：又称末端冗余，指病毒双链DNA分子两端有一段相同的核苷酸15.末端反向重复序列（ITR）：指病毒基因组两端的反向互补重复序列16.重叠基因：指两个或两个以上基因的ORF共有一段DNA序列17.分段基因：指病毒基因组由几条不同的核酸分子组成，多冗于tDNA病毒，RNA病毒及双链RNA病毒18.LTR：即长末端重复序列，逆转录病毒逆转录后生产的dsDNA中，两端有LTR结构19.DNA重组：是指将不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键将末端连接形成重组DNA.20.DNA克隆（分子克隆）：将某一特定DNA片段通过重组DNA技术插入到一个载体（质粒和病毒等）中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片段的群体。

分子诊断学一、课程说明课程编号：440103Z10课程名称：Molecular Diagnostic/分子诊断学课程类别：专业教育课程学时/学分：80/3.5先修课程：生物化学、病理学适用专业：医学检验技术、临床医学教材、教学参考书：1. William B.Coleman.Molecular Diagnostics. State of New Jersey：Human press. 2006；2. 吕建新,王晓春主编. 临床分子生物学检验技术.北京：人民卫生出版社.2015年二、课程设置的目的意义分子诊断学是将分子生物学在疾病分子机理研究中所获得的新成果应用于疾病诊断的一门新型学科。

它以疾病发生发展的分子机理和分子改变为基础，应用现代生物化学及分子生物学技术对疾病所发生的变化进行检测，从而为疾病诊断提供依据。

通过该课程的学习将使学生对若干重要疾病的分子机理及分子改变，和分子生物学技术检测的原理有一个基本的认识和了解，为从分子水平对这些疾病进行诊断治疗打下良好的基础。

三、课程的基本要求知识：掌握分子诊断学相关的基本概念，分子诊断技术的概念和原理，熟悉了解其具体应用实例。

要求掌握：（1）以核酸等生物大分子结构与功能为基础的分子诊断学基本理论；（2）分子诊断原理与技术，包括核酸提取；以核酸分子杂交技术进行遗传病的基因诊断；DNA序列及DNA突变检测；以PCR技术为基础的、定量和和实时相结合的DNA诊断和DNA和RNA病原体载量及多基因遗传病患者mRNA检测；（3）某些疾病如传染病的DNA诊断以及分子诊断在个体化医疗中的应用等。

能力：具有较强的分析问题和解决问题的能力，能够根据疾病的发病机制，利用分子诊断学、遗传学、病理学、免疫学、生物化学及分子生物学的理论及技术，研究疾病的发病原因；具有熟练的医学实验室实践能力和较强的解决问题能力，能掌握临床各种检测项目的检测原理、临床意义及方法学评价，能掌握临床各种仪器的特点、原理及其选用和实验参数设计；素质：具有较强的创新能力，能适应社会对医学检验高水平人才的需要；能适应社会发展、科学进步、人们日益增长的医疗卫生服务需求；具有医学科学基础知识、基本的临床医学及扎实的医学检验基本理论、基本知识及基本技能，能在医院、防疫部门、血站、医学实验室、医学院校及企业工作，成为素质高、能力强、具有良好职业素养、创新思维及创新能力。

分子诊断行业发展历程概述及解释说明1. 引言1.1 概述分子诊断行业是指利用生物分子作为诊断工具来检测疾病的一个重要领域。

随着科学技术的进步和生物学知识的不断积累，分子诊断行业经历了长足的发展和突破，对人类健康事业做出了巨大贡献。

本文将对分子诊断行业的发展历程进行概述和解释说明。

1.2 文章结构本文将按照以下顺序阐述分子诊断行业的发展历程：首先，介绍分子诊断行业起源和背景，包括它是如何从理论到实践，从概念到应用逐渐发展起来的。

接着，描述分子诊断技术在过去几十年中取得的突破和进展。

这一部分将探讨关键技术创新、实验室方法改进以及新兴技术应用等方面。

然后，探讨分子诊断行业应用领域的扩展情况。

阐明不同领域中利用分子诊断技术取得的成果和应用案例，并指出其在医学、生物学、环境科学等领域的重要价值。

1.3 目的本文旨在全面了解和回顾分子诊断行业的发展历程，揭示其技术突破、应用领域扩展以及取得的重要里程碑。

同时，分析目前该行业所处的现状和趋势，以及面临的挑战和机遇。

最后，对未来发展方向和前景进行展望，并总结分子诊断行业的成就与贡献。

通过这篇文章，读者将深入了解分子诊断行业在医学和生物学领域中的广泛应用，并对该行业发展动态有一个清晰的认识。

2. 分子诊断行业发展历程：2.1 起源和背景：分子诊断作为一种基于分子生物学和基因技术的诊断方法，起源于20世纪70年代。

当时，科学家们开始探索利用DNA和RNA等分子来进行疾病的检测和诊断。

这一领域最初主要集中在基因突变与遗传病的关系研究上。

2.2 技术突破和进展：随着基因测序技术、聚合酶链反应（PCR）等分子生物学技术的不断发展，分子诊断取得了重大的突破。

1983年，科学家们首次成功地使用PCR技术复制和扩增未知DNA片段，这为后来的分子诊断奠定了基础。

此后，分子诊断方法不断完善，包括高通量测序、实时荧光PCR、多重引物扩增技术等。

2.3 应用领域扩展：随着技术的进步，分子诊断行业的应用领域也不断扩展。

什么是分子诊断分子诊断指的是通过分子生物学检测方法诊断机体中某些遗传物质的方式。

在临床医学领域，分子诊断学的应用非常广泛，其检查结果相对精准且快速。

比如说，分子诊断方式可以应用于产前诊断中，主要检测人体结构中的蛋白、酶、抗原、抗体等基因。

除此之外，分子诊断技术也可以检测出人体的传染性疾病，对影响药物的变异性基因进行鉴别，还可以检测出与癌症有关的基因。

分子诊断必须在符合规定条件的实验室内进行，目的是保证最终的检测结果有效且可靠。

人们可以通过分子诊断发现潜在的基因疾病风险，从而更早的做出风险管理准备，避免疾病发生或加重。

分子诊断也能筛选出更加有效的药物对人体进行治疗，提升医疗质量与效率。

图1即为分子诊断相关内容。

图1一、分子诊断技术分类第一，PCR技术。

PCR技术就是基因扩增技术，其利用了DNA的变性原理与复性原理，通过适温延伸、高温变性和低温复性，使得核酸片段体外扩增，可以将非常少的目标DNA特异的扩增上百万倍，然后分析和检测DNA分子。

整体而言，基因扩增技术灵敏度较高且具有特异性，应用时简便快速，所以已经成为临床基因扩增实验室应用较多且接受程度最高的技术，包含定量PCR和常规PCR。

第二，分子杂交技术。

分子杂交技术的原理是，将两条同源序列核酸单链经过碱基互补配对之后结合形成双链的过程。

该技术可以借助已知序列的基因探针捕获和检测目标序列。

所以杂交双方包含探针与有待探测的核酸，比如基因组DNA或细胞总DNA，可以提纯也可以进行细胞内杂交。

一定要标记探针，然后才可以进行示踪与检测。

分子杂交技术灵敏度高且特异性高，目前多应用于克隆基因的筛选、基因组中特定基因序列的定性、定量检测等。

第三，基因测序技术。

基因测序技术是分子诊断技术的重要分支，能够直接获得核酸序列信息，且是唯一的技术手段。

目前，分子杂交与分子构象变异或定量PCR技术得到了良好发展，但在核酸鉴定方面依然处于间接推断假设阶段，所以特定基因序列检测的分子诊断依然以核酸测序为金标准。

分子诊断学概论一、分子诊断的基本概念与历史发展二、分子诊断的现状三、分子诊断的主要技术四、分子诊断的标准化与质量控制五、分子诊断的未来趋势分子诊断基本概念◆1953年，Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构模型，为揭开人类生命现象的本质奠定了基础，标志着分子生物学的开端，也使得对疾病发病机制的认识从整体、细胞水平逐渐深入到分子水平◆分子诊断学（Molecular diagnostics），是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法，研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、诊断、治疗和转归提供信息和依据的一门学科◆通常所称的基因诊断，指针对DNA或RNA的分子诊断技术临床检验诊断体外诊断（IVD ）报告，影响约70%临床决策影像学诊断临床诊断疾病的检验诊断核磁共振辅助检验B 超CT体格检查病史临床检验诊断（实验室检验诊断）临床体液、血液检验临床化学检验临床免疫、血清学检验临床微生物学检验（细菌室）临床细胞分子遗传学检验CT （computed tomography ，电子计算机断层扫描）临床检验诊断发展阶段发展阶段历史时期技术类型典型特征简单划分第一代早期细胞形态学检验诊断•以疾病的表型改变为依据•非特异、滞后•难以早期诊断传统的临床检验诊断学学科第二代1950年代生物化学检验诊断第三代1960年代免疫学检验诊断第四代1970年代末基因检验诊断 (分子生物学检验诊断)•以疾病基因为探测对象•特异、敏感•早期诊断、预测新型的临床检验诊断学学科分子诊断（临床分子生物学检验诊断）分子生物学医学检验（临床检验诊断）分子生物学（molecular biology）1953年Watson&Crick发现DNA双螺旋结构模型70年代以来，成为生命科学最具活力的学科前沿分子医学（molecular medicine）、基因诊断（genetic diagnosis）分子生物学理论和技术方法被应用于临床分子生物学与医学的交叉和渗透国际首例基因诊断1970年代末美籍华裔简悦威（Yuet Wai Kan）分子杂交技术，α地中海贫血、镰状红细胞贫血我国基因诊断里程碑1984年，上海市儿童医院曾溢滔点杂交技术，α地中海贫血，发表在《Lancet》•以基因突变位点 (导致单基因遗传病) 为靶标第一代•核心技术：DNA或RNA分子杂交技术•以基因组特异性核酸序列 (DNA、RNA) 为靶标第二代•核心技术：Sanger测序技术、PCR技术•以基因组特异性核酸序列、蛋白质分子为靶标第三代•核心技术：生物芯片技术(高通量)•以基因组特异性核酸序列、蛋白质分子、代谢物为靶标第四代•核心技术：新一代测序技术、质谱技术分子诊断生物标志物◆核酸序列信息•个体差异基因：微卫星、SNP、mtDNA等•病原体基因组：病毒、细菌、真菌等•基因转录水平：mRNA、microRNA、lncRNA、circRNA、cfRNA等◆核酸序列变化•染色体变异：T21、T18、T13、CNV等•基因突变：点突变、插入/缺失突变、倒位突变、重复突变等◆核酸修饰•DNA甲基化•RNA甲基化◆蛋白质表达水平、修饰◆代谢产物、多糖链和脂质分子分子诊断学任务、特点、辨别◆任务•利用基础医学和生命科学的理论和方法，研究疾病发生和发展的分子机制•确定在疾病过程中特异的分子标志物•建立分子标志物的临床检验方法和评价体系•建立分子生物学检验的质量控制◆特点•主要是直接以疾病基因为探查对象，属于病因学诊断•对基因的检测结果不仅具有描述性，更具有准确性•可准确诊断疾病的基因型变异、基因表型异常以及由外源性基因侵入引起的疾病◆辨别•临床分子生物学检验技术=临床分子诊断技术•分子诊断VS基因诊断•分子诊断学包括：核酸诊断（DNA/RNA）、蛋白质检测诊断等分子诊断学概论一、分子诊断的基本概念与历史发展二、分子诊断的现状三、分子诊断的主要技术四、分子诊断的标准化与质量控制五、分子诊断的未来趋势医疗机构临床检验项目（2013版）临床体液、血液专业临床化学检验专业临床免疫、血清学专业临床微生物学专业临床细胞分子遗传学专业哪些专业含有基因诊断项目？临床免疫、血清学专业（摘录）序号项目名称1甲型肝炎病毒(HAV)RNA检测2乙型肝炎病毒(HBV)DNA测定3乙型肝炎病毒(HBV) YMDD变异检测4乙型肝炎病毒(HBV)前核心变异检测5乙型肝炎病毒(HBV)核心变异检测6乙型肝炎病毒(HBV)基因分型测定7丙型肝炎病毒(HCV)RNA测定8丙型肝炎病毒(HCV)分型9丁型肝炎病毒(HDV)RNA测定10庚型肝炎病毒核糖核酸定性(HGV-RNA)测定11戊型肝炎病毒(HEV)RNA测定12弓形体核酸测定13风疹病毒RNA测定14巨细胞病毒(CMV)DNA测定15水痘—带状疱疹病毒核酸测定16人乳头瘤病毒(HPV)基因检测17呼吸道合胞病毒核酸测定18流行性出血热病毒核酸测定19EB病毒核酸测定20副流感病毒核酸测定21人轮状病毒核酸测定22狂犬病毒核酸测定23乙型脑炎病毒核酸测定序号项目名称26柯萨奇病毒核酸测定27森林脑炎病毒(TBE)核酸测定28甲型流感病毒核酸测定29乙型流感病毒核酸测定30SARS冠状病毒核酸测定31BK病毒核酸测定32禽流感病毒核酸测定33埃可病毒核酸测定34西尼罗河病毒核酸测定35斑疹伤寒杆菌核酸测定36布氏杆菌核酸测定37结核分枝杆菌核酸测定38脑膜炎奈瑟菌核酸测定39幽门螺杆菌核酸测定40淋球菌核酸测定41嗜肺军团菌核酸测定42肺炎支原体核酸测定43生殖道支原体核酸测定44解脲脲原体核酸测定45肺炎衣原体核酸测定46鹦鹉热衣原体核酸测定47沙眼衣原体核酸测定48立克次体核酸测定临床细胞分子遗传学专业（摘录）序号项目名称备注1利用Southern blot分子杂交技术的白血病融合基因检查包括血友病A、血友病B、血菅性血友病、其它凝血因子缺陷症基因分析2利用Southern blot分子杂交技术的白血病融合基因检查1、 Ph染色体的分子杂交检查2、 RARA基因的分子杂交检查3、 AML1基因的分子杂交检查4、 E2A基因的分子杂交检查5、 MLL基因的分子杂交检查3利用RT-PCR或real time PCR技术的白血病融合基因检查1、Bcr-abl融合基因检查2、 AML1－EVI1融合基因检查3、 PML-RARA融合基因检查4、 DEK－CAN融合基因检查5、 AML1-MTG8融合基因检查6、 E2A－PBX1融合基因检查4单基因遗传病基因突变检查包括:1、进行性肌营养不良基因突变检查2、遗传性舞蹈病的基因突变检查3、其它5遗传性凝血因子缺陷症基因突变包括：1、血友病A的基因突变检查2、血友病B的基因突变检查3、混合型血友病的基因突变检查6α地中海贫血的基因突变检查7β地中海贫血的基因突变检查8苯丙酮尿症的基因突变检查9HLA低分辨基因分型检查10HLA高分辨基因分型检查序号项目名称备注12SRY的基因检查13P53基因的基因突变检查14K-Ras基因的基因突变检查15视网膜母细胞瘤RB1基因的基因突变检查16家族性乳腺癌基因的基因突变检查包括：1、BRCA1基因的基因突变检查2、BRCA2基因的基因突变检查3、其它17多发性内分泌腺瘤RET基因的基因突变的检查18遗传性非息肉性大肠癌的基因突变检查1、hMLH1基因的基因突变检查2、hMSH2基因的基因突变检查3、PMS1基因的基因突变检查4、PMS2基因的基因突变检查19遗传性大肠癌微卫星不稳定性(MSI)的基因检测20大肠癌易感基因的基因检测1、APC基因的基因检测2、DCC基因的基因检测21用于病毒、细菌用药指导的基因检测1、拉米夫定用药指导的基因检测2、结核病用药指导的基因检测3、肠球菌耐万古霉素用药指导的基因检测22用于化学药物用药指导的基因检测1、硝酸甘油用药指导的基因检测2、5-氟尿嘧啶用药指导的基因检测P450家族代谢酶基因的基包括CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、全国医疗服务项目技术规范（2023年版）◆检验+病理诊断项目合计1818项，增加了近60%，成为了11个大类中新增比例最高的板块实验室自建检测项目 (LDT)2022年12月《国家药监局综合司国家卫生健康委办公厅关于开展医疗机构自行研制使用体外诊断试剂试点工作的通知》，试点医疗机构包括：北京协和医院、北京医院、中日友好医院、中肿、阜外医院、北大一院等6家医院LDT（Laboratory developed test，实验室自建检测项目）感染领域：临床病原体检测方法微生物学检测：病原体培养/涂片病原体颗粒检测免疫学检测：检测血清学标志Ag、Ab分子诊断：检测DNA/RNA•耗时长•阳性率低•难培养•简便、快速•适于大规模筛查•可定性/定量检测•存在“窗口期”问题•不能早期诊断•灵敏度较低•快速、高通量•灵敏、特异•早期（缩短窗口期）•可分型•检测病原体突变•检测耐药基因•治疗监测病原体分子诊断检测病原体是否存在病原体分型（包括亚型）耐药基因检测相关的人类基因多态性检测标本类型外周血有核细胞血清血浆组织器官体液分泌物排泄物适宜分子诊断病原体类型难培养的如CT 、MG 、病毒培养较慢的如TB镜检容易弄错的如NG 、阴道毛滴虫免疫交叉反应较多的如CT 需要分型的如HPV 、HSV胞内病原体如衣原体、支原体、病毒CT （Chlamydia trachomatis ，沙眼衣原体）MG （Mycoplasma genitalium ，生殖支原体）TB （Mycobacterium tuberculosis ，结核分枝杆菌）NG （Neisseria Gonorrhoeae ，淋病奈瑟菌）HPV （human papillomavirus ，人乳头瘤病毒）遗传领域：镰状红细胞贫血症◆红血球不正常带来严重后果，问题在于血红蛋白ß链一个谷氨酸残基变成了缬氨酸残基◆常染色体隐性遗传病•基因点突变•Mst II 限制性内切酶位点改变•RFLP技术：酶切+电泳胚胎着床前分子诊断◆取1-2个囊胚期细胞进行基因诊断，从而将人类的遗传缺陷控制在最早期阶段无创产前诊断（NIPT ）19972008卢煜明发现母体外周血中存在胎儿游离DNA高通量测序分析胎儿游离DNA 用于唐氏综合征筛查2009中国开始NIPT 临床试验2011中国、美国开始NIPT 临床服务2012美国妇产科协会推荐高危人群进行NIPT 201520172016中国无创单病开始临床应用卫计委推出NIPT 临床应用指南美国多种单基因疾病NIPT 临床服务2022美国妇产科协会推荐全人群进行NIPT国家药监局发布NIPT 注册指南◆胎儿游离DNA ◆高通量测序肿瘤领域：肿瘤靶向治疗◆高通量测序为主循环肿瘤DNA（ctDNA）年份事件1948血中游离DNA的发现1965肿瘤与血中游离DNA的相关性1966-1973系统性红斑狼疮等疾病患者血中游离DNA水平增高1977血中游离DNA水平与肿瘤病程及疗效相关1989发现血中游离DNA与原发肿瘤突变相似1994-1999更多证据表明血中游离DNA与原发肿瘤基因突变的一致性1997孕妇血中胎儿DNA的发现1998移植器官核酸可称为游离核酸成分的发现2000-2010游离DNA与多种疾病的诊断和预后相关2010游离DNA致癌性的确定ctDNADNA文库构建捕获扩增DNA&质控富集效率高通量测序和数据分析个体化用药领域：药物基因组药物作用靶点相关基因药物代谢相关基因药物副作用相关基因药物相关基因◆P53：50%以上人类肿瘤会发生p53基因突变◆BRCA1和BRCA2：乳腺癌易感基因1和2◆EGFR：表皮生长因子受体，细胞增殖和信号传导功能◆细胞色素P450超家族：人体内最大的药物代谢系统分子诊断学概论一、分子诊断的基本概念与历史发展二、分子诊断的现状三、分子诊断的主要技术四、分子诊断的标准化与质量控制五、分子诊断的未来趋势DNA->RNA->蛋白质->代谢产物◆基因(产物) 修饰•甲基化•乙酰化•磷酸化◆代谢及代谢调控分子诊断主要技术1. 分子杂交技术•遗传性疾病的基因诊断2. PCR技术•感染性疾病的基因诊断3. 生物芯片技术•复杂性疾病的基因诊断4. 基因测序技术•复杂性疾病的基因诊断5. 质谱技术•核酸质谱、蛋白质组学6. 人工智能辅助•AI辅助的分子诊断（AI+）1. 分子杂交技术杂交类型检测目的及范围Southern印迹杂交经凝胶电泳分离且转移至膜上，DNA分子Northern印迹杂交经凝胶电泳分离且转移至膜上，RNA分子菌落杂交固定在膜上，经裂解从细菌释放，DNA分子斑点杂交固定在膜上，DNA或RNA分子原位杂交（FISH）细胞或组织中，DNA或RNA分子液相分子杂交在溶液中，DNA或RNA分子，引入磁珠2. PCR技术◆痕量核酸模板体外扩增，提高了检测灵敏度和反应特异性•1971年，Korana提出核酸体外扩增的设想•1985年，Mullis发明聚合酶链反应，Klenow片段•1988年，Keohanog，T4DNA聚合酶•1988年，Saiki，TaqDNA聚合酶•1993年，Mullis因聚合酶链反应技术获得诺贝尔奖荧光定量PCR 技术◆也称为real-time PCR ，实现了核酸的实时定量检测◆Log 浓度与循环数呈线性关系，根据达到阈值的循环数计算样品所含模板量•荧光染料：SYBR green•荧光探针：Taqman 、molecular beacon 、复合探针•举例：新冠病毒检测荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---Ct 循环数标准曲线10410310610510210数字PCR技术◆dPCR，又称为单分子PCR，近年来迅速发展起来的绝对定量PCR技术◆不依赖于扩增曲线的循环阈值进行定量，不受扩增效率的影响，也不必采用看家基因和标准曲线，具有很好的准确度和重现性，可以实现绝对定量分析3. 生物芯片技术◆广义指在微小空间中能够高通量处理或分析生物相关物质的集成式技术◆狭义指微阵列芯片技术，将大量基因探针／基因片段／蛋白／多肽，按特定的排列方式固定在支持物表面上，实现高通量处理或分析功能•固相芯片（玻片、硅片、塑料等）、液相芯片（微珠）•特点：高通量、微型化、自动化微流控芯片技术◆Microfluidics 技术，指的是使用微管道（尺寸为数十到数百微米）处理或操纵微小流体（体积为微升到纳升）的系统所涉及的科学和技术，是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科◆也被称为芯片实验室（lab on a chip ）和微全分析系统（micro-total analytical system ），具有微型化、集成化等特征优势集成小型化与自动化样本量需求少试剂消耗少高通量污染少不足缺规范与标准技术难度不低生产成本较高开发周期较长4. 基因测序技术◆核酸测序技术，是分子诊断中基因序列确定的金标准ABI Prism310 1986年Roche 4542005年Illumina GA2006年ABI SOLiD2007年Helicos HeliScope2008年PacBio RS2010年ONT MinION2013年第一代（Sanger）第二代（NGS）第三代第四代或合称第三代（TGS）Sanger测序和NGS测序双脱氧末端终止法可逆终止、边合成边测序法单分子测序技术◆SMRT单分子实时合成测序技术，零模波导孔，荧光◆纳米孔单分子测序技术，纳米孔，电信号5. 质谱技术质量分析器离子源检测器多肽离子化 真空环境获得质谱图进样系统引入样品根据荷质比分离离子 检测记录离子信号计算机数据处理系统◆离子源•电子电离•快原子轰击离子化（FAB)•电喷雾离子化（ESI ）•基质辅助激光解析离子化（MALDI)◆质量分析器•四极杆质谱（直流电极+射频电极，共4组）•飞行时间质谱（TOF)•离子阱质谱◆离子源与质量分析器组合•MAIDL-TOF-MS （基质辅助激光解析电离飞行时间质谱）•ESI-四极杆MS •ESI-串联MS6. AI辅助分子诊断◆AI+自动化流水线（包含分子诊断）•打通从标本到检验到临床的数据通路•及时准确地将“标本信息”转化为“检验数据”•再将“检验数据”转化为“临床诊疗信息”•大幅提高实验室咨询服务能力•医学检验工作向着更精准、高效的方向发展分子诊断学概论一、分子诊断的基本概念与历史发展二、分子诊断的现状三、分子诊断的主要技术四、分子诊断的标准化与质量控制五、分子诊断的未来趋势临床分子诊断方法性能评价◆定量检测方法和程序的分析性能验证内容，至少应包括准确度、精密度、可报告范围等◆定性检测项目验证内容，至少应包括检出限及符合率等，验证结果应经过授权人审核分子诊断存在的问题及原因◆假阳性问题◆假阴性问题◆重复性问题•同一实验室不同批次间重复测定，结果存在差异•不同实验室对同一标本检测，结果存在差异◆检测对象的多态性◆标本采集◆诊断试剂方法•准确性•特异性•检测限•检测范围•重复性•稳定性◆微量反应体系◆测定操作 (人员素质)◆仪器设备的维护校准 (定期)◆数据处理及结果报告个体差异样本量差异检测平台差异样本采集差异样本保存、运输差异分子诊断技术监管◆申请获批医疗器械证，有严格的管理•项目报批：卫健委批准•实验室：通过验收，定期校验仪器与器材•试剂：国家食品药品监督管理局（NMPA）批准•工作人员：经过培训，持证上岗•质量控制：室内质量控制（IQC），室间质量评价（ EQA）◆LDT？国内正在摸索监管➢推荐“微专业-体外诊断与大数据分析”，《体外诊断产品注册与监管》，由项光新、李伟、连国军等老师授课国家如何监管医疗器械NMPA产品上市许可制度企业医疗器械生产企业许可国家机构法规生产质量管理规范规范性文件法律规章法规不良事件检测和报告医疗器械召回稽查局、法规司省和县级药监器械司、注册司质量监督机构技术审评机构分子诊断学概论一、分子诊断的基本概念与历史发展二、分子诊断的现状三、分子诊断的主要技术四、分子诊断的标准化与质量控制五、分子诊断的未来趋势将成为本世纪检验医学的主导技术◆应用面更广：扩展到复杂性疾病，检测未知病原体◆使用更便捷：自动化、智能化、普及化◆诊断更准确：致病根源、致病机制，定性->定量◆诊断更早期：早发现、早治疗，诊已病->诊未病•病原体的确认和定量、分型、耐药性检测1. 感染性疾病分子诊断•对遗传病进行确诊、分型和早期诊断2. 遗传病分子诊断•肿瘤的早期诊断、分型和伴随诊断3. 肿瘤分子诊断•药物基因组学、用药指导4. 个体化用药指导•公共卫生、器官移植、个体识别、基因治疗5. 其他领域美国《2030年全球趋势》未来分子诊断学的准确性将促使医疗体系变革基因检测方法将加速疾病诊断，同时帮助医师确定个性化最佳治疗方案感染领域：病原体检测⚫国内总体：年均非新冠的标本量约为1亿例⚫常规感染样本量：约为9000万例/年⚫危重感染样本量：约为1000万例/年，多数病原不明WHO 公布2019年全球十大健康威胁，与感染密切相关有6个：流感、耐药、埃博拉、登革热、艾滋病、疫苗犹豫临床宏基因组测序遗传领域：人类基因组临床应用Collins, FS & McKusick VA. Implications of the Human Genome Project for medical science. JAMA, 2001, 285: 540-554.单基因病无创产前筛查◆利用母体外周血中的胎儿游离DNA 的进行分子生物学检验，开展无创性性产前诊断，取代羊膜穿刺或采集绒毛进行无创性产前诊断方法8000病种多1%发病率高20%致死率高治疗方式少1%努南综合征1:2500 -1:1000Rett综合征（女性）1:23000 -1:10000Kabuki 综合征1:32000致死性骨发育不良1:10000-1:5000CHARGE 综合征1:15000 -1:8500软骨发育不全1:10000结节性硬化1:5,800马凡综合征1:10000 -1:5000单基因病占总出生缺陷的22.2%（染色体10%）复杂性疾病诊断。

单分子免疫体外诊断关键技术简介单分子免疫体外诊断是一种基于单分子水平的体外诊断技术，通过检测和分析生物样品中的特定分子，如蛋白质、抗体等，来实现疾病的早期诊断和监测。

这项技术具有高灵敏度、高特异性和快速检测等优点，已经在临床医学、生物学研究和药物开发等领域得到广泛应用。

技术原理单分子免疫体外诊断技术主要基于以下原理：1.免疫反应：该技术利用生物样品中的抗原与特异性抗体之间的免疫反应进行检测。

当抗原与抗体结合时，可以产生特定的信号，如荧光信号、电化学信号等。

2.单分子检测：单分子检测是指在实验条件下只能检测到单个分子的技术。

通过使用高灵敏度的仪器设备和适当的探针标记，可以实现对单个抗原或抗体的检测。

3.信号放大：为了提高检测的灵敏度，单分子免疫体外诊断技术通常会采用信号放大的策略。

常用的信号放大方法包括荧光共振能量转移（FRET）、表面增强拉曼散射（SERS）等。

技术流程单分子免疫体外诊断技术的一般流程如下：1.样品处理：首先需要对生物样品进行预处理，如离心、稀释等，以获得适合检测的样品。

2.抗原-抗体反应：将样品与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。

可以通过直接结合或间接结合等方式实现。

3.信号检测：利用高灵敏度的仪器设备对抗原-抗体复合物进行检测。

常用的检测方法包括荧光检测、电化学检测、质谱分析等。

4.数据分析：对得到的信号数据进行处理和分析，以确定样品中目标分子的存在与否，并计算其浓度。

5.结果解读：根据数据分析的结果，判断样品中目标分子是否超过了临床阈值，从而给出相应的诊断结果。

应用领域单分子免疫体外诊断技术在医学、生物学和药物开发等领域具有广泛的应用前景，包括但不限于以下几个方面：1.疾病诊断：单分子免疫体外诊断技术可以用于早期癌症的诊断和监测、感染性疾病的检测、遗传性疾病的筛查等。

2.药物开发：该技术可以用于检测药物在体内的代谢过程、评估药物的效果和副作用，为药物开发提供重要的参考数据。

生物大分子的测量和检测技术随着科学技术的发展，人类对于生物分子的测量和检测技术越来越高效和精准，这不仅为科学研究提供了更为可靠的数据支撑，也为生物医学领域的治疗和诊断方案提供了更多的选择。

本文将介绍一些生物大分子的测量和检测技术，包括各种蛋白质、核酸等生物分子。

1. 蛋白质测量和检测技术蛋白质是构成生物体内大部分结构和代谢活动的基本组成部分，因此对其的测量和检测具有非常重要的意义。

传统蛋白质检测方法包括SDS-PAGE等凝胶电泳技术，但这些方法不能满足现代科研和临床的需要。

现代蛋白质检测技术主要包括以下几个方面：(1) 质谱检测技术质谱检测技术是一种高灵敏度、高速度的蛋白质分析技术，它可以针对蛋白质的独特质量、电荷等性质进行检测。

质谱技术的出现，使得蛋白质检测技术有了质的飞跃，它成为了目前蛋白质检测的首选技术，被广泛用于蛋白质的鉴定、分析和定量等方面。

(2) 表面等离子体共振技术表面等离子体共振技术（Surface plasmon resonance，SPR）是一种基于光学原理的蛋白质检测技术，可以快速、准确地测定蛋白质互作的动力学参数。

SPR技术是一种非标记性检测技术，具有对样品不带任何标记的优势，因此减少了潜在的污染和误差。

(3) 荧光免疫分析法荧光免疫分析法（Fluorescence immunoassay，FIA）是一种依据抗原-抗体互作原理的检测方法，通常用于检测蛋白质、细胞、激素、病毒等生物分子。

FIA技术的优点在于：检测速度快，检测灵敏度高，可同时检测多种样品，数据准确性高等。

2. 核酸测量和检测技术核酸是构成生物体的遗传信息分子，测量和检测核酸既能够为基因组学和生物学研究提供更多的数据支持，也为疾病的诊断、治疗和预防提供了更多的工具和方法。

(1) PCR技术PCR技术（polymerase chain reaction）是一种基于体外DNA扩增的技术，可以将少量的DNA扩增并在短时间内得到数百万的复制产物。

医学检测的分子诊断技术是一项新的技术，它基于生物分子的特征，以诊断、治疗和预防疾病为目的，使用分子生物学和生物化学的原理和技术进行研究和开发。

这项技术可以用来检测和诊断各种疾病，包括癌症、心血管疾病、感染性疾病等。

本文将探讨分子诊断技术的基本原理、临床应用、前景及其可能面临的挑战。

分子诊断技术的基本原理是基于分子生物学和生物化学的原理，它通过检测生物分子（如DNA、RNA、蛋白质等）的特征来进行诊断。

这些生物分子反映了人体内部的生物学状态，通过对其进行检测，可以帮助医生确定患者的疾病类型及其病情情况，从而制定更加有效的治疗方案。

目前，分子诊断技术在临床应用中已取得了很大的进展。

在癌症诊断方面，基于分子诊断技术的方法已经成为了现代癌症诊断的新标准。

例如，基于血样的DNA检测技术可以检测很小的癌细胞DNA片段，从而实现早期癌症诊断和治疗。

在心血管疾病方面，分子诊断技术可以用于检测心肌肌钙蛋白、肌红蛋白等标志物，从而为心脏病患者的治疗提供更准确的指导。

分子诊断技术的前景也非常广阔。

随着分子生物学和生物化学的不断发展，我们可以预见，在未来的生物医学领域中，分子诊断技术将会得到更广泛的应用。

例如，在肿瘤预防和治疗方面，分子诊断技术可以被用来筛查人群中的潜在肿瘤风险因素，并且在预防和早期治疗上发挥作用。

然而，分子诊断技术面临着一些挑战。

首先，技术本身的成本较高，使得它在发展中国家的应用受到一定限制。

其次，技术的准确性、灵敏度、特异性等方面还需要继续完善。

此外，如何处理、存储和分析分子数据也成为了分子诊断技术发展的瓶颈。

面对这些挑战，我们需要加强对分子诊断技术的研究，进一步提高技术的品质、降低成本，使其可以为更多患者服务。

综上所述，分子诊断技术是一种非常有前景的医学检测技术，它可以用于诊断、治疗和预防各种疾病。

我们相信，在不久的将来，随着技术的成熟和应用的普及，分子诊断技术将成为生物医学领域的重要支柱之一，从而为人类健康事业作出更多的贡献。

临床分子诊断的标准化摘要：临床实验室分子诊断涉及病原体核酸、人类基因和各种蛋白等大分子的测定, 在许多临床疾病的诊断方面, 有极为关键的作用。

在日常检验工作中应用标准物质, 分子诊断为遗传病诊断的重要手段，因其具有直接诊断性、高特异性、灵敏性、早期诊断性的特点，弥补了表型诊断的不足而被广泛应用。

遗传病的分子诊断是利用分子遗传学技术在DNA或RNA水平上对某一基因进行突变分析，从而对特定疾病进行诊断。

关键词：分子诊断；标准化；临床应用在临床应用中, 目前仍存在同一实验室不同检测批次间或不同实验室对同一标本检测间结果的差异, 这已成为时常困扰临床医师、患者以及实验室技术人员的普遍性问题。

此外, 这也是当前不同实验室间结果有条件互认的一个巨大障碍。

而造成不同临床实验室间检验结果差异的原因, 通常包括临床标本的采集、试剂方法、测定操作、仪器设备的维护校准、数据处理及结果报告、标准物质及质控物的应用等方面的不规范等因素。

然而, 仪器设备、试剂生产厂家和临床实验室本身在临床实验室分子诊断标准化中起着非常关键的作用。

一、临床实验室分子诊断标准化1、临床标本采集、运送和保存的标准化。

临床标本的采集、运送和保存对检验结果往往有决定性的影响, 而这些问题常涉及临床实验室与其他相关科室的工作分工与协作, 此点以前不太被关注或认为是难以控制的问题。

但为保证得到正确的检验结果,必须制定一个规范的临床标本采集、运送和保存的程序。

常用的临床标本通常有血清(浆)、全血、分泌物、组织、尿液、脑脊液及其他体液等。

对这些标本的采集、运送和保存的标准化主要是对标本采集的具体方法、所用容器、采集量、采集时所用材料和用具、运送方式和不同时间中标本保存条件等做出明确而又详尽的规定, 写成标准操作程序SOP;并对参与该程序运行的相关人员进行必要的培训, 及时与临床科室进行全面而有效的“对话”包括工作沟通、定期质量评价、纠错措施, 是保证所制定的程序得到确实执行的必不可少的环节。