高糖对体外培养兔视网膜Mailer细胞表达血管内皮生长因子的影响
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高糖对体外培养兔视网膜Ｍａｉｌｅｒ细胞表达血管内皮生长因子
的影响
[摘要]目的探讨高糖对体外培养兔视网膜Mailer细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响。
方法体外培养兔视网膜Mailer细胞，采用免疫细胞化学方法半定量检测不同浓度葡萄糖对视网膜MUller细胞表达VEGF的影响。
结果高糖可以明显增加Mailer细胞VEGF的表达，且具有一定的浓度依赖性。
结论高糖促进体外培养兔视网膜MUller细胞VEGF的表达，提示高血糖作为糖尿病视网膜病变(DR)的始动因素，其可能机制之一为诱导Mailer细胞VEGF的表达。
[关键词]糖尿病视网膜病变；葡萄糖；视网膜Mailer细胞；血管内皮生长因子；细胞培养；免疫细胞化学
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一，是患者视力丧失的主要原因，其病理特征是血一视网膜屏障的破坏以及新生血管的形成。
高血糖为糖尿病慢性并发症的始动因素，其具体病理生理学机制十分复杂，目前对其尚存分歧。
血管内皮生长因子(vascular endotheli-al growth factor，VEGF)作为主要的促血管生成及促血管通透的因子在DR的发生发展中具有重要作用。
本研究拟通过观察高糖对体外培养兔视网膜MUller细胞表达VEGF的影响，进一步探讨DR发生发展的机制。
1材料和方法
1.1兔视网膜Mailer细胞的体外培养
按刘瑶、汪峻岭等的方法并稍加改进分离培养视网膜Muller细胞。
取重约20kg的健康新西兰大白兔1只(由东南大学医学院动物实验中心提供)，耳缘静脉注入10ml空气处死后，无菌条件下迅速取出兔眼球，用含有庆大霉素的生理盐水(8万U／250m1)彻底冲洗。
自锯齿缘后约1-2mm处环行剖开眼球，去除眼前部组织及玻璃体，轻轻剥取视网膜组织，DMEM冲洗粘着的色素上皮细胞(RPE)后铺平视网膜组织，体视显微镜下撕下不含血管及髓放线的部分并将其剪成约1mm×1mm大小，加入DMEM培养液制成组织块悬液，离心(800r·min-1)5min 后弃上清，加入含有20％胎牛血清的DMEM培养液再次制成组织块悬液，接种入培养瓶中，置入恒温湿热培养箱(37度，含5％CO2、95％空气)中培养，待组织块贴壁。
每周换液2次，原代细胞生长融合至一定数量即予以传代。
培养的细胞经免疫细胞化学方法证实为Mailer细胞。
1.2实验分组
根据DMEM培养液中含葡萄糖浓度的不同分为 5.5、10、20、30、40、50mmol·L-16个浓度组，每组分别干预3、6和9d。
具体为第1代兔视网膜Mailer 细胞达80％融合状态时，予以0.25％胰蛋白酶消化，用含20％胎牛血清的DMEM 培养液制成细胞悬液并调整细胞密度约为(1-2)×105ml-1，接种至预置有小玻片的6孔培养板中，置于37度，含5％CO2、95％空气的恒温湿热培养箱中培养，而后用含有不同浓度葡萄糖的DMEM培养液进行干预。
1.3VEGF免疫细胞化学
分别于3、6和9d后取出部分小玻片，以pH7.2－7.6PBS清洗，冰丙酮固定；PBS冲洗，3％H2O2阻断内源性过氧化物酶；PBS冲洗，5％BSA液封闭，甩去不洗；加人兔源抗兔VEGF多抗，阴性对照加PBS,4度保湿过夜；PBS冲洗，加入羊抗兔IgG二抗(亲和纯化抗体，标记有生物素)37度孵育20min；PBS冲洗，加入联袂亲和苏一生物素一过氧化物酶复合物(SABC)37度孵育20min；PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片，摄片。
上述一抗、二抗SABC 试剂盒及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.4结果判定
经免疫细胞化学染色后细胞浆内有棕色或棕黄色染色为阳性着色，若无棕色或棕黄色染色则为阴性。
免疫细胞化学图像半定量分析用IPP5.0.1分析软件进行分析，每张切片任选6个视野，在每个视野内选定阳性细胞范围，测定其平均光密度(mean opticaldensity，MOD)。
1.5统计学处理
实验数据结果表示，组间比较采用￡检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1兔视网膜Mailer细胞形态学
兔视网膜组织块培养至7d左右时，组织块贴壁并从边缘长出数个细胞伪足，而后细胞移出组织块，分裂生长。
至14d左右，细胞融合近80％，此时细胞形态典型，胞体呈长梭形，胞浆丰富，胞核位于胞体中央，椭圆形，有2个或2个以上核仁。
可进行消化传代培养。
2.2不同浓度葡萄糖培养条件下VEGF表达的变化
2.2.1Mailer细胞VEGF表达的光镜观察免疫细胞化学染色光镜观察可见，VEGF表达阳性的Mailer细胞浆内呈阳性着色，随VEGF表达量的不同，阳性着色从淡棕色至棕黄色颗粒状不等，而阴性对照片未见阳性着色。
2.2.2Mailer细胞免疫细胞化学染色免疫细胞化学染色显示，兔视网膜MUller细胞VEGF的表达(以MOD表示)基本上随着葡萄糖浓度的增加逐渐增强(p＜0.05)，但至最高浓度时(即培养液葡萄糖浓度为50mmol·L-1)VEGF的表达又见下降(P＜0.05)：而随着干预时问的延长，Mailer细胞VEGF的表达未见明显的变化。
3讨论
VEGF又称为血管通透因子，是一种自分泌和旁分泌性生长因子，在人体正常组织中有广泛的分布，与维持血管的正常功能状态有关。
作为主要的血管生长因子，VEGF与高亲和力受体结合，可介导强大的促内皮细胞增殖、毛细血管扩张以及增加血管通透性的作用。
缺血、缺氧及非酶糖基化终产物(AGEs)是刺激VEGF分泌的重要因素。
在视网膜内，血管内皮细胞、血管外周细胞、色素上皮细胞(RPE)以及MUller细胞均能合成分泌VEGF；而VEGF受体主要表达于血管外周细胞与血管内皮细胞。
视网膜Mailer细胞是一种特化的视网膜神经胶质细胞，几乎贯穿分布于从内界膜到外界膜的视网膜感觉神经全层，具有维持视网膜正常结构与功能、营养视网膜等多种生理功能。
Mailer细胞参与视网膜的多种病理过程，如参与增殖性玻璃体视网膜病变(prolifera-tive vitreous retinopathy，PVR)的形成，是增殖性视网膜病变的三大效应细胞之一。
关于DR的发病机制，迄今为止已有很多学者从不同方面进行了相关研究，其中涉及生物化学、超微结构变化及血液异常等方面，目前仍在继续探讨中。
现在普遍认为，DR的始动因素为高血糖及组织缺血缺氧。
本研究通过体外培养兔视网膜Mailer细胞，观察不同浓度、不同时间条件下，葡萄糖对Mailer细胞表达VEGF的影响，结果显示随着葡萄糖干预浓度的增加，Mailer细胞VEGF的表达显著增加，但是在葡萄糖达一定浓度后，表达又有所下降。
我们认为Mailer 细胞通过自分泌方式反馈调节VEGF的表达可能为其表达下降的原因之一，关于其具体机制尚有待进一步探讨。
同时，我们发现MUller细胞VEGF的表达随着干预时间的延长未见明显的增加或减少，针对这一点我们正在作进一步的研究。
高血糖是DR的始动因素，其可能作用机制之一为诱导视网膜Mailer细胞VEGF的表达，这对DR发生发展尤其是增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)新生血管的形成具有重要的病理生理学意义，同时也可为DR的防治提供新的靶点。
![高浓度葡萄糖和高浓度胰岛素对体外培养视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i的影响](https://imgs-1438308264.cos.ap-hongkong.myqcloud.com/4e11fc3f941ea76e59fa04aa.webp)