银染考染胶内酶解

原理：蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，检测极限是 2～5.0ng／蛋白条带。

① SDS-PAGE电泳。

注意：银染检测蛋白质的水平是在100ng左右，与CommassieBlue染色比较，银染加样量要少。

否则难以得到清晰的电泳分辨率。

②电泳结束后，戴手套将PAGE胶转移到干净的玻璃培养皿或TIP头盒盖中。

加入25ml FixingSolution（固定液），室温振荡保温30min。

胶需要完全淹没在固定液中。

③彻底弃去固定液，加入25mlIncubation Solution（保育液），室温振荡保温30min。

胶需要完全淹没在保育液中。

④彻底弃去IncubationSolution（保育液），用50ml去离子水洗3次，每次5min。

⑤准备：取2.5ml 10XSilvering Solution, 加入22.5mL水，混匀后使用。

⑥弃去洗涤的水，加入25mlSilvering Solution (银染液)。

室温振荡保温20min。

⑦彻底弃去银染液，加入25mLDevelopingSolution（显色液），室温振荡保温1~10min。

注意观察目的条带。

如果目的条带出现了，可以考虑终止显色。

显色时间不要过长，否则本底较深。

⑧彻底弃去显色液,加入25mLStopping Solution（终止液），室温振荡保温10min。

⑨彻底弃去StoppingSolution（终止液），用50mL去离子水洗3次，每次5min。

弃去洗涤的水，加入25mL PreservingSolution（保护液），室温振荡保温20min。

银染PAGE胶可以拍照保存，也可以室温玻璃纸干燥。

今天第一次银染，结果出来啥也没有，凝胶就像一块海带一样。

能不能提供详细的银染步骤呢？好像有好几种版本，哪位大侠有经验的希望能点拨一下？hotstoe wrote:1. 取下凝胶,蒸馏水冼胶30秒.2. 0.1% 硝酸银染色10分钟.3. 弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟.4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.显色液配方: 10克氢氧化钠+0.2克碳酸钠+2m甲醛溶液,定溶到500ml.这个染色方法挺好的,我用过.注意染色时间不能长.我的经验是：1.取下凝胶用去离子水冼胶30秒三次，2.0.1% 硝酸银染色10分钟.3.弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟（换2次去离子水）4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.不要试图将所有的条带都显出来，要求越高可能导致背景就深，5.染色后要用固定液（冰乙酸）终止染色，6.固定3分钟后再用去离子水洗涤2遍（整个试验比较费去离子水）。

一、试剂准备1．30mmol/L K3Fe(CN)6铁氰化钾9.9 mg K3Fe(CN)6溶于1mL Milli-Q水2．100mmol/L Na2S2O3硫代硫酸钠24.8 mg Na2S2O3溶于1mL Milli-Q水3．200mmol/L NH4HCO3碳酸氢铵0.079g NH4HCO3溶于5 mL Milli-Q水4. 覆盖液（酶解缓冲液）40mmol/L NH4HCO3, 10% ACN200ul 200mmol/L NH4HCO3, 100ul ACN, 700ul Milli-Q水5. 萃取液50％ACN，0.1% TFA6. 胰蛋白酶贮存液：胰蛋白酶溶于50mM醋酸溶液中（1mL Milli-Q水加入冰醋酸2.86 uL），浓度1ug/uL，即每管20ug，溶于20uL 50mM醋酸溶液中。

工作液：使用覆盖液稀释至10ng/uL7. 脱色液银染脱色液：30mmol/L K3Fe(CN)6与100mmol/L Na2S2O3 1:1混合考染脱色液：50％ACN, 40mmol/L NH4HCO3以上试剂单独存放在质谱准备室，不要使用其他来源的药品、试剂，其中脱色液需现用现配。

二、实验步骤1. 切胶用剪刀剪断Tip（进口Tip），将蛋白质斑点从凝胶上切下，置于0.5 mL EP管内（进口产品），每管加Milli-Q水400 uL振荡洗涤2min，吸出液体后重复一次，以保证酸液被洗净。

2. 脱色银染样品：每管加入现配脱色液50-80uL（视胶粒大小而定），静置2min左右，当胶粒由棕黑色变成亮黄色（与脱色液颜色相同时），迅速加入400uL Milli-Q水终止反应，重新加入400uL Milli-Q水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。

（3％H2O2/25mM NH4HCO3/H2O）考染样品：每管加入现配脱色液50-80uL（视胶粒大小而定），静置2min左右，待胶粒蓝色褪却时，加入400uL Milli-Q水终止反应，重新加入400uL Milli-Q水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。

蛋白质胶内酶切步骤一、溶液准备考染脱色液：50mM NH4HCO3/ACN（1：1，vol/vol）；银染脱色液：30mM K3Fe(CN)6/Na2S2O3(1:1,vol/vol);铁氰化钾/硫代硫酸钠覆盖液：25mM碳酸氢铵溶液；酶液：2ug分装后的promega质谱级胰酶，用160ul 覆盖液充分混和溶解；萃取液：5%甲酸/乙腈（1：2，vol/vol）；二、操作步骤1.水洗胶块2次，吸走液体；2.胶块脱色。

1）考然胶块：加考然脱色液100ul（溶液的量视胶块具体大小而定）室温脱色1h 左右，直至胶块的颜色完全褪去，吸走液体；水洗胶块2次，将脱色后的染料洗去，吸走液体；2）银染胶块：加银染脱色液50ul（溶液的量视胶块具体大小而定）室温脱色5min，至胶块颜色完全褪去；迅速将脱色液吸走，并加水终止；水洗胶块3次，至胶块变得完全无色透明；3.胶块脱水。

加50%ACN溶液，让胶块脱水；再加100%CAN，让胶块变白完全脱水；分别吸走液体；4.还原烷基化（SDS一维电泳条带，请做此步；2D电泳点不需要此步）1)加入50ul 10mMDTT溶液（溶于25mM NH4HCO3），56℃水浴50min；离心，吸走液体；2)加入50ul 55mM IAA溶液（溶于25mM NH4HCO3），避光反应15min；吸走液体；3)加入100ul水洗胶块，将反应剩余液体吸走；4)胶块脱水，重复步骤4；6．加入胰酶5-20ul（具体视胶块大小而定），让胶块充分吸胀，变透明20min，再剩余1-3ul的酶液；7. 37℃水浴过夜16h；8. 若做MALDI-MS分析，则直接取酶解液上清点样做质谱即可；若做ESI-LCMS分析则需要萃取胶内的多肽，分别加100ul萃取液，超声10min萃取两次，冷冻干燥待做LCMS；。

三、制备方法（一） 胶内酶解方法[9]1.操作步骤1)用手术刀片切下电泳胶上目标条带(或用自制切点器切下感兴趣的点)，置于EP管中(胶块切成约1mm3大小)，同时切下空白胶块作对照2)加入200～400ul 100mM NH4HCO3/30%ACN脱色，清洗至透明，去除上清，冻干(注：脱色液体积过量为好，脱色至透明，不必担心蛋白的损失，因为完整蛋白在此条件下很难被洗脱)(若为银染)[10]取30～50ul 30mM K3Fe(CN)6:100mM Na2S2O3=1:1(体积比)加入胶块内，清洗至蛋白点棕色消失，去除上清，立刻加200ul水终止反应，10分钟后，去除上清，再加入100ul 100mM NH4HCO3,静置20分钟，去除上清3)(若是2-D gel，则跳至第8步) 每管加入90ul 100mM NH4HCO3，10ul 100mM DTT，56℃孵化30分钟，还原蛋白质(注：溶液体积过量，若温度为室温，反应时间相应延长至1～2小时)4)去上清，每管加100ul 100%ACN，5分钟后吸去5)每管加入70ul 100mM NH4HCO3，30ul 200mM IAA(现配，避光保存)，暗处20分钟6)去上清，每管加入100ul 100mM NH4HCO3，室温15分钟7)去上清，加入100ul 100%ACN，5分钟后吸去，冻干8)冻干后，各加入5ul 2.5～10ng/ulTrypsin溶液，置于4℃冰箱30～60分钟，使胶块充分吸胀(若仍有剩余液，吸出打掉)注：50ng酶量是基于考染一块胶1mg的上样量，12.5ng是基于银染一块胶100ug的上样量。

上样量增加，酶量同比增加，酶与被分析蛋白质量比一般为1：20～1：100[11,12]9)再加入20~30ul左右50mM NH4HCO3缓冲液(无Trypsin)，PH 7.8～8.0(Promega)注：缓冲液体积视胶块体积而定，一般没过胶块20ul左右10)37℃反应过夜，20小时左右11)吸出蛋白酶解液，转移至新EP管中，原管加入100ul 60% ACN/0.1%TFA,超声15分钟，吸出溶液，并入前次溶液，反复抽提3次，合并，冻干12)样品制备完成，可以复溶，点样，进行质谱分析2.注意事项1)若样品种类较多，切记编号离心管，样品对号入管2)考染方案各注释均适用于银染方案3)整个操作过程应注意角蛋白等的污染4)佩带一次性乳胶手套，使用洁净的离心管及Millipore H2O5)不同公司的酶，最适PH范围不同，调节PH值3.试剂配制1)100mM NH4HCO3：称取1.581g NH4HCO3(MW 79.06)溶于200ml Milli Q水中2)50 mM NH4HCO3：称取0.791g NH4HCO3溶于200ml Milli Q水中3)100mM DTT：称取DTT(MW 154.3)0.0154g溶于1ml 100mM NH4HCO3溶液中4)200mM IAA：称取IAA(MW 185.0)0.0370g溶于1ml 100mM NH4HCO3溶液中5)TPCK-Trypsin无需配制，Promega公司已提供成品，浓度为0.5ug/ul，用时可按需稀6)30mM K3Fe(CN)6：称取K3Fe(CN)6(MW 329.25)0.0099g溶于1ml Milli Q水中7)100mM Na2S2O3·5H2O：称取Na2S2O3(MW 248.11)0.0248g溶于1ml Milli Q水中8)银染脱色液：将6)和7)以1:1体积混合，现配。

蛋白质胶内酶切步骤一、溶液准备考染脱色液：50mM NH4HCO3/ACN（1：1，vol/vol）；银染脱色液：30mM K3Fe(CN)6/Na2S2O3(1:1,vol/vol);铁氰化钾/硫代硫酸钠覆盖液：25mM碳酸氢铵溶液；酶液：2ug分装后的promega质谱级胰酶，用160ul 覆盖液充分混和溶解；萃取液：5%甲酸/乙腈（1：2，vol/vol）；二、操作步骤1. 水洗胶块2次，吸走液体；2. 胶块脱色。

1）考然胶块：加考然脱色液100ul（溶液的量视胶块具体大小而定）室温脱色1h 左右，直至胶块的颜色完全褪去，吸走液体；水洗胶块2次，将脱色后的染料洗去，吸走液体；2）银染胶块：加银染脱色液50ul（溶液的量视胶块具体大小而定）室温脱色5min，至胶块颜色完全褪去；迅速将脱色液吸走，并加水终止；水洗胶块3次，至胶块变得完全无色透明；3. 胶块脱水。

加50%ACN溶液，让胶块脱水；再加100%CAN，让胶块变白完全脱水；分别吸走液体；4. 还原烷基化（SDS一维电泳条带，请做此步；2D电泳点不需要此步）1) 加入50ul 10mMDTT溶液（溶于25mM NH4HCO3），56℃水浴50min；离心，吸走液体；2) 加入50ul 55mM IAA溶液（溶于25mM NH4HCO3），避光反应15min；吸走液体；3) 加入100ul水洗胶块，将反应剩余液体吸走；4) 胶块脱水，重复步骤4；6．加入胰酶5-20ul（具体视胶块大小而定），让胶块充分吸胀，变透明20min，再剩余1-3ul 的酶液；7. 37℃水浴过夜16h；8. 若做MALDI-MS分析，则直接取酶解液上清点样做质谱即可；若做ESI-LCMS分析则需要萃取胶内的多肽，分别加100ul萃取液，超声10min萃取两次，冷冻干燥待做LCMS；。

双向电泳技术手册之四:胶蛋白质点的检测(考染和银染)第四章2-DE 胶蛋白质点的检测2-DE 胶蛋白质点的检测方法大致有：1）考马斯亮兰染色法；2)银染法；3）负染法；4）荧光染色法；5 ）放射性同位素标记法等。

这几种检测方法的灵敏度各不相同。

目前最常用的是银染法和考染法。

由于银染的灵敏度是考染的50 倍，故一般用银染法进行分析处理，再用考染法来进行样品微量制备。

4.1考马斯亮兰染色:4.1.1经典的考马斯亮兰染色程序：1 固定20 % TCA 1h2 染色0.1% CBB in 40% EtOH/10% acetic acid 2h3 脱色40% EtOH&10% acetic acid 2x 30 min4 强化1% acetic acid overnight5 清洗deionized H2O 30 min局限：灵敏度低（≈1μg protein/spot）4.1.2 Neuhoff 胶体考染法：1 固定：12％（w/v）三氯醋酸（TCA）2h2 染色：200ml 染色液混合50ml 甲醇16-24h染色液：在490ml 含2％（w/v）的H3PO4中加50g (NH4)2SO4 直至完全溶解，再加0.5g CBB G-250（已溶于10mlH2O中），搅拌混合。

无需过滤，使用前摇匀。

3 漂洗：1）0.1mol/L Tris-H3PO4缓冲液（pH 6.5）漂洗两分钟；2）25％（v/v）甲醇漂洗不超过1min4 稳定：在20％的(NH4)2SO4中稳定蛋白质－染料复合物。

优点：背景低，灵敏度高，可达到200ng protein/spot.4.1.3 热考马斯亮兰染色及二次染色法：1 染色（0.025%(w/v) 考马斯亮兰R350）：将1 片Phast Gel Blue 药片溶入1.6L 10%醋酸，将染色液加热到90℃倒入凝胶染色盘，振荡10min；2 脱色：10%醋酸室温振荡脱色2h ，期间需多次更换脱色液，脱色液可通过铺有活性炭的滤纸层过滤回收；脱色液和染色液可重复使用。

凝胶蛋白质点的酶解一.蛋白质点酶解准备工作：1．检查冻干机，调好水浴锅（37℃，56℃）2．检查各种试剂的量是否足够（DTT IAA NH4HCO3）3．检查酶解房卫生状况每一步注意事项：1．每一步加入的液体量视胶块大小定，一般是50uL/管2. 每次震荡后随手甩一下，以便把胶块和管壁上的液滴甩下来3. 每次打开EP管盖子前，确认胶块在管内，并将胶块甩至管底。

开盖子动作尽量轻巧，以免胶块弹出。

4．在冻干样品后，要确保样品在管底，以防样品与封口膜一起被去掉。

酶解前配制1）、100 mmol/L的NH4HCO3参考配制10mL 称79.06mg NH4HCO3溶于10mL水中以后每一步25 mmol/L的NH4HCO3可用100 mmol/L的NH4HCO3稀释。

2）、1mol/L的DTT参考配制10ML 称1.55gDTT溶于10mL水中，1mL分装，避光贮存（锡箔包），-20度永久保存考染酶解步骤: 调水浴锅到37℃以便做脱色用，此外，调水浴锅到57℃，以便做还原用。

1.冲洗胶块：用水洗衣胶块2次，2. 脱色：用含有25mmol/L的NH4HCO3的50%的乙腈37℃保温30min。

如第一次脱色不完全可再脱一次色2.干燥：吸出液体后，先加50%的乙腈，再加100%的乙腈调水浴锅到57℃，以便做还原用。

4．还原：加入还原剂，封口，57℃水浴一小时，还原蛋白质。

还原剂：25mmol/L的NH4HCO3（含10mmol/L DTT）参考配制方法（4mL）：6.2mgDTT溶于4mL 25mmol/L的NH4HCO3中注意事项：1. 注意在水浴锅上写纸条标明使用者名字，水温和使用的时间段，方便实验之间的协调和发生停电等意外情况时别的同学帮助临时处理样品。

2．水浴锅用完后恢复到还原前的初始状态，以免后来的同学做实验时因为习惯或者经验忽略此处造成不必要的失误。

5．烷基化将样品从水浴锅中取出后，室温冷却，去掉液体，迅速加入同样体积的烷基化试剂室温暗处放置45min，使之碘乙酰胺化。

胶上酶切方法1．切胶：用切胶笔、枪头或刀片切取胶粒（胶粒直径1-2mm），置于1.5ml Appendorf 试管中。

2．清洗：用200ul洗2次，每次10分钟。

3．脱色：对于考染胶，加200ul考染脱色液（25mM NH4HCO3, 50% CH3CN），超声脱色5分钟或37℃20分钟，吸干。

反复洗至胶粒基本无色；对于银染胶，可以不脱色，也可以加100ul银染脱色液(15mM K3Fe(CN)6, 50mM Na2S2O3）轻摇至变为淡黄色透明，再用水反复洗至无色）。

4．脱水：加CH3CN 100ul，使胶粒变白，吸弃CH3CN。

5．还原：加10mM DTT（溶于25mM NH4HCO3）20ul，37℃水浴1小时。

6．烷基化：冷至室温，吸弃溶液。

快速加30mM IAA（溶于25mM NH4HCO3）20ul，置于暗室45min。

（对于二维胶，可以省略还原和烷基化步骤）7．清洗：依次用双蒸水（2次）和50%CH3CN（2次）进行超声或混悬清洗,每次10分钟。

8．脱水：加CH3CN 100ul，使胶粒变白，吸弃CH3CN。

9．将0.1ug/ul酶液用25mM NH4HCO3稀释10-20倍，每管加2-3ul，稍微离心一下，让酶液与胶粒充分接触，4℃放置30min 。

待酶液被胶粒完全吸收后，加入10-15ul 25mM NH4HCO3，37℃过夜。

10. 离心收集酶解液，点靶。

注：1）每加一次溶液，都要旋涡振荡，胶粒要充分浸没在溶液中，进行下一步操作前把溶液吸走。

2）保持溶液和用具洁净，防止污染。

AnchorChip 点样须知1．配基质溶液：0.4mg/ml HCCA in A T (ACN: 0.1%TFA=70:30).2. 点样（二步法）：取样品酶解液1ul (考染样品)或2ul (银染样品)点靶，晾干。

3.点基质：取1ul基质点在晾干的样品上。

4.点标准品：将1 pmol/ul的肽混合物标准品用基质溶液稀释100倍后，取1 ul点靶，晾干。