实验二：细菌涂片的制备和染色镜检

实验二：细菌的简单染色和革兰染色一、实验目的1.掌握细菌涂片的制备方法。

2.掌握细菌简单染色和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。

3.巩固显微镜油镜的使用方法。

4.学习无菌操作技术。

二、实验原理1、染色原理：细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。

当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。

2、革兰染色法原理：革兰染色法可根据细菌细胞壁结构和成分的不同，将其分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。

革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。

另外，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果。

如酵母菌细胞壁的成份完全与细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。

三、实验仪器，材料和用具1、仪器及用具：显微镜、酒精灯、火柴、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、镜油、无菌牙签2、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、牙垢、未知菌S1和S33、试剂：结晶紫染液、革氏碘液、洗脱液（95%乙醇溶液）、番红染液四、实验步骤（1）简单染色1、载玻片的处理：用纱布将取出的载玻片擦干，把要涂菌的部位在火焰上烤一下，冷却待用。

2、涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂一直径约2mm的均匀薄膜。

3、干燥：涂片后待其自然干燥。

4、固定：将以干燥好的涂片标本朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，要求载玻片温度不能超过60度，以手背触载片不烫为宜。

5、染色：滴加一滴结晶紫染液，染色1min。

细菌革兰氏染色实验报告细菌革兰氏染色实验报告一、实验目的1.掌握革兰氏染色的方法2.熟悉细菌涂片的制备3.革兰氏染色法进行细菌鉴定二、实验材料1.实验仪器显微镜、酒精灯、载玻片、擦镜纸、接种环,接种针,、试管架、镊子、载玻片夹子、滤纸、滴管2.实验试剂草酸铵结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、番红复染液、无菌水,蒸馏水,、香柏油、二甲苯三、方法与步骤1.操作方法示意图,干燥, ,水, ,水, ,水, ,晾干, 制片——初染———媒染———脱色———复染——镜检 2.操作步骤,步骤一,涂片的制作(1) 涂片载玻片一张,加一滴生理盐水,取菌研磨均匀 (2) 干燥温室干燥,或置酒精灯高处慢慢烘烤(3) 固定干燥后的涂片,在酒精灯火焰中通过3次步骤,二,初染,滴加草氨酸结晶紫染液覆盖涂菌部位,染色1—2min,后倾去染液,水洗至流出水无色步骤,三,媒染,先用碘液冲去残留水迹,在用碘液覆盖1min,倾去碘液,水洗至流出水无色步骤,四,脱色,将玻片上残留水用吸水纸吸去,在白色背景下用滴管流加95%乙醇脱色,一般20——30s,,当流出液无色时立即用水洗去乙醇。

步骤,五,复染,将玻片上残留水用吸水纸吸去,用番红复染液染色2min ,水洗,吸去残水晾干。

步骤,六,镜检,像涂片涂菌部位滴加适量香柏油,进行油镜观察【小结】1. 选用活跃生长期长的菌种染色,老龄的革兰氏阳性菌会被染成红色,造成假阴性。

2. 涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性3. 脱色是革兰氏染色是否成功的关键,脱色不够,造成假阳性,脱色过度造成假阴性。

4. 染色原理C+菌,胞壁厚,肽聚糖网状分子形成一种透性障,当乙醇脱色时,肽聚糖脱水而孔障缩小,故保留结晶紫—碘复合物在细胞膜上呈紫色 C-菌,肽聚糖层薄,交联松散,乙醇脱色不能使其结构收缩,其脂含量高,乙醇将脂溶解,缝隙加大,结晶紫—碘复合物溶出细胞壁,沙皇复染后呈红色。

【注意事项】1. 加热时使用载玻片及试管夹,以免烫伤。

细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告实验三细菌的简单染色和革兰氏染色实验三细菌的简单染色和革兰氏染色一、目的与要求1、掌握细菌涂片标本的制备2、掌握革兰氏染色法的步骤和关键点3、识别细菌革兰氏染色结果二、实验原理：细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。

为什么要对细菌染色？细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。

简单染色法可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。

革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G?)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。

其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。

革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞壁内使细胞呈蓝紫色，而革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，再经番红复染后细胞呈红色。

三、实验器材1、菌种牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h的大肠杆菌(Escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h的枯草杆菌(Bacillus subtilis)斜面菌种；2、仪器显微镜；3、材料载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。

4、染料草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液；细菌的简单染色步骤：细菌的革兰氏染色步骤：涂片,干燥,固定,结晶紫染色,水洗,碘液媒染,水洗,乙醇脱色,水洗,番红复染,水洗,干燥,镜检.五、实验关键步骤和注意点：1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。

实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）一目的要求1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。

2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。

3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。

二实验内容与原理1．简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。

由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。

美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。

染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。

简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检涂片→ 固定→ 干燥→ 水洗、吸干→镜检→染色 1mim2．革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。

它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。

革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。

（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。

（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。

（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。

（5）干燥。

（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。

注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。

学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。

观察细菌个体形态与排列，绘图。

3．芽孢染色原理细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。

实验四细菌抹片的制备及染色实验班级：2017级牧医高职（动物微生物）指导老师：陶波实训地点：实训室207时间：2018年6月【目的要求】1.掌握细菌抹片的制备方法和几种常用的染色方法。

2.认识革兰氏染色和瑞特氏染色的反应特性。

【实验材料】试剂用品：载玻片、接种棒、酒精灯、吸水纸、生理盐水、染色液等。

菌种：羊、兔粪便便中提取培养的细菌。

【实验内容】一、细菌涂片的制备1.载玻片准备载玻片应清晰透明，如有残余油渍，可用95%酒精清洗。

2.抹片根据材料情况不同，抹片方法也有差异。

液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等）可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片中央均匀涂布适当大小或可采用推片法。

非液体材料（菌落、脓、粪便）应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂抹成适当大小的薄层。

组织脏器材料可先用镊子夹持中部，然后以灭菌或洁净剪刀取一小块，夹出后将其新鲜切面在玻片上触片或涂抹成薄层。

3.干燥上述涂片应让其自然干燥或适当烘干处理。

4.固定有两类固定方法火焰固定法：将干燥好的抹片使其涂抹面向上，以其背面在酒精灯外焰来回拖过数次，略作加热进行固定。

化学固定法：血液、组织脏器等抹片要做姬姆萨染色，不同火焰固定，可将干燥后的抹片滴加数滴甲醇其实作用2~3min后自然干燥进行固定（瑞士染色可不做甲醇固定）。

二、几种常用的染色方法（一）姬姆萨染色将足量的姬姆萨溶液（或将姬姆萨原液稀释）滴加到抹片上，或将抹片浸入盛有姬姆萨染液的染缸中浸染30min 至数小时，取出后水洗，吸干水分后镜检。

（二）瑞特氏染色瑞氏染料是碱性美蓝与酸性伊红混合而成的染料，当溶于甲醇后立即发生分离，分解成酸性和碱性两种染料。

由于细菌菌体蛋白偏酸性，菌体带负电（菌体蛋白等电点多在pH2~5），被染成蓝色。

在以固定好的涂片或触片上滴加足量的瑞氏染液，染色3~5min后水洗，吸干水分后镜检（如染色不理想可重复几次）。

技能训练2 细菌标本片的制备和染色法一、目的要求：正确掌握细菌培养物涂片的制作和常用染色法二、设备材料病料、细菌培养物、接种环、玻片、酒精灯、染色缸、染色架、染色液等。

三、操作方法细菌标本片制作的基本步骤为：涂片或触片→干燥→固定→染色→镜检。

(一)细菌涂片的制备1．液体培养物及液体病料(1)涂片用接种环取一滴培养液或液体病料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。

(2)干燥一般采用自然干燥，天气较冷时也可于酒精灯火焰上方30～40cm处适当加热干燥。

(3)固定分为火焰固定和化学固定两种。

火焰固定时，将干燥好的玻片涂面朝上，以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热，以不烫手背为度；化学固定时，可将干燥好的玻片浸入甲醇中2～3min后取出晾干，或在涂片上滴加数滴甲醇使其作用2～3min后自然挥发干燥。

此外，丙酮和酒精也可用作化学固定剂；作瑞特氏染色的涂片不需固定，因染色液中含有甲醇，有固定作用。

(4)染色根据不同的材料和菌种选择不同的染色法。

2．固体培养物用接种环取一滴生理盐水于玻片的中央→用接种环挑取一个菌落于生理盐水中混合→均匀地涂布成适当大小的薄层→干燥→固定→染色。

(二)细菌触片的制备将固体病料(病变组织)作无菌切开→用切面在玻片的中央接触一下或稍用力印压成一薄层→干燥→固定→染色。

(三)细菌的染色法1．单染色法又称简单染色法，即只应用一种染料进行染色的方法。

(1)美蓝染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加适量的美蓝染色液1—2min后，水洗，干燥(吸水纸吸干或自然干燥)，镜检。

(2)瑞特氏染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加瑞特氏染色液，为避免干燥，可适当多加一些，或视情况补充滴加，1—3min后再加与染液等量的中性蒸馏水或缓冲液，轻轻晃动玻片，使之与染色液混合均匀，再经3—5min后，直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。

也可在玻片上的涂抹处盖一适当大小的滤纸，然后再在滤纸上轻轻滴加瑞特氏染色液，至略浸过滤纸，视情况补充滴加，维持不干，3—5min后直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。

实验二微生物染色一、实验目的1、进一步熟悉和掌握显微镜的操作方法；2、学习用压滴法制作标本片；3、学习微生物染色的原理；4、学习微生物涂片、染色的基本技术。

二、实验仪器和材料显微镜、香柏油（或液体石蜡）、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯；美蓝染液，草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95%乙醇、蕃红染液；酵母菌、大肠杆菌、枯草杆菌。

三、染色原理微生物（尤其是细菌）的机体小且是无色透明的，在活体细菌内又含有大量的水分。

因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。

当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有明显的明暗差，难以看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。

通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，在显微镜下观察。

微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其它化合物组成的，所以微生物细胞表现出两性电解质的性质。

两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性，带正电；在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性，带负电。

经测定，细菌的等电点pI在pH=2~5之间，故细菌在中性（pH=7）、碱性（pH > 7）或偏酸性（pH=6~7）溶液中，细菌等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的居多。

碱性染料并不是碱而是一种盐，电解时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合，而使细菌着色。

碱性染料有美蓝、甲基紫、结晶紫、龙胆紫、碱性品红、中性红、孔雀绿和蕃红（沙黄）等。

微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。

四、染色方法1、简单染色法简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。

此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。

常用的简单染色染料有美蓝、结晶紫、碱性复红、番红（沙黄）等。

2、革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。

它是1884年由丹麦医师Gram创立的。

革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：革兰氏阴性细菌（G－）和革兰氏阳性细菌（G+）。

实验二细菌抹片的制备及染色一、提前十分钟进入实验室，抄写板述。

上课，点名入座。

板述内容：一）、目的要求1、掌握细菌抹片的制备方法2、掌握细菌的革兰氏染色法二）、实验内容1、每人做一张葡萄球菌的固体抹片，用美兰染色。

2、每人做一张大肠杆菌与葡萄球菌的混合抹片，并用革兰氏法染色。

3、油镜观察自制的玻片及真菌标本片，（烟曲霉、黄曲霉、酵母菌）4、组织抹片，并用瑞氏染色液染色（示教）三）作业1、叙述细菌抹片的制备方法2、叙述革兰氏染色的方法3、绘出细菌形态图并注明染色方法二、总结上次实验作业，有两个突出问题。

1、多数同学画的是书上的细菌图，细胞臂、荚膜清晰可见，而镜检时只能看到细菌的大致形态，如大肠杆菌是一个两端钝圆的杆状轮廓，另外，镜检时菌毛和鞭毛是不能观察到的，除非用特殊的染色方法。

2、有的同学没有用圆规画图，图片绘制得过大或过小。

三、实验第一部分：抹片的制备1、实验的目的和意义细菌细胞微小，无色而半透明，原样直接在普通光学显微镜下观察，只能大致见到其外貌，制成抹片和染色之后，则能较清楚地显示其形态和特殊构造，也可以根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据。

2、细菌抹片的制备进行细菌染色之前，须先作好细菌抹片，其方法如下：（1）玻片准备载玻片应清晰透明、洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。

如有油渍，可按下列方法处理：A、滴上95%酒精2-3滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻拖过几次。

B、若上法仍未能去除油渍，可再滴上1-2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻通过。

（2）抹片所用材料情况不同，抹片方法亦有差异。

A、液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等）可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。

B、非液体材料（如菌落、脓、粪便等）则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。