下载文档原格式
免疫沉淀免疫共沉淀免疫沉淀和免疫共沉淀是常用的免疫学实验技术，用于检测蛋白质间的相互作用以及蛋白质的表达水平。
本文将分别介绍免疫沉淀和免疫共沉淀的原理、步骤和应用。
一、免疫沉淀免疫沉淀是通过抗体的高选择性与目标蛋白质结合，再利用沉淀剂将抗体和结合的蛋白质分离出来。
其原理是利用抗体与抗原的特异性结合，形成免疫复合物，并通过沉淀剂使复合物从溶液中沉淀下来。
免疫沉淀的步骤如下：1. 准备样品：将待测蛋白质提取出来并进行预处理，如裂解细胞、去除细胞碎片等。
2. 结合抗体：将抗体与待测蛋白质进行孵育，使其发生特异性结合。
3. 沉淀复合物：加入沉淀剂（如蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G磁珠），使免疫复合物沉淀下来。
4. 去除上清：将上清去除，保留沉淀的免疫复合物。
5. 洗涤：通过洗涤步骤去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。
6. 脱离抗体：使用洗涤缓冲液将免疫复合物与抗体分离开。
7. 分析：将沉淀的免疫复合物进行后续分析，如Western blot、质谱等。
免疫沉淀的应用：1. 确定蛋白质间的相互作用：通过沉淀目标蛋白质及其相互作用的蛋白质，可以鉴定蛋白质间的相互作用关系。
2. 鉴定蛋白质的修饰：通过沉淀修饰蛋白质及其相关蛋白质，可以鉴定蛋白质的翻译后修饰。
3. 确定蛋白质的表达水平：通过沉淀目标蛋白质及其相关蛋白质，可以确定目标蛋白质的表达水平。
二、免疫共沉淀免疫共沉淀是在免疫沉淀的基础上进行的一种技术，旨在检测蛋白质与其他分子（如蛋白质、RNA）之间的相互作用。
其原理是利用抗体与目标蛋白质结合，再利用沉淀剂将抗体、目标蛋白质以及与其相互作用的分子沉淀下来。
免疫共沉淀的步骤如下：1. 准备样品：将待测蛋白质提取出来并进行预处理，如裂解细胞、去除细胞碎片等。
2. 结合抗体：将抗体与待测蛋白质进行孵育，使其发生特异性结合。
3. 沉淀复合物：加入沉淀剂，使免疫复合物及其相互作用的分子沉淀下来。
4. 去除上清：将上清去除，保留沉淀的免疫复合物及其相互作用的分子。
免疫共沉淀实验原理及方法免疫共沉淀（CoIP）概述及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。
免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。
免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。
免疫共沉淀的优势：与其他研究蛋白质相互作用技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相比，免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合，避免了人为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋白可信度更高。
免疫共沉淀的局限性和注意事项：1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到；2. 由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种pull-down抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP；3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大；4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白，则需要在试验前进行预测，具有一定的冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高；5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测；6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员[1]免疫共沉淀的一般操作流程（中英文对照）：1.用预冷的PBS洗涤细胞两次；Carefully wash cultured cells with pre-chilled PBS for 2 times.2. 加入预冷的RIPA裂解缓冲液（107细胞加入1ml）；Add in cold RIPA lysis buffer (1ml for 107cells).3. 用预冷的细胞刮将细胞从培养介质上刮离，并转移到干净的1.5EP管中。
利用免疫共沉淀技术研究RSV呼吸道合胞病毒（RSV）是一种常见的呼吸道病毒，引起婴幼儿病毒性肺炎和支气管炎等疾病。
RSV感染具有较高的发病率和死亡率，尤其对儿童和老年人等免疫力较弱的人群危害更大。
因此，研究RSV的致病机制和抗病毒药物的研发是当前的重要课题。
本文利用免疫共沉淀技术，旨在探讨RSV感染后与人体蛋白之间的相互作用，以期为RSV致病机制的研究提供新的思路。
过去的研究主要集中在RSV的病毒结构、基因组、临床表现等方面，对于RSV与人体蛋白之间的相互作用研究较少。
免疫共沉淀技术是研究蛋白质相互作用的经典方法之一，具有较高的灵敏度和特异性。
然而，由于RSV感染的复杂性，单一的免疫共沉淀实验难以全面揭示RSV与人体蛋白之间的相互作用，因此需要进一步完善实验方法和数据分析。
免疫共沉淀技术的基本原理是利用抗体与抗原的特异性结合，将混合溶液中的目标蛋白质与其他蛋白质分离出来，经过洗脱、纯化等步骤，最终获得纯度较高的目标蛋白质。
在本研究中，我们首先确定了实验流程：RSV感染细胞→细胞裂解→免疫共沉淀实验→质谱分析→数据解读。
然后，我们根据实验流程挑选出高质量的抗体，确保抗体的特异性识别RSV抗原。
在质谱分析环节，我们采用液相色谱-质谱联用技术对获得的共沉淀物进行分析，从而确定与RSV相互作用的蛋白质。
通过免疫共沉淀实验和质谱分析，我们获得了与RSV相互作用的蛋白质清单，并进行了数据解读。
结果表明，RSV与多种人体蛋白发生相互作用，这些蛋白质主要参与细胞代谢、细胞信号转导、免疫应答等方面。
我们还发现了一些与RSV感染密切相关的蛋白质，如病毒进入细胞的相关蛋白、病毒复制所需的蛋白质等。
这些结果为深入探讨RSV的致病机制提供了有益的信息。
对实验结果进行详细分析发现，RSV与人体蛋白之间的相互作用具有以下特点：RSV与细胞膜表面的糖蛋白、细胞骨架蛋白等相互作用，这有助于病毒进入细胞并在细胞内复制；RSV还与参与细胞信号转导的蛋白质相互作用，这可能干扰和破坏了正常的细胞信号转导途径，导致细胞功能异常；RSV还与免疫应答相关的蛋白质相互作用，这可能抑制了机体的免疫应答，使病毒得以在体内持续存在。
注册┆登录┆发表文章免疫共沉淀原理及实验方法2007-03-22 16:07:46大中小免疫共沉淀一原理：IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
实验最需要注意点就是抗体的性质。
抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。
建议仔细检查抗体的说明书。
特别是多抗的特异性是问题。
其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。
多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。
为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。
另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。
即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。
再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。
每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。
抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。
缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。
欲速则不达，确定好比例很必要。
(待续)二准备：器械#微量高速冷冻离心机#移液枪#旋转盘#电泳设备#vortex震荡器#液氮及组织粉碎器#eppentube试剂#细胞或组织#蛋白定量kit#SDS电泳试剂#抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清)#PBS#NaN3#proteinA sapharose试剂配制抗原蛋白溶解缓冲液1.RIPA缓冲液 (最终浓度)1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)5MNacl 15ml (150mM)0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)20%TritonX-100 25ml (1%)10% DOC 50ml (1%)10%SDS 5ml ( o.1%)TLCK 18.5mg (0.1mM)TPCK 35mg (0.2mM)DDW 395mltoal 500ml另外，使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精，浓度100mM，-20度遮光保存。
染色体免疫共沉淀技术染色体免疫共沉淀技术，听起来就像是一场微观世界里的超级大侦探游戏。
你想啊，染色体就像是一座巨大无比的神秘城堡，里面藏着数不清的宝藏（基因信息）。
而我们的蛋白质呢，就像是城堡里各种各样的小精灵，它们有的在城堡里安居乐业，有的在城堡里调皮捣蛋，和不同的角落（基因区域）有着千丝万缕的联系。
这时候染色体免疫共沉淀技术就闪亮登场啦，它就像一个超酷的魔法捕手。
这个魔法捕手有一个超级厉害的网（抗体），这个网可挑剔啦，只对特定的小精灵（蛋白质）感兴趣。
一旦发现目标，就会以迅雷不及掩耳之势把小精灵给网住，那速度快得就像闪电侠附身。
然后呢，就像揪着小精灵的小辫子一样，连带把小精灵所在的那一小片城堡（和蛋白质结合的DNA片段）也一起拽出来。
这一拽可不得了，就像是从城堡的大拼图里硬生生抠出了一块小拼图。
这个被拽出来的小拼图可珍贵啦，就像是从阿里巴巴的山洞里找到的独一无二的宝藏。
它能告诉我们这个小精灵到底在城堡的哪个角落安营扎寨，又和哪些其他的小秘密（基因调控关系）有关系。
这个技术有时候又像是一场微观版的拔河比赛。
抗体和蛋白质紧紧拉住，而DNA就像是那根被拉来拉去的绳子，最后大家达成一个平衡，被成功分离出来。
如果把染色体比作浩瀚的星空，那基因就是星空中的星星，蛋白质就是围绕着星星转的小行星。
染色体免疫共沉淀技术就像是一个宇宙探索者，把小行星和它对应的星星的关系给搞清楚。
它还像是一个微观世界的红娘，把蛋白质和DNA这两个羞涩的家伙强行拉到一起，然后让我们看清楚它们到底是不是相互心仪（结合）。
在科研的大舞台上，染色体免疫共沉淀技术就是一个超级明星，很多科学家都眼巴巴地望着它，希望它能从神秘的微观世界里挖掘出更多惊人的秘密。
不过呢，这个技术也有点小脾气，就像一个傲娇的小公主。
操作起来得小心翼翼，稍微有点差池，就像踩了小公主的裙摆，整个实验可能就搞砸了。
但只要哄好了它，它就能给我们展现出微观世界里那些精彩绝伦的画面，让我们在基因和蛋白质的神秘王国里畅游。
完成《WB实战指南》后，朋友曾央分享点免疫共沉淀方面的咚咚；当时不得不回绝。
因为，WB指南是基于这些年的回复的汇总，基本上方方面面的问题都有提及，只需要做些串联；而论及coIP，目前在国内还不太普及，尽管它已经是生化领域最基本的技术之一。
因此，再想写这么个长篇颇耗时间，于我的时间和精力太为难；不过，今天是个特殊的日子，凑凑热闹吧。
——人，如果在某些方面成功了，必然在另外一面有亏欠，也许这就是上帝的公允吧。
——在自己最擅长的地方找点成功的感觉吧，当然我的失败也只是因为没有更多的时间。
哎！扯远了玩coIP也玩了5年多了，因为上手就是最难的B蛋白结合量多少的变化（假定IP A蛋白）而非检测B蛋白的有无，说句吹牛皮的话，在我们这个小领域三家最强的lab唯有我们敢于通篇基于这种检测手段，所以，对于coIP算是非常得有心得了。
以下论述基于最难的B蛋白结合水平变化的检测，所以部分实验操作非常苛求；学会这个，其他就是小菜了；所以，这也算一个进阶篇。
一.样品的制备。
如《WB指南》，在这里我最强调从制备样品开始的一致性。
如果不触及细胞的凋亡或死亡，那么任何处理组样品和ctrl最后的终体积应该保持一致；如果细胞有大量凋亡或死亡，可以通过比对标准体积对样品的体积粗略定量后再加裂解液，一般可以把误差控制在WB的检出范围以下，基本保持样品的均一；组织样品可以通过称重添加相应体积比的裂解液。
裂解液的配方可以采用《WB指南》里给出的，原配方如下：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors（0.5M PMSF)此裂解缓冲液裂解条件相对温和，适合后续的coIP分析。
“不过”用它做coIP有明显的缺陷；要理解此配方的缺陷，我们先聊聊如何在coIP实验中“作伪”。
伪造结果，也分为单纯性造假和技术型伪造。
免疫共沉淀的实验方法嘿，咱今儿就来说说免疫共沉淀这档子事儿！免疫共沉淀啊，就像是一场微观世界里的奇妙追捕游戏。
首先呢，你得准备好你的“战场”，也就是各种实验器具和试剂啦。
这就好比战士上战场得有称手的兵器呀！然后呢，把你的目标蛋白和它的小伙伴们放进一个合适的环境里，让它们自由活动起来。
接下来，就该派出我们的“特种兵”——抗体啦！这抗体可是专门冲着目标蛋白去的哦，就像老鹰盯着小鸡一样，紧紧咬住不放。
然后把它们一起放进一个特殊的“陷阱”里，让它们好好待着。
在这个过程中，可不能马虎大意哟！你得时刻关注着，就像老母亲看着孩子一样细心。
要是有个啥差错，那可就前功尽弃啦。
等它们在“陷阱”里待得差不多了，就把它们捞出来。
这捞出来的可不光是目标蛋白，还有和它紧紧抱在一起的其他小伙伴们呢。
这就像是一网打尽了一群“捣蛋鬼”。
然后呢，对这些捞出来的东西进行分析啦。
看看都有哪些家伙被抓住了，它们之间有着怎样的关系。
这就像是在破解一个神秘的密码，充满了乐趣和挑战。
你说这免疫共沉淀是不是很神奇？它能让我们看到那些平时看不到的蛋白质之间的互动。
就好像我们有了一双超级眼睛，能洞察微观世界里的秘密。
做这个实验啊，可不能心急，得慢慢来，一步一步地走稳了。
不然一个不小心，就可能全盘皆输啦。
而且啊，还得有耐心，不能做到一半就不耐烦了。
这就跟盖房子一样，得一砖一瓦地垒起来。
咱再想想，要是没有免疫共沉淀这个技术，那我们对好多生物现象的理解岂不是要大打折扣？那可不行！所以啊，好好掌握这个实验方法，那可是相当重要的哟！总之呢，免疫共沉淀就是这么一个有趣又重要的实验方法。
大家可得好好学，好好用，让它为我们的科学研究发挥更大的作用！怎么样，是不是觉得很有意思呀？赶紧去试试吧！。
免疫共沉淀具体实验步骤(免疫共沉淀,实验步骤,琼脂糖,蛋白)2016-02-21 22:58:28 来源：<ahref="/" target="_blank"></a>琼脂糖蛋白免疫共沉淀实验步骤抗体相互作用免疫血清标题: 免疫共沉淀具体实验步骤(免疫共沉淀,实验步骤,琼脂糖,蛋白)摘要: [免疫共沉淀具体实验步骤(免疫共沉淀,实验步骤,琼脂糖,蛋白)] 各位大侠好，最近我在做肿瘤的一个蛋白的相互作用，想利用免疫共沉淀技术去寻找与这个蛋白有相互作用的蛋白质，但是在具体操作上有些疑问：1、我一次性收集的细胞，大约0 5ML，需要加多少裂解液（RIPA+PMSF）；2、Protein G琼脂糖珠（已分装）的预处理；3、是否需要将总蛋白用非免疫血清和琼脂糖珠反应，去除非特异性结合蛋白，再来加抗体，接着加琼脂糖珠。
如果需要先处理非特异性结合蛋白，那么这里的关键词:[琼脂糖蛋白免疫共沉淀实验步骤抗体相互作用免疫血清]……关键词: 琼脂糖蛋白免疫共沉淀实验步骤抗体相互作用免疫血清各位大侠好，最近我在做肿瘤的一个蛋白的相互作用，想利用免疫共沉淀技术去寻找与这个蛋白有相互作用的蛋白质，但是在具体操作上有些疑问：1、我一次性收集的细胞，大约0.5ML，需要加多少裂解液（RIPA+PMSF）；2、Protein G琼脂糖珠（已分装）的预处理；3、是否需要将总蛋白用非免疫血清和琼脂糖珠反应，去除非特异性结合蛋白，再来加抗体，接着加琼脂糖珠。
如果需要先处理非特异性结合蛋白，那么这里的非免疫血清，就是我的阴性对照的抗体（正常鼠IgG）吗？如果不需要处理非特异性结合蛋白，那么是直接在总蛋白里加抗体，孵育后再加琼脂糖珠，继续孵育，去上清，收集复合物，加上样缓冲液是复合物悬浮，100度煮5分钟，离心，收集上清，进行电泳。
免疫沉淀技术技术简介：蛋白质作为生命形态中最重要的分子，一直以来都是全球科学家们研究的焦点。
免疫沉淀技术是以抗体与抗原间的专一性为基础用于研究蛋白质相互作用的经典方法，也是确定两种蛋白质在细胞内相互性生理作用的有效方法。
表现为可溶性抗原与相应抗体在液相或凝胶中特异性结合后，形成的免疫复合物在一定条件下出现蛋白质析出。
免疫沉淀与凝集反应、中和反应、补体参与的抗原抗体反应并称经典免疫学技术。
随着对蛋白质研究的不断深入，人们将免疫沉淀方法与其他方法相结合，在其基础上衍生出很多更为复杂的技术，使蛋白质分析方法更为多样化，应用范围更为广泛。
该技术现已广泛应用于基因、蛋白质以及其相互作用等研究领域。
免疫沉淀技术的发展：免疫沉淀技术的基本策略就是利用抗体与相应抗原的高亲和力特性检出和结合溶液中靶分子。
免疫沉淀技术从诞生起就一直随着科技的发展而进步。
早期，研究人员利用凝胶电泳分辨免疫沉淀蛋白，将抗原溶液加入琼脂糖之类的可渗透基质的小孔内，并在邻近孔内加入抗血清，随着抗原抗体扩散，大分子进入凝胶内，两者相互作用，形成由多个抗体分子与抗原桥联组成的复合物，通过抗体和抗原的扩散形成浓度梯度，并在最适浓度处形成多分子网络复合物，最终大分子蛋白复合物从溶液中析出形成肉眼可见的沉淀线。
免疫沉淀的早期改进方向是促进多聚体反应，使免疫复合物从溶液中析出。
随后，研究人员发现利用第二抗体与免疫复合物中的抗体形成网络结构，可以不必对每种抗原的第一抗体进行滴定实验，这种方法一直沿用至今。
20世纪70年代中期，人们开始采用固相反应，利用固定在金黄色葡萄球菌表面的蛋白A吸附抗体，再与相应抗原结合。
随着科技的发展，目前这种方法已改进为利用表面固定了蛋白A或蛋白G的微球来分离抗原抗体复合物，以达到检测抗原或目标蛋白的目的。
免疫沉淀技术的分类：本专题资料由海狸纳米科技（苏州）有限公司提供并参与校对。
海狸发源于美国麻省理工学院生物医学工程中心。
公司以具有自主知识产权的前沿生物纳米表面技术为根本，定位于生命科学研究、生物医药研发和疾病诊断行业的全球市场，专注于多个领域的高端生物耗材和生物纳米材料的产业化。
免疫沉淀技术技术简介：蛋白质作为生命形态中最重要的分子，一直以来都是全球科学家们研究的焦点。
免疫沉淀技术是以抗体与抗原间的专一性为基础用于研究蛋白质相互作用的经典方法，也是确定两种蛋白质在细胞内相互性生理作用的有效方法。
表现为可溶性抗原与相应抗体在液相或凝胶中特异性结合后，形成的免疫复合物在一定条件下出现蛋白质析出。
免疫沉淀与凝集反应、中和反应、补体参与的抗原抗体反应并称经典免疫学技术。
随着对蛋白质研究的不断深入，人们将免疫沉淀方法与其他方法相结合，在其基础上衍生出很多更为复杂的技术，使蛋白质分析方法更为多样化，应用范围更为广泛。
该技术现已广泛应用于基因、蛋白质以及其相互作用等研究领域。
免疫沉淀技术的发展：免疫沉淀技术的基本策略就是利用抗体与相应抗原的高亲和力特性检出和结合溶液中靶分子。
免疫沉淀技术从诞生起就一直随着科技的发展而进步。
早期，研究人员利用凝胶电泳分辨免疫沉淀蛋白，将抗原溶液加入琼脂糖之类的可渗透基质的小孔内，并在邻近孔内加入抗血清，随着抗原抗体扩散，大分子进入凝胶内，两者相互作用，形成由多个抗体分子与抗原桥联组成的复合物，通过抗体和抗原的扩散形成浓度梯度，并在最适浓度处形成多分子网络复合物，最终大分子蛋白复合物从溶液中析出形成肉眼可见的沉淀线。
免疫沉淀的早期改进方向是促进多聚体反应，使免疫复合物从溶液中析出。
随后，研究人员发现利用第二抗体与免疫复合物中的抗体形成网络结构，可以不必对每种抗原的第一抗体进行滴定实验，这种方法一直沿用至今。
20世纪70年代中期，人们开始采用固相反应，利用固定在金黄色葡萄球菌表面的蛋白A吸附抗体，再与相应抗原结合。
随着科技的发展，目前这种方法已改进为利用表面固定了蛋白A或蛋白G的微球来分离抗原抗体复合物，以达到检测抗原或目标蛋白的目的。
免疫沉淀技术的分类：随着对蛋白质研究的不断深入，人们将免疫沉淀方法与其他方法相结合，在其基础上衍生出很多更为复杂的技术，使蛋白质分析方法更为多样化，应用范围更为广泛。
免疫共沉淀技术的研究进展S t u d y P r o g r e s s o f C o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n T e c h n o l o g y郭纯(湖南省人民医院,湖南 长沙 410005)[摘要] 免疫共沉淀(c o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n)技术是检测蛋白质间相互作用的经典方法,也是较常用的方法。
文章对近10余年有关免疫共沉淀技术的原理和应用及其优缺点的分析进行文献综述。
[关键词] 免疫共沉淀;蛋白质;相互作用;技术[A b s t r a c t] C o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n t e c h n o l o g y i s c l a s s i c a l m e t h o dt o e x a m i n e t h e i n t e r a c t i o na m o n g p r o t e i n s,a l s o ac o m m o n m e t h o d.T h e p a p e r m a d e a l i t e r a t u r er e v i e w,w h i c hr e f e r r e dt ot h e p r i n c i p l e o f c o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o nt e c h n o l o g y a n di t sm e r i t o r f l a w.[K e y w o r d s] C o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n;P r o t e i n;I n t e r a c t i o n;T e c h n o l o g y[中图分类号]R392-33 [文献标识码]A [文章编号]1672-951X(2007)12-0086-04 蛋白质间的相互作用控制着大量的细胞活动事件,如细胞的增殖、分化和死亡。
免疫共沉淀技术的研究进展李昊,李义,高建梅(内蒙古医学院附属医院影像科,内蒙古呼和浩特010050)[关键词]免疫共沉淀;蛋白质;相互作用[中图分类号]R446.6[文献标识码]A[论文编号]1004-0951(2008)04-0452-03蛋白质间的相互作用控制着大量的细胞活动事件,如细胞的增殖、分化和死亡。
通过蛋白质间相互作用,可改变细胞内蛋白质的动力学特征。
如底物结合特性、催化活性;也可产生新的结合位点,改变蛋白质对底物的特异性;还可失活其它蛋白质,调控其它基因表达。
因此,只有使蛋白质间相互作用顺利进行,细胞的正常生命活动过程才有保障。
另外,还发展了可定性和定量检测蛋白质间相互作用的简便又快捷的方法(如表面胞质团共振等)。
通过这些方法的联合使用,实验得出的蛋白质间的相互作用的结论显得更为可靠[1]。
1免疫共沉淀基本原理细胞裂解物中加入抗体,这样可与已知抗原形成特异的免疫复合物,若存在与已知抗原相互作用的蛋白质,则免疫复合物中还应包含这种蛋白质;经过洗脱,收集免疫复合物,然后分离该蛋白质,对该蛋白质进行N端氨基酸序列分析,推断出相应的核苷酸序列。
将包含活性物质的组织或细胞构建成cDNA文库,以上述核苷酸序列为探针从cDNA文库中分离出cDNA克隆。
2免疫共沉淀技术的应用2.1肿瘤鼻咽癌细胞中P53相结合蛋白质的分离与鉴定:免疫共沉淀与LC2ESI2MS/MS分析相结合的方法对H NE1细胞蛋白条带3鉴定的P53相互作用蛋白之一HSP78进行了验证。
首次在鼻咽癌细胞中鉴定了9个P53结合蛋白,为阐明鼻咽癌中P53蛋白聚集及失活的机制提供了重要依据和线索。
人肝癌中热休克蛋白70(HSP70)与Pp53的相互作用:用免疫组织化学染色法,从12例肝癌组织中筛选HSP70与P53均呈阳性表达的标本,并以免疫共沉淀法提取,然后用SDS-PAGE及West2ern blot分析双阳性标本中两种蛋白的存在形式。
免疫沉淀和免疫共沉淀在实验中的应用下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢！本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注！Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!在免疫学实验中，免疫沉淀和免疫共沉淀是非常常用的技术手段，它们能够用来检测目标蛋白质的存在以及与其他蛋白质的相互作用。
染色体免疫共沉淀技术染色体免疫共沉淀技术，这名字听起来就特别高大上，感觉像是细胞世界里的超级机密特工行动。
你可以把染色体想象成一座巨大的城堡，里面住着各种各样的基因居民，这些基因就像是城堡里性格各异的小怪兽。
这个技术呢，就像是一个超级侦探，专门去揪出那些在城堡里搞特殊关系的基因。
比如说，某个基因和一种蛋白质偷偷地勾搭上了，就像两个小鬼在角落里悄悄密谋什么坏事一样。
染色体免疫共沉淀技术这个侦探就会闻风而动。
它的工具那可真是神奇。
抗体就像是专门识别坏蛋的小猎犬，只对特定的蛋白质感兴趣。
一旦发现目标，就死死咬住不放。
然后就开始把这个蛋白质连同它周围可能相关的基因片段一起揪出来，这就好比是连带着这个坏蛋的整个小团伙都一网打尽。
这个过程就像是一场在微观世界里的拔河比赛。
一边是抗体这个大力士，紧紧拉着蛋白质和相关基因，另一边呢，是细胞里那些复杂的结构试图把它们拽回去。
但咱们这个技术侦探可不会轻易放弃，它就是要把真相拽到我们面前。
有时候我觉得这个技术就像一个超级精确的钓鱼达人。
抗体是鱼钩，只钓特定的“鱼”（蛋白质），而且还能把“鱼”周围的“水草”（相关基因）一起钓上来。
这种精准度，简直比蒙着眼睛穿针还厉害。
这个技术在细胞研究里的地位，那简直就像是哈利·波特里的魔法石一样重要。
科学家们靠着它，去探索基因和蛋白质之间那些神秘的互动关系，就像探险家在未知的大森林里寻找宝藏一样。
要是没有这个技术，我们对细胞内部的了解可能就像盲人摸象，只知道一点局部的东西。
但有了它，就好像突然打开了一扇全景天窗，能把细胞里的各种关系看得清清楚楚。
而且它还特别有耐心，就像一个老工匠，一点点地把基因和蛋白质之间的联系雕琢出来。
不管这个关系有多复杂，多隐晦，它都能像挖掘宝藏一样把它们挖掘出来。
它就像是细胞世界的一盏明灯，照亮了那些隐藏在黑暗中的基因和蛋白质关系。
不管是研究疾病的根源，还是探索生命的奥秘，染色体免疫共沉淀技术都像是一把神奇的钥匙，打开一扇又一扇神秘的大门。
免疫共沉淀文章模板免疫共沉淀技术是一种广泛应用于分子生物学研究中的实验方法，它能够帮助研究者检测蛋白质与其他生物分子之间的相互作用关系。
本文将介绍免疫共沉淀实验的步骤和注意事项，帮助读者了解和掌握该技术的实施过程。
首先，进行免疫共沉淀实验前的准备工作非常重要。
研究者应首先选择需要研究的目标蛋白质，并获取其特异性抗体。
随后，需要准备样品，例如细胞提取物或组织匀浆，其中含有目标蛋白质和潜在作用分子。
此外，还需准备阻断试验，并进行阳性和阴性对照实验。
其次，在实施免疫共沉淀实验过程中，对于抗体的选择和结合条件的优化至关重要。
研究者应根据目标蛋白质的性质和特点选择合适的抗体，并对其进行交叉反应和特异性检测。
同时，需对反应体系的缓冲液、盐度、pH值等条件进行优化，以提高实验的特异性和灵敏度。
接下来，进行免疫共沉淀实验的步骤包括样品的预处理、免疫反应、沉淀、洗涤和检测等。
首先，需对样品进行蛋白质浓度的测定和均一化处理，以保证实验结果的准确性。
然后，将适量的特异性抗体与样品中的目标蛋白质结合，形成免疫复合物。
接着，通过添加适量的蛋白A/G琼脂糖，将免疫复合物与琼脂糖固定。
随后，通过洗涤步骤去除非特异性结合的蛋白质，减少干扰。
最后，采用Western blot、质谱等方法对沉淀物进行定性和定量分析。
在免疫共沉淀实验中需要注意的问题包括实验条件的控制和对比样品的选择。
实验条件的控制主要包括阳性和阴性对照实验的设计，以及反应体系的优化。
通过对比样品的选择，可以判断目标蛋白质与其他生物分子的相互作用情况，从而推断其在细胞内的功能。
总而言之，免疫共沉淀技术是一种重要的实验方法，能够帮助研究者揭示蛋白质相互作用网络。
本文介绍了免疫共沉淀实验的步骤和注意事项，并强调了实验条件的优化和对比样品的选择。
通过掌握这些关键点，研究者可以有效地应用免疫共沉淀技术，推动相关领域的科学研究。
注意：本文仅为免疫共沉淀文章模板，不含任何与主题无关的内容（如广告、联系方式、商业化、网站链接、搬运痕迹等）。
免疫共沉淀技术的研究进展S t u d y P r o g r e s s o f C o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n T e c h n o l o g y郭纯(湖南省人民医院,湖南 长沙 410005)[摘要] 免疫共沉淀(c o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n)技术是检测蛋白质间相互作用的经典方法,也是较常用的方法。
文章对近10余年有关免疫共沉淀技术的原理和应用及其优缺点的分析进行文献综述。
[关键词] 免疫共沉淀;蛋白质;相互作用;技术[A b s t r a c t] C o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n t e c h n o l o g y i s c l a s s i c a l m e t h o dt o e x a m i n e t h e i n t e r a c t i o na m o n g p r o t e i n s,a l s o ac o m m o n m e t h o d.T h e p a p e r m a d e a l i t e r a t u r er e v i e w,w h i c hr e f e r r e dt ot h e p r i n c i p l e o f c o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o nt e c h n o l o g y a n di t sm e r i t o r f l a w.[K e y w o r d s] C o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n;P r o t e i n;I n t e r a c t i o n;T e c h n o l o g y[中图分类号]R392-33 [文献标识码]A [文章编号]1672-951X(2007)12-0086-04 蛋白质间的相互作用控制着大量的细胞活动事件,如细胞的增殖、分化和死亡。
通过蛋白质间相互作用,可改变细胞内蛋白质的动力学特征。
如底物结合特性、催化活性;也可产生新的结合位点,改变蛋白质对底物的特异性;还可失活其它蛋白质,调控其它基因表达。
因此,只有使蛋白质间相互作用顺利进行,细胞的正常生命活动过程才有保障。
由于蛋白质间相互作用具有如此重大的意义,因此其检测方法的研究也备受重视由生化方法,如蛋自质亲和层析(p r o t e i n a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y)、亲和印迹(a f f i n i t yb l o t t i n g)、免疫沉淀(i m m u n o p r e c i p i t a t i o n)及交联(c r o s s-l i n k i n g),发展到当今的分子生物学方法,如以基因文库为基础的蛋白探测(p r o-t e i np r o b i n g)、噬菌体显示(p h a g e d i s p l a y)及双杂交系统(t w o -h y b r i ds y s t e m)等。
另外,还发展了可定性和定量检测蛋白质间相互作用的简便又快捷的方法,如表面胞质团共振(s u r-f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e)等。
通过这些方法的联合使用,实验得出的蛋白质间的相互作用的结论显得更为可靠[1]。
1 免疫共沉淀基本原理细胞裂解物中加入抗体,这样可与已知抗原形成特异的免疫复合物,若存在与已知抗原相互作用的蛋白质,则免疫复合物中还应包含这种蛋白质,经过洗脱,收集免疫复合物,然后分离该蛋白质,对该蛋白质进行N端氨基酸序列分析,推断出相应的核苷酸序列。
将包含活性物质的组织或细胞构建成c D N A文库,以上述核苷酸序列为探针从c D N A文库中分离出c D N A克隆。
1.1 免疫共沉淀技术的主要步骤1.1.1 用磷酸盐缓冲液洗30块10c m培养板上的适宜细胞。
刮去每块板上的细胞到1m l冰冷的E B C裂解缓冲液中。
1.1.2 将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15m i n。
1.1.3 收集上清(约30m l)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1h。
1.1.4 加入0.9m l的蛋白质A-S e p h a r o s e悬液,4℃摇动免疫沉淀物30m i n。
1.1.5 用含900m m o l/L N a C l的N E T N洗蛋白A-S e p h a r o s e 混合物,再重复洗5次。
最后,用N E T N洗1次。
1.1.6 吸出混合物的液体部分。
加入800μl的1×S D S胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4m i n。
1.1.7 将样品加入到大孔的不连续S D S-P A G E梯度胶中,在10m A的恒定电流下电泳过夜。
1.1.8 通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。
1.1.9 从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1m l 50%乙腈洗两次,每次3m i n。
1.1.10 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。
1.1.11 通过窄孔高效液相色谱分离肽。
将收集的肽在A B I 477A或494A机器上进行自动E d m a n降解测序。
2 免疫共沉淀技术的应用2.1 肿瘤 鼻咽癌细胞中p53相结合蛋白质的分离与鉴定:免疫共沉淀与L C2E S I2M S/M S分析相结合的方法对H N E1细胞蛋白条带3鉴定的p53相互作用蛋白之一H S P78进行了验证。
首次在鼻咽癌细胞中鉴定了9个p53结合蛋白,为阐明鼻咽癌中p53蛋白聚集及失活的机制提供了重要第13卷第12期 中 医 药 导 报 2007年12月V o l.13 N o.12 G u i d i n g J o u r n a l o f T C M D e c e m b e r.2007 DOI:10.13862/ 43-1446/r.2007.12.038依据和线索。
方法:在含2m g细胞总蛋白的1m l抽提缓冲液中,加入1μl正常兔血清和30μl p r o t e i nG-S e p h e r o s e4B 珠子,4℃、振荡2h,9000r/m i n离心5m i n去除珠子以消除非特异结合蛋白,保留上清液。
在上清液中加入5μl兔抗人p53抗体和30μl p r o t e i nG-S e p h e r o s e4B珠子,4℃,振荡过夜,9000r/m i n离心5m i n去上清液,保留珠子。
T B S T缓冲液洗涤含免疫复合物的珠子4次,每次5m i n,离心收集珠子。
以B S A取代p53抗体作为对照[2]。
人肝癌中热休克蛋白70(H S P70)与p53的相互作用:用免疫组织化学染色法,从12例肝癌组织中筛选H S P70与p53均呈阳性表达的标本,并以免疫共沉淀法提取之,然后用S D S-P A G E及We s t-e r nb l o t分析双阳性标本中两种蛋白的存在形式。
检测到12例肝癌组织中有3例为双阳性,用抗H S P70m A b免疫共沉淀的样品,可检测到p53蛋白。
用抗p53m A b免疫共沉淀的样品也可检测到H S P70蛋白,证明人肝癌中p53与H S P70以复合物的形式而存在,此可为肝癌的发病机制及免疫治疗的研究提供新的思路[3]。
肿瘤的异质性(H e t e r o g e n e i t y)是指单克隆起源的肿瘤细胞在生长过程中其侵袭能力、生长速度、对激素的反应、对抗癌药物的敏感性等方面能形成不同表型亚克隆的特性[4]。
肿瘤异质性是肿瘤研究的一个重要方向,对解释肿瘤基础及临床研究中出现的诸多问题具有重要意义。
随着分子生物学技术的发展,对于肿瘤异质性的研究方法已从形态学深入到细胞生物学、分子遗传学、分子病理学等方面,但其分子水平的研究多处于基因水平,而对蛋白质方面的研究甚少。
由于蛋白质是生命活动的执行者和体现者,细胞各种重要的生理过程都是以蛋白质间相互作用来实现的,因此通过研究蛋白质的相互作用来探讨肿瘤异质性,将更直接、全面揭示异质性的发生机理及调控过程。
免疫共沉淀用于细胞异质性分析在操作上亦需注意以下几点:(1)细胞全蛋白的质量浓度要足够,至少要高于10m g/m l,这样沉淀物洗脱液中的蛋白质才能达到足够的质量浓度以用于电泳。
(2)S D S-P A G E一定要尽量用大块的胶,因为只有经过足够长距离的电泳才能使样品各成分充分分开,以便于进一步分析、提取和测序。
免疫共沉淀法用于细胞异质性的分析,操作简单,结果直接明了,自动化分析快速且排除人为影响因素,分离后胶上蛋白质能有效回收,有利于后续的测序等分析工作。
因此借助于免疫共沉淀法来研究肿瘤异质性的分子机制无疑是一条很好的途径,随着这一研究方法的完善,它将在细胞异质性的研究中发挥重要作用[5]。
2.2 酶与病毒 端粒酶(或端粒体酶)是一种能延长端粒末端的核糖蛋白酶,主要成分是R N A和蛋白质,其含有引物特异识别位点,能以自身R N A为模板,合成端粒D N A并加到染色体末端,使端粒延长,从延长细胞的寿命甚至使其永生化[6]。
根据目前的研究,端粒酶至少有3个亚单位组成,R N A亚单位T R(t e l o m e r a s e R N A)、端粒酶催化亚单位T E R T (t e l o m e r a s e r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e)和T E P1(t e l o m e r a s e-a s s o c i-a t e dp r o t e i n1)。
人类T E R T(h T E R T)是由1132个氨基酸残基组成的多肽,h T E P1可与p123/E s t2p的同源蛋白h T E R T免疫共沉淀,并和端粒酶活性有关[7～9]。
应用免疫共沉淀技术,验证新基因A n g R e m l04和糖皮质激素受体特异延伸因子(G R-E F)蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用,为进一步研究A n g R e m l04的生理功能奠定基础。
A n g R e m l04是我们在血管紧张素I I(A n g I I)刺激人肾小球系膜细胞(M S C)增生和硬化过程中获得的上调表达新基因,全长1690b p,蛋白相对分子质量为37000,是一个多组织广泛表达的基因,在肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞均有A n g R e m104m R N A表达[10]。
