物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法

毒死蜱对斑马鱼的急性毒性试验霍奕安;胡秀彩;吕爱军;孙敬锋【摘要】为了研究毒死蜱对于斑马鱼的毒性和安全评价进行急性毒性试验,以24～96 h半致死浓度(LC50)来判定斑马鱼对毒死蜱的敏感性.结果表明,毒死蜱24 h LC50、48 h LC50、72 h LC50、96 h LC50分别为1.345 mg/L、1.080 mg/L、0.992 mg/L、0.926mg/L,安全质量浓度(SC)为0.209 mg/L.参照我国化学物质对鱼类毒性分级标准,判定毒死蜱对斑马鱼急性毒性为Ⅰ级,根据《化学农药环境安全评价试验准则》中农药对鱼类的毒性等级划分,可以判定毒死蜱对斑马鱼为高毒.【期刊名称】《水产养殖》【年(卷),期】2018(039)010【总页数】4页(P34-36,41)【关键词】斑马鱼;急性毒性;毒死蜱;半致死浓度;安全质量浓度【作者】霍奕安;胡秀彩;吕爱军;孙敬锋【作者单位】天津农学院水产学院,天津市水产生态及养殖重点试验室,天津300384;天津农学院,创新创业试验室,天津300384;天津农学院水产学院,天津市水产生态及养殖重点试验室,天津300384;天津农学院,创新创业试验室,天津300384;天津农学院水产学院,天津市水产生态及养殖重点试验室,天津300384;天津农学院水产学院,天津市水产生态及养殖重点试验室,天津300384【正文语种】中文【中图分类】S482斑马鱼（Danio rerio）又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼等，是一种热带观赏鱼体长4～6 cm，胚胎透明且体外发育，易于活体观察，生长发育快[1]。

因此已经成为生命科学中对疾病，遗传和毒理学的理想模式生物[2]。

随着人类社会的迅速发展，工业上产生的各种废弃物，如重金属，工业污水，农业上产生的农药、消毒液残留等有害物质通过雨水冲刷，或者直接向农田施肥等途径对土壤、鱼类等产生了严重的影响，并且直接威胁到人类健康。

目前，国内关于鱼类急性毒性的试验研究，经常以鲤、金鱼作为试验对象，斑马鱼还未被广泛地应用于药物毒理学的研究[1-2]。

急性毒性试验(一)发光细菌法分类号：B4-1主要内容水质急性毒性的测定发光细菌法(GB／T15441-1995)一、填空题1．根据《水质急性毒性的测定发光细菌法》(GB／T 15441—1995)，若须排除pH影响，应先将水样和氯化钠溶液的pH进行调整，具体为：含铜水样的pH调整为，含其他金属水样的pH调整为5.4，含有机化合物水样的pH调整为。

答案：4.5 7.02．《水质急性毒性的测定发光细菌法》(GB／T15441-1995)适用于、和实验室条件下可溶性化学物质的水质的急性毒性监测。

答案：工业废水纳污水体3．发光菌急性毒性试验中，样品的急性毒性水平可用相对发光度、或等来表示。

答案：参比毒物氯化汞浓度受测样品的EC50值4．淡水型的发光菌急性毒性试验中，样品的急性毒性水平则用相对发光度、和等来表示。

答案：参比毒物苯酚浓度受测样品的EC50值5．用青海弧菌Q67进行发光菌急性毒性测定时，环境温度在℃之间均可进行，但在测试过程中要求温度波动在±℃内。

答案：18～30 1二、判断题1．根据《水质急性毒性的测定发光细菌法》(GB／T 15441-1995)，用发光菌测定样品的毒性非常简便，冻干粉经复苏后即可用于进行样品的测定。

( )答案：错误正确答案为：冻干粉经复苏后，需经质量检验后方可用于进行样品的测定。

2．根据《水质急性毒性的测定发光细菌法》(GB／T15441-1995)，若须测定包括pH影响在内的急性毒性，不应调节水样pH。

( )答案：正确3．在进行发光菌急性毒性试验中，对含有固体悬浮物的样品须离心或过滤去除，以免干扰测定。

( )答案：正确4．根据《水质急性毒性的测定发光细菌法》(GB／T 15441-1995)，氯化汞母液可在2～5℃冰箱里保存6个月，而氯化汞工作液在2～5℃冰箱里只能保存24h。

( )答案：正确5．根据《水质急性毒性的测定发光细菌法》(GB／T 15441-1995)，在测定有色样品时，先要进行颜色干扰的校正，计算出因颜色引起的发光量校正值。

实验斑马鱼的急性毒性实验xx年xx月xx日•实验准备•实验方法•实验结果•实验结论目录01实验准备1实验设备23用于养殖斑马鱼的实验器皿，应选择适合斑马鱼体型大小的器皿。

实验室器皿为了保持实验环境中的温度稳定，需要使用恒温设备，如恒温水浴或恒温箱。

恒温设备显微镜或放大镜等观察设备，用于观察斑马鱼的生长状况和行为变化。

观察设备选择健康、无损伤的斑马鱼鱼种，年龄和体重均应符合实验要求。

实验鱼种使用清洁、无污染的养殖用水，并经过充分曝气和过滤，以保证水质良好。

养殖用水实验动物受试物质对照物质饲料和水质改良剂用于比较实验结果的空白对照或标准对照。

用于维持斑马鱼生命活动的必要物质。

03实验材料02 01待测试的化学物质或药物。

02实验方法评估目标化合物对斑马鱼的急性毒性作用，了解其安全浓度范围。

实验设计实验目的健康成年斑马鱼，体重相近，年龄相同。

实验动物设置多个浓度组，如0（对照组）、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L等。

实验分组实验过程准备实验所需器材和试剂，设置不同浓度的目标化合物。

实验准备受试动物观察指标实验时间将斑马鱼暴露在不同浓度的目标化合物中。

观察并记录每组斑马鱼的死亡率、行为变化、呼吸频率等指标。

设定实验时间为24小时，根据需要可适当延长。

整理实验数据，包括各浓度组死亡数、行为变化等指标。

数据整理计算半数致死浓度（LC50）等毒性指标，评估目标化合物的毒性作用。

数据分析绘制浓度-效应曲线，直观展示化合物对斑马鱼的毒性作用。

结果呈现数据分析03实验结果实验数据记录•实验日期：2023年3月1日•实验地点：实验室1号水族箱•实验温度：25±1℃•实验时间：24小时•实验动物：成年斑马鱼（50±5g）•实验溶液浓度：0（对照组），0.1，0.5，1.0，2.0mg/L •实验记录员：张三数据分析结果•死亡率统计•对照组：0%•0.1mg/L组：10%•0.5mg/L组：30%• 1.0mg/L组：60%• 2.0mg/L组：100%•中毒症状观察•对照组：无异常•0.1mg/L组：鱼体活动稍显迟缓，呼吸频率增加•0.5mg/L组：鱼体活动明显迟缓，呼吸急促，部分鱼体出现失衡• 1.0mg/L组：鱼体活动严重受限，呼吸急促，部分鱼体出现侧翻和抽搐现象• 2.0mg/L组：鱼体全部死亡，未观察到呼吸和活动现象//example/file/acute_toxicity_table.xlsx)（请点击链接查看）[急性毒性实验结果统计表.xlsx](https//example/file/acute_toxicity_chart.png)（请点击链接查看）[急性毒性实验结果柱状图.png](https 结果图表展示04实验结论实验目的本实验旨在研究不同浓度梯度的重金属对斑马鱼急性毒性的影响，以评估重金属的毒性作用和安全阈值。

敌敌畏对斑马鱼急性毒性试验作者：胡秀彩杨小平吕爱军孙敬锋来源：《黑龙江水产》 2017年第6期摘要：为探究农药对斑马鱼的毒性与安全评价，选用在农业害虫防治中广泛使用的有机磷农药敌敌畏进行急性毒性试验，以24～96h半致死浓度（LC50）判断斑马鱼对敌敌畏的敏感性。

结果表明，敌敌畏24h LC50、48h LC50、72h LC50、96h LC50分别为66.189mg/L、46.647mg/L、35.836mg/L、33.764mg/L，安全质量浓度（SC）为6.95mg/L。

参照我国化学物质对鱼类毒性分级标准，判定敌敌畏对斑马鱼急性毒性为Ⅲ级，根据《化学农药环境安全评价试验准则》对鱼类毒性等级划分，可判定敌敌畏对斑马鱼为低毒农药。

关键词：斑马鱼；敌敌畏；急性毒性；半致死浓度；安全质量浓度斑马鱼（Brachydanio rerio）是最早生活在印度和南亚的一种热带鱼，目前已经成为遗传学和毒理学研究的重要模式生物，其具有发育快、易于实验室饲养、繁殖量大、周期短、胚胎透明以及易于实验操作等优点。

斑马鱼作为一种生态毒理学实验模式动物，除了具有经济、观赏价值外，目前已成为研究脊椎动物胚胎发育及对外界环境变化，如紫外线、重金属盐类、农药、消毒液、工业污水、放射性物质等的良好的研究材料。

近年来，我国农业得到了迅猛的发展，特别是南方地区出现了水产养殖与稻田耕作有效结合的科学养殖方式（水产养殖与稻田紧密相邻、稻田-鱼塘水相互交错使用），直接向水体施药或农田施用的农药随地表和地下径流等途径进入水体等情况，使得化学农药的大量施用对水产养殖业，乃至生态环境带来了严重的影响。

我国目前农药年产量达80万吨，居世界第二位，而敌敌畏因其具有杀虫谱广，廉价易得，对人和高等动物低毒等特性，现已成为使用最为广泛的有机磷农药之一。

敌敌畏又名DDVP，学名O,O-二甲基-O-(2,2-二氯乙烯基)磷酸酯，属于有机磷农药，具有很高的水溶性，用在农业害虫和卫生害虫防治上。

中华人民共和国国家环境保护标准HJ 1069-2019水质急性毒性的测定斑马鱼卵法Water quality—Determination of the acute toxicity—Zebrafish (Danio rerio) eggs method（发布稿）本电子版为发布稿。

请以中国环境出版集团出版的正式标准文本为准。

2019-12-31发布2020-06-30实施生态环境部发布目次前言 (ⅱ)1 适用范围 (1)2 规范性引用文件 (1)3 术语和定义 (1)4 方法原理 (2)5 干扰和消除 (2)6 试剂和材料 (2)7 仪器和设备 (3)8 样品 (4)9 试验步骤 (5)10 结果计算与表示 (7)11 有效性、敏感性与精密度 (7)12 质量保证和质量控制 (8)13 试验报告 (8)14 废弃物处置 (8)附录A （资料性附录）斑马鱼卵相关发育阶段 (9)附录B （资料性附录）斑马鱼种鱼驯养及维持 (10)附录C （资料性附录）产卵盒参考图片 (11)附录D （资料性附录）斑马鱼卵鉴别 (12)附录E （资料性附录）24孔细胞培养板试验布局设置方案 (15)附录F （资料性附录）推荐的数据记录表 (16)附录G （资料性附录）寇式法计算EC50 (18)i前言为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》，保护生态环境，保障人体健康，规范水质急性毒性测定的斑马鱼卵方法，制定本标准。

本标准规定了测定地表水、地下水、生活污水和工业废水中急性毒性的斑马鱼卵法。

本标准的附录A～附录G为资料性附录。

本标准为首次发布。

本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。

本标准起草单位：江苏省常州环境监测中心、中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室。

本标准验证单位：中国环境科学研究院环境分析测试技术中心、中国环境监测总站、生态环境部南京环境科学研究所、浙江省环境监测中心、浙江省农业科学院农产品质量标准研究所和江苏国创环保科技有限公司。

鱼类急性毒性实验一、实验目的（1）掌握鱼类急性毒性实验的原理和操作（2）掌握半致死浓度的计算方法（直线内插法）二、实验原理鱼类对水环境的变化十分灵敏，运用毒理实验方法，观察鱼类在含有化学污染物的水环境中的反应，可以比较不同化学物质的毒性高低。

鱼类毒性实验方法可分为静态方法和动态方法两大类。

静态实验方法操作简单，不需要特殊设备，适宜于受试化学物在水中相对稳定，在实验过程中耗氧量较低的短期实验。

动态实验方法要求具备一定的设备，对于在水中不稳定、耗氧量较高的化学物需要进行较长时间的实验观察时，可采用动态实验方法。

本实验介绍静态实验方法。

三、实验器材玻璃缸或搪瓷桶、有机磷农药、重金属盐、金鱼四、实验步骤（1）预备实验：预备实验的方法，可参考有关资料初步估计3～4个浓度，每个浓度用3～4尾鱼，观察24～48h。

进行预备实验的目的是确定实验浓度的范围（找出引起实验鱼全部死亡和不引起实验鱼死亡的浓度）；观察鱼中毒的表现和出现中毒的时间，为正式实验选择观察指标提供依据。

同时还要做一些化学测定，以了解实验液的稳定性、pH值、溶解氧的变化情况，以便在正式实验时采取措施。

（2）正式实验：1、根据在预备实验中得到的浓度范围，其间距按等比级数插入3～5个中间浓度2、选用表8-1中浓度值的对数系列，表中的数值可用百分体积或mg/L表示，必要时也可用10的指数来乘或除。

实验中至少选择5个不同浓度，一般以7个浓度较常用，但所选择的浓度应包括有使实验鱼在24h内死亡的浓度，以及96h内不发生中毒的浓度。

表中第1纵行包括的浓度最常用。

实验中无论采用何种分组方法，都必须同时设对照组。

配制实验液时应先配制少量高浓度的储备液，实验时临时稀释所需浓度的实验液。

先把药液与水均匀混合后，再放入实验鱼，禁止先放入实验鱼后网实验缸中加受试药液，以免实验鱼接触到不均匀的高浓度的药液而提前死亡。

3、结果的观察：实验开始后8h进行连续观察并做好记录，8h后可做24h、48h和96h的详细观察记录。

《淡水鱼类急性中毒死亡诊断方法》1第一节化学物急性中毒死亡的确定23淡水鱼类急性中毒死亡诊断程序由四个部分构成。

第一部分是根据化学物致鱼急4性死亡与其它原因致鱼死亡在十八项诊断指标上的56中排7除病害死鱼8毒十八项诊断指标调查分析缺氧死鱼9死10毒藻死鱼11亡排12除其它原因死鱼13确化学物急性中毒死亡14定1516不同毒物致鱼死亡时所具有的不同特征分析17可18疑重金属农药无机物19和有机物混合废水20最毒中毒死鱼中毒死鱼中毒死21鱼中毒死鱼22终综合物23诊分析确汞有机氯农药黄24磷维尼涤工业废水25断定铬有机磷农药氨、酚炼焦、26煤气、冶金、27镉菊脂类农药余氯炼油厂废水28铅氨基甲酸脂类氰化物造纸废水29锌除草剂砷染料厂废水30镍石油类制糖厂废31水32铜硫化氢33氟化物34酸、碱3536毒物来污染源调查，确定可疑毒物来源及进入渔业水域37源调查时间、原因及途径3839实验室水样、底质样、鱼样实验室分析及试验40分析4142差异分析，排除病害死鱼、缺氧死鱼、毒藻死鱼，同时也排除其它原因死鱼的可43能性，初步确定死鱼是由于化学物急性中毒所致。

第二部分是根据不同毒物造成44鱼类急性死亡时所具有的不同特征，认定致鱼死亡的一种或几种可疑毒物。

第三45部分是污染源调查，确定可疑毒物来源及进入渔业水域的时间、原因及途径。

第46四部分是对水样、底质样、鱼样进行实验室分析和试验。

最后经综合分析对死鱼47原因作出最终诊断。

48一、诊断指标及指标特征49根据对各种死鱼原因造成的鱼的形态、行为反应和环境特征的异同分析，50选择十八项指标作为区别不同原因死鱼的诊断指标。

诊断指标具有以下特点：51A 易观察测定。

即可通过肉眼观察和使用简单的仪器快速测定。

52B 代表性强。

指标可以反应各种原因死鱼的生物和环境特征。

53C 可以比较。

不同原因造成的死鱼，其指标和特征有所差异，可以比54较。

55这些诊断指标是死亡速率、死鱼品种选择、死鱼发生的时间、死鱼季节、死鱼个56体大小选择、行为反应、形态特征、鱼体附着物、浮游动物状况、浮游植物状况、57其它水生生物状况、病原体、死鱼发生的形式、水体溶解氧、水体pH值、水体58气味、水色、急性致死试验共十八项。

实验五硫氰酸钠对斑马鱼的急性毒性实验一、实验目的：1、掌握硫氰酸钠对斑马鱼急性毒性实验方法。

2、掌握如何测定硫氰酸钠对斑马鱼的LC50。

3、了解硫氰酸钠对鱼类的毒性等级划分。

二、实验原理1、斑马鱼急性毒性实验：试验鱼同时孵化，体长2-3cm，健康无病，在室内驯化饲养7-14天，待鱼苗死亡率稳定在<10% 时开始试验。

试验期间对照组的死亡率也应控制在<10%以下。

2、采用半静态测定方法，试验容器采用玻璃缸，盛水量以每条鱼2-3L水为宜(本实验用水18L)，pH值为6.5-8.0，冷水水温为12-18℃，温水温度为20-28℃（本实验温度为室温），一次实验中水温变化范围为±2℃，水中溶解氧不能低于4mg/L。

3、根据预试验结果在最高安全浓度与最低全致死浓度之间，按级差设5-7个组，并设空白对照，每组养10尾。

试验前24小时停止喂食，试验期间不喂食，染毒48-96小时，记录24、48、72、96小时时鱼的死亡率与中毒症状，及时捞出死鱼。

4、鱼类急性毒性等级划分LC50等级<1mg/L 剧毒级1-10mg/L 高毒级10-100mg/L 中毒级>100mg/L 低毒级5、LC50：动物急性毒性试验中，使受试动物半数死亡的毒物浓度。

三、实验用品斑马鱼、硫氰酸钠、鱼缸、渔具、加氧泵、温度计、烧杯、量筒、分析天平、玻璃棒等。

四、实验步骤1、正式试验前将斑马鱼在与试验相同的环境条件下驯养7-14d，驯养期间斑马鱼死亡率<5%。

驯养时每天喂食1次，曝气充氧，正式试验前24h停止喂食。

2、设定5个给药组，浓度分别为150mg/L、300mg/L、450mg/L、600mg/L和750mg/L，并设空白对照。

3、采用“半静态法”，每24h更换一次药液，每次更换三分之一，24h、48h、72h和96h定期观察并记录斑马鱼中毒症状和死亡情况，并求出其LC50值。

五、实验结果1、求出硫氰酸钠对斑马鱼的LC50。

第一章环境空气和废气第一节环境空气采样四、问答题1．简述环境空气监测网络设计的一般原则。

③答案：监测网络设计的一般原则是：（1）在监测范围内，必须能提供足够的、有代表性的环境质量信息。

（2）监测网络应考虑获得信息的完整性。

（3）以社会经济和技术水平为基础，根据监测的目的进行经济效益分析，寻求优化的、可操作性强的监测方案。

（4）根据现场的实际情况，考虑影响监测点位的其他因素。

2．简述环境空气质量监测点位布设的一般原则。

⑧答案：环境空气质量监测点位布设的一般原则是：（1）点位应具有较好的代表性，应能客观反映一定空间范围内的空气污染水平和变化规律。

（2）应考虑各监测点之间设置条件尽可能一致，使各个监测点取得的监测资料具有可比性。

（3）各行政区在监测点位的布局上尽可能分布均匀，以反映其空气污染水平及规律；同时，在布局上还应考虑能反映城市主要功能区和主要空气污染源的污染现状及变化趋势。

（4）应结合城市规划考虑环境空气监测点位的布设，使确定的监测点位能兼顾城市未来发展的需要。

3．环境空气样品的间断采样的含义是什么?①答案；指在某一时段或1 h内采集一个环境空气样品，监测该时段或该小时环境空气中污染物的平均浓度所采用的采样方法。

4．简述什么是环境空气的无动力采样。

①答案：指将采样装置或气样捕集介质暴露于环境空气中，不需要抽气动力，依靠环境空气中待测污染物分子的自然扩散、迁移、沉降等作用而直接采集污染物的采样方式。

5．环境空气24 h连续采样时，气态污染物采样系统由哪几部分组成?①答案：气态污染物采样系统由采样头、采样总管、采样支管、引风机、气体样品吸收装置及采样器等组成。

6．用塑料袋采集环境空气样品时，如何进行气密性检查?③答案：充足气后，密封进气口，将其置于水中，不应冒气泡。

7．新购置的采集气体样品的吸收管如何进行气密性检查?③答案；将吸收管内装适量的水，接至水抽气瓶上，两个水瓶的水面差为1 m，密封进气口，抽气至吸收管内无气泡出现，待抽气瓶水面稳定后，静置10 min，抽气瓶水面应无明显降低。

4种农药对斑马鱼的急性毒性与安全评价实验 监督与检验Tox icity of Four 4Pestic i d es to B rachydanio Rerio and Safety Eva l u ation 徐娟,陶核,吴南翔X U Juan,TAO H e ,WU N an x iang摘要!目的!研究4种农药对斑马鱼的毒性,为其安全使用提供依据。

方法!以斑马鱼为试材,采用半静态法在室内测定4种农药对斑马鱼的急性毒性并对其进行安全评价。

结果!93%丁草胺原药的LC 50为0.35m g /L ,属高毒级农药;1.8%阿维菌素水乳剂、50%乙草胺乳油、25%咪鲜胺乳油96h 的LC 50分别为1.08、5.45、5.81m g /L ,属中毒级农药。

结论!该研究为农药的安全合理使用提供了基础资料和科学依据。

关键词!农药;斑马鱼;毒性;安全评价中国图书资料分类号:R 139!!!!!文献标识码:B !!!!!文章编号:1004-1257(2010)23-2777-02Sub ject !T ox ic it y of F our 4P estic i des to Brachydanio R erio and Sa f e ty Eva l uati on Authors !X U Juan ,TAO H e ,WU N an x iang (Institute of H ealth Sciences ,Zhejiang A cad e m y of M edical Science ,H angzhou,310013,Ch i na)Abstrac t ![Ob jec ti ve]t o study t he t ox ic i ty o f 4pestic i des to B rachydan i o R er i o ,and prov i de ev i dence for sa f e ty use .[M ethod s]W ith the Brachydanio R erio as tested ma teria,l the acute tox i c ity of 4pesti c i des w ere detected i n the l abo ra t o ry by t he se m i-stati c m ethod and their sa fety eva l uati on w as m ade .[R es u lts]LC 50o f 93%acetochlor w as 0.35mg /L wh ich be l onged to h i gh tox icity g rade .LC 50f o r 96hours o f 1.8%aba m ecti n E W,50%acetochlor EC and 25%prochloraz EC w as 1.08mg /L,5.45m g /L ,and 5.81mg /L ,respec tive l y w hich be l ong ed to m oderate tox icity grade .[Conc l u si on ]The st udy prov i des basic infor m ati on and sc ientif ic basis for the sa fety and rati onal use of the pestic i des .K ey word s !P estic i des ;Brachydanio R erio ;T ox icity ;Sa f e ty evalua tion 作者简介:徐娟,女,研究实习员,主要从事农药毒理学工作。