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华中科技大学发酵工程 第二章 工业用微生物菌种

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发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养

发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养

6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
分离与筛选菌种的基本步骤
样品采集 富集 培养 筛选
产物分析
调查研究（包括资料查阅）
筛
试验方案设计
选
采样
工
增殖条件探索
第一次增殖培养
作
第一次平板分离
程
第二次增殖培养
第一次原种斜面 序
根据实际情况进 行定量或半定量 测定
第二次平板分离 第二次原种斜面
定量或半定量测定
初筛（1株1瓶）
第三次平板分离
第三次原种斜面
4、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutyleum)
➢ 芽孢卵形，中生或次端 生，使芽孢囊膨大成梭状 或鼓槌形; ➢ 专性厌氧; ➢ 发酵生产丙酮丁醇.
5、肠膜状明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides)
➢可生产葡聚糖; ➢使糖汁变粘而无法加工，为糖厂有害菌。
5、白地霉 ( Geotrichum candidum )
➢ 节孢子单个或连接成链。
➢ 白地霉菌体蛋白营养价值很高，可供食用和饲 料用，也可用来提取核酸，在废料废水的利用上很 用价值。
6、产黄头孢霉 ( Cephalosporium chrysogen ) 头孢霉素、先锋霉素
（五）其它微生物
1、噬菌体 寄生在原核生物中的病毒，对发酵工业的生产

第二章发酵工业微生物菌种制备原理和技术-PPT

第二章发酵工业微生物菌种制备原理和技术-PPT

筛选一些具有特殊性质得微生物时,需根据该微生物独特 得生理特性到相应得地点采样(极端环境)。如:
高温酶产生菌:温度较高得南方,或温泉、火山爆发处 及北方得堆肥中采集样品;
低温酶产生菌:寒冷得地方,如南北极地区、冰窖、深 海中采样;
耐压菌:海洋底部采样。 耐高渗透压酵母菌:通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处
菌种纯化就是指在特定环境中只让1种来自同一祖先得微生物 群体生存得技术。
菌株分离、筛选虽为两个环节,但却不能绝然分开,因为分离中 得一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌得筛选 一般包括两大部分:一就是从自然界分离所需要得菌株,二就是 把分离到得野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
3、分离思路
从自然界筛选
B、采样季节:以温度适中,雨量不多得秋初为好。
C、采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取 离地面5-15cm处得土约10g,盛入清洁得牛皮纸袋或塑 料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等, 以备查考。为了使土样中微生物得数量与类型尽少变 化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离。
别出来。
抗生素筛选
6、生产性能得测定
由于纯种分离后,得到得菌株数量非常大,如果对每 一菌株都作全面或精确得性能测定,工作量十分巨大, 而且就是不必要得。一般采用两步法,即初筛与复筛, 经过多次重复筛选,直到获得1～3株较好得菌株,供 发酵条件得摸索与生产试验,进而作为育种得出发菌 株。这种直接从自然界分离得到得菌株称为野生型 菌株,以区别于用人工育种方法得到得变异菌株(亦 称突变株)。
采样。如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖得耐 高渗透压得酵母菌。
(3)含微生物样品得富集培养(优化得过程) ----施加选择性压力分离法

发酵工程第二章发酵工业微生物菌种

发酵工程第二章发酵工业微生物菌种

李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽 土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的 土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果 生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐 败物品，某些水域等。
新种分离与筛选的步骤
（五）毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为 生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种， 更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆 壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒 性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的 毒性试验。
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂
李 先 磊
Fermentation Engineering
生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培 养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一 点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离 法。
李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
李 先 磊
（二）增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择 性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。

第二章发酵工业微生物菌种ppt课件

第二章发酵工业微生物菌种ppt课件

2019
-
7
(1) 曲霉属(Asprgillus)：曲霉种类繁多、分布 广泛，工业上利用曲霉生产各种酶制剂和有机 (2) 青霉属（Penicillium）：j既是使果实腐 酸。如米曲霉（ Asp. oryzae）用于酿酒和L败和实物变坏的有害菌，又是青霉素后葡萄 乳酸生产。制酱油用的酱油曲霉以及制造柠檬 糖酸的产生菌。 酸、草酸、葡萄糖酸和糖化酶、酸性蛋白酶、 (3) 根霉属（Rhizopus）：用于米酒、黄 果胶酶、单宁酶等的黑曲霉 (Asp. niger)。 酒生产。此外，广泛用作淀粉糖化菌、有机 酸发酵以及甾体转化等许多方面。 (4) 毛霉属（Mucor）：产生蛋白酶，有分 解大豆蛋白的能力。腐乳、酱油、转化甾族 化合物。土曲霉：衣康酸
11
连续培养菌种的筛选 比生长速率(u):每克菌体每小时增长的 菌体量.u=1/XdX/dt.
2019
-
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比生长速率u
A B
r
2019 -
基质浓度
13
限 制 性 基 质
当进行流加时基质浓度<r 时,A菌先被洗出; 当进行流加时基质浓度>r 时,,B菌先被洗出;
培养液
固体培养法
2019 14
2.随机分离方法 （1）.抗生素产生菌筛选 试验菌的灵敏性，以及与抗生素有关的酶、 酶的抑制剂（例如棒酸）、激活剂、抗体 等建立起来的高灵敏度、专一的检测技术。 （2）.药理活性化合物的筛选 （3）.生长因子产生菌的筛选 （4）.多糖生产菌的筛选 （5）.免疫激活剂产生菌的分离
2019
-
3
(3) 乳酸菌：由糖类生成乳酸的一类细菌总称为乳 酸菌，有乳链球菌和乳酸杆菌之分，主要用来制 造乳制品。凡发酵产物中只有乳酸者，称为同型 乳酸发酵；凡发酵产物中除乳酸外还有乙酸等和 CO2者，称为异型乳酸发酵。肠膜状明串珠菌属 于乳酸菌族，是制药工业生产有旋糖酐的重要菌。 (4) 大肠杆菌：工业上利用大肠杆菌的谷氨酸 脱羧酶，进行谷氨酸定量分析。还可以利用 大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸等。 医药方面用它制造治疗白血症的天冬酰胺酶。 另外，在研究细菌遗传变异方面，以及构建 基因工程菌时，大肠杆菌是理想的研究材料。

微生物菌种

微生物菌种

虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目 前广泛使用的育种手段。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
原始菌株（出发菌株）
活细胞计数 诱变剂处理 活细胞计数 中间培养
突变株分离
诱变预备处 理
初筛 复筛 生产性能试验
工业微生物来源
想菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需
菌株。
从自然界采集分离。
从一些发酵制品中分离目的菌株。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
微生物菌种的选择性分离
工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合 成产物； 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造 的可操作性要强；
分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
目的微生物富集的一些基本方法
让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 富集的目的： 得可能。
富集的三种方案：
定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的
条件（加热、膜过滤等），进行培养。
当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分
能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。
分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、 脂肪酶、核酸酶等；
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌 土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然 后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白 质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性 蛋白质，产生一透明圈。
遗传性能要相对稳定；
不易感染它种微生物或噬菌体； 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与 致病 菌无关）； 生产特性要符合工艺要求。

发酵工程第二章发酵工业菌种

发酵工程第二章发酵工业菌种
力较高的菌株。
发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养
➢ 例如，青霉素的发酵生产，在投产之初只有 40U·mL-1，得到黄色晶体，青霉素纯度很低，价 比黄金；而现在采用新型菌种可以达到 60000U·mL-1以上，得到晶体为纯白色，青霉素纯 度高达95%以上，成本不到0.1元。
➢ 青霉素发酵生产的这种质的飞跃，生产所用菌种 在其中起了关键作用。
菌种选育有何意义？
1
建筑精选课件
本章内容
一、常用发酵工业菌种
二、发酵工业菌种的分离筛选
三、发酵工业菌种鉴定
四、发酵工业菌种改良
四、发酵工业菌种保藏
2
建筑精选课件
第一节 常用发酵工业菌种
3
建筑精选课件
➢ 工业发酵生产水平的高低取决于生产菌种、发酵 工艺和后提取工艺三个因素，其中拥有良好生产 菌种是前提，菌种质量好坏直接影响了发酵产品 的产量、质量及其成本。
4
建筑精选课件
微生物菌种是决定发酵产品的工业化价值以及 发酵过程成败的关键，只有具备良好的菌种基 础，才能通过改进发酵工艺和设备以获得理想 的发酵产品。
优良菌种都是通过菌种选育获得的。 菌种选育方法主要包括自然选育、诱变育种、
杂交育种和基因工程育种。
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建筑精选课件
菌种选育的意义：
➢ 提供产量 ➢ 提高产品质量 ➢ 改善加工工艺和开发新产品。 ➢ 在科学研究中，通过菌种选育还可以了解菌种
在发酵工业上，经常利用酵母的代谢进行啤酒、
白酒、黄酒和果酒等各种饮料酒的酿造，以及
生产乙醇、甘油、有机酸及麦角固醇等多种产
品。
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建筑精选课件
霉菌
– 曲霉属 米曲霉 黑曲霉
– 青霉属 青霉菌：点青霉、产黄青霉 桔青霉

《发酵工程》02 工业发酵菌种选育

《发酵工程》02 工业发酵菌种选育

（2）增殖培养
➢目的： 富集目的微生物，让目的微生物在种群中 占优势，使筛选变得可能。
富集方法 1、养分 3、培养时间
2、pH条件 4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、 液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。
（３）纯种分离
•
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例： 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
• 细菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢杆菌、 醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。
短杆菌：GA、Gln、lys…… 枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等 地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温α-淀粉酶) αAmylase 苏云金芽孢杆菌短：杆B菌T生物农药…棒…状杆菌 梭状芽孢杆菌：丙酮、丁y酸ea等sts的发酵
啤棒酒状酵杆母菌
• 酵母菌（yeast）：属单细胞真核生物，主 要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的 有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。
啤酒酵母：酿酒、辅酶类物质的发酵
酒香酵母：酿酒
汉逊酵母：酿酒，用于乙酸乙酯的发酵
假丝酵母：单细胞蛋白生产，石油发酵
霉菌
• 霉菌（mould）：喜偏酸性环境。可用于生产多种 酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。
黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业、糖化酶 黄曲霉：酱油生产，面酱 青霉菌：青霉素的生产 红曲霉：红曲制造，南方红曲酒（女儿红）；红色；豆腐 乳 赤霉菌：赤霉素的生产

发酵工程 (第2章)

发酵工程 (第2章)

（b）营养缺陷型的意义 在营养缺陷型突变菌株中，生物合成途径中的 某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成，末端产 物不能积累，因此末端产物的反馈调节作用被解除。 只要在培养基中限量加入所要求的末端产物，克服 生长障碍，就能使中间产物积累。 营养缺陷型突变株具有明显的遗传标记，在杂 交育种中作为出发菌株，有利于杂交重组的分析。 营养缺陷型突变株具有明显的遗传标记，可以 作为基因工程中的受体菌，检出克隆基因的表达。
（二）微生物菌种的选育
1、自然选育 不经过人工处理，利用微生物自然突变进行 菌种选育的过程称为自然选育。 自然选育简单易行，可以达到纯化菌种，防 止菌种退化，稳定生产，提高产量的目的。 自然选育的一般程序是将菌种制成菌悬液， 用稀释法在固体平板上分离单菌落，再分别测 定单菌落的生产能力，从中选出高水平菌种。
（2）抗肿瘤药物产生菌的分离。 原理一（p21）： 临床上抗肿瘤药物大部分是直接作用于核酸或 抑制核酸生物合成的物质，由于微生物和人的核 酸结构与生物合成方式有许多共同之处，所以大 部分抗肿瘤药物也具有抗菌活性，据此发展出利 用微生物筛选作用于DNA的抗肿瘤药物的方法。 <1> 生化诱导分析法（BIA） <2> SOS显色法
c 、不形成孢子只通过芽殖的“假酵母”属半知菌。
工业上常用的有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等
4、霉菌（mould）
霉菌非系统演化分类的单元。凡生长在营养 基质上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌统 称霉菌。 工业上常用的霉菌有： 藻状菌纲：根霉，毛霉，犁头霉 子囊菌纲：红曲霉 半知菌类：曲霉，青霉。
所有菌都长
完全培养基上 长成单孢菌落 基本培养基 完全培养基 轻压在绒布上 无菌丝绒布 橡皮箍 接上所有菌落的绒布 转印在新鲜 的培养基上

发酵工程 第2章 微生物工业的菌种

发酵工程 第2章 微生物工业的菌种

（一）材料的选择
土壤 水域(海洋、湖泊、河流) 生物体内 极端环境和特殊的生态环境
（二）材料的预处理
热处理法 膜过滤法 化学药品处理
用0.01N的NaOH处理样品，可分离 得到小单孢菌。
用4ml/L的氨水处理后，再用2mg/L 的氯处理样品，分离得到了游动放线菌。
（三）分离、筛选方案的设计
筛选模型 加选择性压力 富集培养、诱饵法 反应特性 随机分离
(四)原生质体融合技术
也称细胞融合技术，指将一个细胞与另一个细 胞融合为一体，使一个细胞的遗传物质(包括核DNA 和核外基因)进入另一个细胞。
它的目的是：进入一个细胞的另一个细胞的遗 传物质为这个细胞所接受，引起这个细胞遗传特性 的改变，并且这种遗传特性的变异能够稳定遗传下 去。
原 生简 质要 体说 融明 合
筛选模型
在抗生素的筛选过程中，为避免致 病菌的感染与扩散，一般不采用致病菌 为试验的指示菌，尽可能选择非致病菌 而又能代表致病菌的其它微生物作为试 验的指示菌，这些试验指示菌就称为筛 选模型。
加选择性压力
加入不同的抗生素或试剂来增加选 择性，如分离真菌时，可加入抗细菌抗 生素，分离放线菌和细菌时，可加入抗 真菌抗生素。
选择、调取单菌落，转管保存
初筛 （以出发菌种为对照）
选出高产突变株，并留种保存
复筛 （以出发菌种为对照）
选出高产突变株，并留种保存
根据情况进行第二、第三……复筛 选出高产突变株，并留种保存
高产菌株的稳定性试验 菌种特性考察
高产菌种培养条件的优化试验 小发酵罐试验
放大试验、中试考查
大罐试验 生产
诱变育种应注意的几个问题
(1)出发菌株的选择 (2)复合诱变剂的使用 (3)诱变剂的剂量 (4)突变株的筛选 (5)高产突变株培养条件的优化

微生物工程(发酵)第二章-菌种制备原理与技术 ppt课件

微生物工程(发酵)第二章-菌种制备原理与技术 ppt课件

ppt课件
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2.1.5 适应性进化（菌株驯化）
• Adaptive evolution 通过人工措施使微生物逐 步适应某一条件，而定向选育微生物的方 法； • （柠檬酸）
ppt课件
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2.1.6 菌种的保藏
• 保藏、退化、复壮
ppt课件
ppt课件 10
微生物的分离
• 稀释涂布法 • 划线法；
ppt课件
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生化反应法；
高温下培养： 分离嗜热细菌； 培养基中不含N： 分离固氮菌； 培养基加抗生素： 分离抗性菌；
ppt课件
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组织分离法
ppt课件
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• 合理的筛选策略是关键！
ppt课件
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氨基酸产生菌的筛选
样品
分离
ppt课件
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• 原生质体再生（细胞壁） • 双层平板上，半固体培养基中；
ppt课件
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2.3.3 微生物原生质体诱变育种
原生质体技术＋诱变育种技术 • 出发菌株的选择 • 菌体的活化 • 原生质体的制备 • 诱变育种 • 原生质体再生 • 菌株的分离 • 筛选
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2.3.4 微生物原生质体转化技术
ppt课件
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2.3.6 基因组该组育种
• 在微生物全基因组改造中快速进行特定群 体的基因交换重组，从而增加群体遗传多 样性，改良群体中个体性能等的连续遗传 改变及表型选择过程； • 人工诱变+原生质体融合
ppt课件
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2.4 微生物的基因工程育种
• 2.4.1 基因工程育种是指重组对象的目的基 因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞， 构建成工程菌（细胞），实现遗传物质的 重新组合，并使得目的基因在工程菌内进 行复制和表达的技术；

发酵工程第二章发酵工业微生物菌种

发酵工程第二章发酵工业微生物菌种
施加选择性压力分离法 随机分离法 这两种方法都是针对菌种从样品中分离所采用的
方法，实际发酵工业上菌种分离的步骤要有很多 步骤。
新种分离与筛选的步骤
定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长 培养特性。
采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为的通过控制养分或培养条件，使所需
菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包
工业上常用的微生物菌种
③ 霉菌： 工业上常用的霉菌有根霉、毛霉、红曲 霉、青霉等，主要生产酶制剂、抗生素、有机酸 和甾体激素等。
④ 放线菌： 工业上常用的有链霉菌属、小单胞菌 属和诺卡菌属，主要用于生产多种抗生素。
⑤ 担子菌： 即常说的蕈菌，主要用于生产多糖、 药物开发。
⑥ 藻类： 工业上常用的藻类有螺旋藻、单烈藻等， 主要用于生产食品，替代能源等。
新种分离与筛选的步骤
（三）培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物
的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在 这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一 步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分 离的方法有划线分离法、稀释分离法。
施加选择性压力分离法
施加选择性压力分离法：利用不同种类微生物生 长繁殖对环境和营养要求不同，人为控制这些条 件，使之利于某类或者某种微生物生长，不利于 其他微生物生存，以达到使目的菌占优势，从而 快速分离纯化的目的。
括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、 发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生 长和发酵最适温度、最适值、提取工艺等。
新种分离与筛选的步骤
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的 步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样 中所包含的所有微生物总数和种类。

第二章 工业微生物

第二章 工业微生物

培养分离
增殖培养效果显著，但目的微生物还在混 杂生长，必须进一步纯化分离。 纯种分离方法有划线分离，稀释分离法。
筛选
1、从产物角度 通过培养，依据在设计的培养基上形成目的产 物，利用简单、快速鉴定方法，入抗生素 采用与生产相近培养基和培养条件，在三角瓶 中小型发酵实验，以得到适合工业生产用菌种。
基因突变
定向育种：杂种育种，分子育种
基因重组
1、自然选育 （1）概念 （2）目的 （3）一般程序
（1）概念 不经过人工处理，利用菌种自然突变进行 菌种筛选过程。 原因：多因素低剂量诱变效应 各种短波辐射、低浓度诱变物质和微生物 自身产生诱变物质等。
互变异构效应 T和G碱基第六位可以形成酮式或烯醇式，C 和A碱基第六位可以形成氨基式或亚氨基式， 平衡后趋于酮式和氨基式，偶然也会出现烯醇 式和亚氨基式，导致DNA出现AT和GC碱基对 变成GT和AC，发生几率为10-8-10-9突变。
商品化生产菌介绍 1、抗生素生产菌 放线菌：链霉素、四环素、红霉素 真菌：青霉素、头孢
2、氨基酸生产 氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵是发酵 工业的一个转折点。 代谢控制发酵：用人工诱变方法，有意识 的改变微生物代谢途径，最大限度地积累 产物。
氨基酸生产菌要求： 代谢途径清楚、简单。 谷氨酸发酵菌种：棒杆菌属，短杆菌属、 节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌 其他氨基酸生产菌：常规菌种也可以由谷 氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌， 枯草芽孢杆菌
实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选
文献：产生菌为中性芽孢杆菌、嗜碱芽孢 杆菌、放线菌及霉菌 采样（造纸厂）——80℃30min处理 0.0075%曲利本蓝+1%CMC(羧甲基纤维素)， pH10.5培养3-4d，选择有凹陷圈的菌落

发酵工程 第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术

发酵工程 第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术
第二章 发酵工业微生物菌种 制备原理和技术
发酵工程 工业生产水平的
生产菌种的性能 发酵和提取工艺条件
三个决定要素
生产设备
获得优良的生产菌种是实现高水平发酵工程工 业生产的第一环节。
本章内容
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
第二节 自然界中微生物菌种的选择性分离
第三节 微生物菌种的选育
第四节 微生物菌种的退化、复壮和保藏 第五节 工业微生物菌种的扩大培养 第六节 种子培养基及其制备
集的培养物到固体培养基，分离优势微生物的单
菌落。

移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。
连续富集培养（恒化式富集培养）

改变限制性基质浓度来控制两种菌的比生长速率。 用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。
固体培养基的使用

ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
常用于分离酶产生菌，选择培养基中常含有所
需的基质，以便促使酶产生菌的生长，并在菌落
使目的微生物在种群中占优势，使筛选 1. 目的：
变得可能。
2. 两种方案：
（1）施加选择性压力分离法：采用特定的有利于 目的微生物富集的条件进行培养，使目的微生物 占优势，以实现快速分离纯化的目的。 （2）随机分离法：不能提供任何有助于筛选产生 菌的信息时，只能通过随机分离法进行分离。
（1）施加选择性压力分离法
酵母(既是微生物又是真核细胞)
生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。

发酵工程与设备第二章、第二讲发酵工业菌种的分离筛选

发酵工程与设备第二章、第二讲发酵工业菌种的分离筛选

透明圈法
在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培 养基混浊； 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。 分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉 酶、脂肪酶、核酸酶等；
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌
土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在 pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面； 碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生 一透明圈。
若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等， 便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈
6、随机分离方法
有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处， 因此常随机地分离所需菌种，为此发展了一些快速筛选方法 并归纳出高产培养基成分的选择准则如下：
1）制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素。
第三次平板分离
第三次原种斜面
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
种子培养
1株3-5瓶 较优菌株
保藏及进一步做生产性能试 验或作为育种的出发菌株
某些必要试验和毒性试验
2、分离与筛选的设计要求
在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：
1、菌的营养特征 2、菌的生长温度
但作为初筛的手段是有意义的
变色圈法
对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底 物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落 周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；
如 筛选果胶酶产生菌
用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微 生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果 红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会 出现绛红色水解圈。

发酵工程2发酵工业菌种应用护理课件

发酵工程2发酵工业菌种应用护理课件
基因敲除与突变
通过基因敲除或突变技术，改变 菌种的遗传物质，提高其性能或 产生新的性状。
01 02 03 04
产物合成能力分析
通过检测发酵液中的产物浓度， 了解菌种的产物合成能力，并优 化发酵条件以提高产物的产量。
响应面法优化
通过实验设计，优化发酵条件， 提高菌种的性能和产物产量。
04
工业菌种应用中的问题与解决 方案
乳酸菌
能产生乳酸，主要应用于酸奶、乳酪等乳制品发酵。
酵母菌
能进行有氧和无氧呼吸，常用于面包、酒类等食品发 酵。
霉菌
能产生多种酶和有机酸，常用于食品、饲料等发酵。
工业菌种的选择与培育
根据生产需求选择适当的菌种
根据产品特性和生产工艺要求，选择具有优良发酵性能的菌 种。
菌种培育
通过适当的培养基和培养条件，对菌种进行筛选、纯化、复 壮等操作，以保证菌种的活力和稳定性。
酵产物的产量和品质。
菌种应用
将驯化后的菌种应用于生产过程中， 通过优化发酵条件和工艺参数，实现
高效、低成本的发酵生产。
菌种护理
定期对菌种进行检测和维护，确保菌 种性能稳定和发酵生产的连续性。
某实验室菌种保藏与复苏实验
菌种保藏
采用低温、干燥、缺氧等方法， 将菌种长期保存于稳定的条件下 ，以备不时之需。
发酵工程2-发酵工业菌种应用护 理课件
目录
• 发酵工程简介 • 工业菌种在发酵工程中的应用 • 工业菌种的护理与保存 • 工业菌种应用中的问题与解决方案 • 案例分析
01
发酵工程ห้องสมุดไป่ตู้介
Chapter
发酵工程定义
01
发酵工程是通过操纵微生物的生命活动来生产有用物质的一门技术，涉及化学工 程、微生物学、生物化学等领域。
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提高目标产物的产量 提高目标产物的纯度，减少副产物 改良菌种性状，改善发酵过程 改变生物合成途径，以获得高产的新产品
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发酵工业菌种改良方法
常规育种(诱变育种) 细胞工程育种 基于代谢调节的育种技术 基因工程育种 蛋白质工程育种 代谢工程育种
在麦芽汁固体培养基上，25℃培养48-72h
形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用
纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次
性能测定
①生成子囊孢子速度测定 ②发酵力测定 ③热死温度测定 ④凝集力测定 ⑤双乙酰含量测定
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菌种选育改良的具体目标
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细菌分离：以乳酸菌为例
取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中
加麦芽汁至瓶口处，封塞，25℃培养24-48h
培养基中长出绢丝状波动物，镜检 杆状，阳性染色 初步断定乳酸菌
用选择性培养基分批富集培养2-3代
稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、CaCO3的琼脂培养基 根据透明圈挑选菌落
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最常用的工业微生物
放线菌
链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌
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未培养微生 方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微 生物群落中占有非常高的比例，约为99％。
研究方法 模拟自然培养法: 原位培养、培养条件优化、 单细胞操作 宏基因组分析法
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二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术 （一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 （二）分离筛选原理与技术 （三）应用举例
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本章内容
一、常用的工业微生物 二、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术 三、发酵工业菌种改良
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对产物进行菌种筛选时，有两条经验：
进化上向上兼容； 次生代谢在进化上后移，芽孢菌以上才
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设计筛选方案时必须考虑两个要点
▪ 选择性 ▪ 灵敏度
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3. 新种分离与筛选的步骤
调查研究（包括资料查阅）
试验方案设计 含微生物样品的采集 （如何使样品中含所需微
生物的可能性大？） 样品预处理 （如何在后续的操作中使这种可
生长条件的选择与控制原理 控制营养成分 控制培养基酸碱度 添加抑制剂 控制培养温度 控制通气条件
选择性分离技术 富集液体培养技术 施加选择压力，进行定向筛选 固体培养技术
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A.富集液体培养
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长
从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； 生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ； 从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目
的的优良菌株 ； 从已知菌种和大自然中分离新菌株
寻找新的发酵产品的产生菌； 寻找老产品的新的优良菌株。
➢ 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 经济性 指导性
B. 固体培养技术
常用于分离某些酶产生菌 选择压力：在选择培养基中加入所需酶
的基质
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随机分离原理与技术
从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速
灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛 选出所需的目的菌。
技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应 筛选方法的确定。
代表微生物类型
革兰氏阳性球菌 革兰氏阳性杆菌 革兰氏阴性肠道细菌
结核杆菌 酵母状真菌 丝状真菌
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药理活性化合物产生菌的筛选
药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一 个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到 治疗的目的。
筛选模型：目标酶
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▪ 抗药性筛选
筛选模型：氨苄青霉素和β-内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同
I
II
无试样时（不含棒酸时），I对II菌作用不大 有试样时（含棒酸时），I对II菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性
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试验菌
金黄色葡萄球菌209p 枯草杆菌6633 大肠杆菌 耻垢分枝杆菌607 白色念珠菌 青霉菌
再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂 培养后
产氨基酸菌落周围有生长圈
对应到copy前相应
位置，找到目的菌落
目的菌落进行液体培养，
对产物进行定量测定
筛选产物含量高的菌株
多糖产生菌的筛选
取样特点：碳水化合物工业的废弃物 筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液
状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来 筛选高产菌。
当S<S0时，富集什么菌株？ 当S>S0时，富集什么菌株？
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连续富集培养技术分离菌株的优点
分离的菌株特别适合连续发酵生产过程 有利于分离具有某种工业生产特性的菌株 可以筛选出能共生的稳定混合培养物
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分离方法的选择
根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法
菌种的营养特征独特 生长特征独特
选择性分离
无选择性特征 根据产物的特征进行
随机分离
▪ 选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控 制，从而实现定向富集筛选。
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选择性分离原理和技术
Ala-、抗Asp结构类似物 选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株 6.改善细胞膜的透过机能 7. 选育温度敏感突变株 8. 应用细胞工程和基因工程育种
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赖氨酸生产菌种的选育改良思路
出发菌株：黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌 育种思路 1.优先合成的转换——渗漏缺陷型的选育 2.切断支路代谢——营养缺陷型的选育：高丝氨酸缺陷型 3.抗结构类似物突变株的选育：AEC 4.解除代谢互锁：Leu- 、 抗Leu结构类似物、 喹啉s 、 苯醌s 5.增加前体物的合成和阻塞副产物的生成：
随机分离技术举例
抗生素产生菌的筛选
药理活性化合物产生菌的筛选
生长因子产生菌的筛选
多糖产生菌的筛选
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高产培养基设计的几个原则
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素；
使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物
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1. 筛选的两种指导思想
先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。 分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。
结果有两种可能：
▪ 获得适于工业发酵菌株 ▪ 只获得选育所需的出发菌株
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2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面
1. 菌种选择的总趋势
野生菌→变异菌 自然选育→代谢控制育种 诱发基因突变→基因重组的定向育种
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2. 菌种选择的要求
能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成 的目的产物产量高、易于回收；
生长速度和反应速度较快，发酵周期较短； 培养条件易于控制； 抗噬菌体及杂菌污染的能力强；
阻遏； 确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。
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抗生素产生菌的筛选
筛选模型：试验菌
筛选方法：
▪ 固体培养筛选
铺菌法 复印平板法
▪ 液体培养筛选
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2. 菌种选择的要求（续）
菌种不易变异退化； 对放大设备的适应性强； 菌种不是病原菌，不产生任何有害的生
物活性物质和毒素。
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（二）分离筛选原理与技术
1. 筛选的指导思想 2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面 3. 新种分离筛选原理与技术
或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式
▪ 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题
▪ 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选
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A
μ
B
S0 基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（μ）的影响
采用稀释法制平板，获取单菌落
根据高产菌的特点，选择目的菌落
筛选模型：形态依据
斜面保藏 高产菌恢复 放大培养，发酵液性能测试
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真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例
稀释分离法
取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7 取0.1ml 加入固体培养基铺平皿（×2）
菌种纯化
初步工艺条件摸索
再复筛 生产性能测试
较优菌株1-3株
保藏及进一步做生产试验 或作为育种的出发菌株
某些必要试验和 毒性试验等
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含微生物样品的采集
采样时应注意的问题: 土壤微生物的分布 采土深度 土壤植被情况 采样季节 土壤的酸碱度
生长因子产生菌的筛选
筛选模型：营养缺陷型试验菌 筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进
营养缺陷型试验菌生长
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氨基酸产生菌的筛选
样品
预处理
初筛（除真菌）
在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（copy 法）
平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 u.v线杀死长好的菌落
性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）
乳酸生成量测定（滴定法）
Rf值定性 （有机酸呈黄斑点）
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放线菌的分离： 以产链霉素菌种的分离为例
（从退化菌种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀
对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准： 土壤来源广泛 在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新 菌种
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样品的预处理
目的：提高分离效率 方法：
物理方法：热处理；膜过滤法；离心法 化学方法 诱饵法