pbmc细胞

PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。

Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。

注意事项

全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。

分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。否则将分层混乱。

步骤：

配制所需的溶液：

a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；

b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；

c.将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀； d.取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层；

PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。

e.加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；

f.加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；

２００７，２３（６）　中国人兽共患病学报　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｚｏｏｎｏｓｅｓ　５５７　

文章编号：１００２—２６９４（２００７）０６—０５５７—０５　

猪带绦虫抗原刺激囊虫病患者ＰＢＭＣ　

Ｔｈｌ／Ｔｈ２细胞因子的表达及其免疫调节＊　

夏惠，王雪梅，方强，李柏青，孙新　

摘　要：目的　检测猪带绦虫不同虫期抗原刺激囊虫病患者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）Ｔｈｌ／Ｔｈ２细胞因子的表达水平。　

并分析其在囊虫病免疫调控中的作用。方法　用流式细胞仪检测囊虫病患者新鲜血Ｔ淋巴细胞亚群，并以猪带绦虫六钩蚴　

抗原或囊尾蚴抗原刺激囊虫病患者ＰＢＭＣ，分别在刺激的第Ｏｄ、５ｄ、１０ｄ和１５ｄ时检测Ｔｈｌ／Ｔｈ２细胞因子（ＩＦＮ一．ｙ及ＩＬ－４），对　

分泌ＩＦＮ－．ｙ或ＩＬ－４的不同细胞群体进行数据分析。结果　囊虫病患者新鲜血Ｔ淋巴细胞亚群ＣＤ３　与ＣＤ４　细胞较正常人　

升高．ＣＤ４　／ＣＤ８　较正常人升高，分泌ＩＦＮ一．ｙ及ＩＬ＿４的ＣＤ３　细胞百分率较正常人升高；猪囊尾蚴抗原刺激囊虫病患者ＰＢ—　

ＭＣ第Ｏｄ、５ｄ、１０ｄ和１５ｄ时，分泌ＩＦＮ一　的ＣＤ３　细胞百分率分别为２５．４２　士５．５３　，３０．４６　士４．９４　。３６．５２　士４．７３　．　

３８．６９　土５．５８　；分泌ＩＬ一４的ＣＤ３　细胞百分率分别为２．５２％土０．５２％，３．００％土０．５７％．３．８１％士０．７０％。５．０３％士　

０．７３％。六钩蚴抗原刺激囊虫病患者ＰＢＭＣ分泌ＩＦＮ一．ｙ及ＩＬ一４的ＣＤ　细胞百分率亦呈现相同的变化趋势。结论　囊虫病　

患者与正常人相比ＰＢＭＣ中存在Ｔ淋巴细胞的极化水平异常。ＣＤ３　与ＣＤ４　细胞百分率均显著升高。Ｔ细胞亚群比例失调。　

免疫功能紊乱；随着囊尾蚴抗原刺激外周血ＰＢＭＣ时间延长．分泌ＩＦＮ一．ｙ和ＩＬ－４的ＣＤ３　细胞百分率逐渐升高。　

关键词：猪囊尾蚴抗原；六钩蚴抗原；囊虫病；流式细胞仪；Ｔｈｌ／Ｔｈ２　

PBMC分离与冻存

1、准备实验试剂与耗材

试剂：PBS液、淋巴细胞分离液、R10液、冻存液；

耗材：巴士管若干，EP管x4，冻存管x2， 15ml离心管x2，50ml离心管x1，细胞冻存盒x1

2、取新鲜抽取的人全血10ml，以670g的离心力，离心7min；

3、用巴氏管各吸取5ml淋巴细胞分离液至2支15ml离心管中，以1:1浓度稀释加入约10mlPBS至50ml离心管中；

4、全血离心结束后，轻轻吸取上清血浆2ml至EP管中，并以670rpm速度离心7min（待分装）；

5、将剩余抗凝血加入到装有10mlPBS的50ml离心管中，混匀并转移到装有5ml淋巴细胞分离液的15ml离心管中（此步应小心缓慢，尽量将血液悬在分离液上方）；

6、按program 1进行离心（800g，25min，加减速为0）；

7、盛有1ml血浆的EP管离心后，轻轻吸取上层清液平均分配至3个新EP管中，标记组别，姓名及日期信息，将资料录入电脑，并放至-20℃低温冰箱中保存；

8、经Program 1离心得到后的白膜轻轻吸取至另一支已事先加入20mlPBS 的50ml离心管中，补加PBS至35ml；

9、按program 2进行离心（1800rpm，15min，加减速为9）；

10、Program 2离心结束后，弃上清液，打散细胞，加入R10液4ml，补加PBS 液至20ml，吹打混匀后，吸取少量细胞悬液进行细胞计数（R10配方：；

11、按program 3进行离心；

12、准确操作软件，读出并记录细胞计数值；

13、program 3离心（1500rpm，15min，加减速为9））结束后，弃上清，打散细胞，加入2ml细胞冻存液，吹打混匀，将细胞悬液均分装至冻存管中（将细胞调至6-8×10^6个/ml，即若计数为18-24个/ml，则加3ml的细胞冻存液，冻存液的配制：FBS45mL+5mLDMSO，即9:1）；

WORD格式

专业资料整理

20ml 血液大约提取

6 9.6-13.6X10PBMC

PBMC（外周血单个核细胞）包括淋巴细胞（ T、B、NK）、单核细胞和树突状细胞。在人体

中这些细胞的比例因人而异。在多数研究中，淋巴细胞约占 PBMC的70～90％，单核细胞

约为10～30％，树突状细胞非常少，约为 1～2％。

对其中占多数的淋巴细胞进一步细分， 可发现其中 70～85％为CD3＋T细胞（折算成 PBMC

的比例约 45～70％），5～20％为B细胞（折算成 PBMC的比例约 15％），5～20％为NK细

胞（折算成 PBMC的比例约 15％）。

CD3＋T细胞由CD4＋T细胞（约占PBMC25～60％）和CD8＋T细胞（约占PBMC5～30％），比例约2：1。CD4＋和CD8＋T细胞均可进一步分为初始T（naiveT）、接触过抗原的中心记忆性、效应记忆性和效应性T细胞。对于这些亚群，由于不同研究使用的标记不同，故比例亦相差较大。

CD4＋T细胞又称为辅助性 T细胞，可按照细胞因子表达的不同而继续分为不同的功能亚群，

包括调节性 T细胞、Th1、Th2、Th17、Th9、滤泡辅助性 T、TR1等亚群。这些亚群的区分

只会越来越复杂。 CD8＋细胞毒性 T细胞现在可大致分为 200个功能表型。

循环B细胞包括过渡型、 未致敏、记忆型以及浆母细胞， 各个亚群比例不一。 循环树突状细

胞包括浆细胞样树突状细胞和髓系来源树突状细胞。 循环单核细胞可分为经典型单核细胞和

非经典型 CD16＋促炎症反应单核细胞（约占单核的 10％）。

人类免疫系统功能研究极其依赖 PBMC的表型和功能评估，因此对外周血各类亚群表型和功

能、PBMC与组织免疫细胞的不同进行充分了解是非常必要的。