种群结构

用微卫星序列和线粒体DNA分析北美山猫种群区域结构

摘要

分析物种遗传多样性有利于广泛分布的野生动物物种保护。北美山猫（Lynx rufus）是广泛分布的猫科动物，其保护管理以州为单位进行。目前对其广泛分布范围内的遗传多样性知之甚少。本文检测了北美大陆分布范围内山猫的10个微卫星位点和线粒体控制区序列，分析了该物种的分化格局：两种标记都支持西部种群与中西部/东部种群在地质时期都曾经历了种群扩散，且中西部/东部种群的栖息范围经历了周期性的扩散-缩小变化；三个群体间存在明显分化，说明近期出现的障碍阻隔了群体间的基因流。结果警示：人口增长破坏了山猫赖以生存和加强基因流动的森林环境，同时并提醒人们在大山猫分布范围内形成各州之间统一的保护管理方案，以保护其历史和现有遗传多样性。

关键词 Lynx rufus 微卫星DNA 线粒体DNA 遗传多样性 基因流 种群结构 北美洲

简介

遗传变异与分化格局是由历史和当代原因共同作用于进化因素形成，包括遗传漂变、基因流和自然选择。包括生存范围扩张和缩小、大范围自然景观变化在内的历史事件起初影响遗传分化格局的形成。然而，现今的基因流情况、人类居所变化等因素也在影响物种的遗传分化格局和种群结构。

对分布广泛、具有长距离迁徙能力、连续区域分布的物种进行遗传分析，可以帮助制定广泛范围内的统一保护措施。而实际情况是动物管理方案大都是由各个州、省划界而分别执行，但移动的物种并不遵循这些人为设定边界，因此此级别的管理方案并不合适，鉴于此，遗传分化研究工作可帮助形成有效管理方案。对广布的、可迁徙物种的研究工作很多，但都集中于多种脊椎，如海洋哺乳动物、陆生哺乳动物、鱼类和爬行动物。此类研究的目的是在清楚物种情况下有效管其遗传变异和制定保护措施。

作为生态链中顶级捕食者，某些猫科动物具有经济重要性和重要的生态学地位。Schwartz等人研究了加拿大猞猁Lynx canadensis的分布范围内的空间分化和种群内动力学，并检测了该物种在其西部生活中心区向外部大数量迁移的基因流。为保持生态链中物种连续性，Schwartz等得出结论，加拿大猞猁种群保护的保护国工作需要际合作。而另一方面，来自芬兰和波罗的海沿岸国家的欧亚猞猁种群的分子水平研究表明，这两个种群存在明显的遗传差异，需要分别管理。此外有研究表明，由于亚马逊河和达瑞恩海峡的阻碍，在美洲豹物种内基因流动受到限制，因此形成可观的遗传分化。

北美山猫是独居、具有高度迁移性、多配偶生活的肉食猫科动物，广泛分布与北美大陆，包括美国大部分地区、加拿和墨西哥部分地区。在北美山猫分布范围内，有12个亚种。亚种分类依据主要是皮毛颜色和颅骨的多变解剖形态。北美山猫可适应多种生境，但都需要森林覆盖，以供迁移及各种活动所需。

北美山猫被认为是被毛游戏性动物，由各州、省分别制定的野生动物保护措施管理。过去几十年内，美国一些州的山猫数量有所增加，并且现在数量上长势头不减。其中39个州内允许捕猎山猫，其他州由于山猫数量相对稀少而禁止猎杀，尤其在中西部地区，由于土地大面积用于耕作而使环境不适于山猫生存。在加拿大北部地区山猫数量有限，北部土著人生活的8个省份中有其个省份允许围猎山猫，而在西部和大西洋沿岸省份山猫则比较常见。由于数量下降，，魁北克省自1991年以来一直禁止猎杀山猫，并且发现山猫数量稳中有升。在墨西哥，有5个省份允许猎杀山猫，但并未发现墨西哥中部和南部山猫的数量减少。

由于较强迁移能力、广泛分布性、国际经济重要性和在北美生态系统中作为顶级捕食者的重要作用，山猫可以作为模式生物，来寻找与遗传多样性、种群分化和保护措施相关的问题。由于山猫并不遵循人为划定的行政州、省边界，因而基于遗传多样性和群体分化而制定的保护措施，比现行的保护政策更为合理。长距离迁徙能力使山猫的基因流动性比较大，分化程度较低。然而，有研究表明由于自然阻隔和人为障碍的存在，基因流只发生在小范围内。了解最大范围内的种群情况，才能发现山猫历史分化和现有种群格局的关联性，以最大程度保存该物种遗传多样性，以供繁盛繁衍和适应环境的所需。

曾有研究评估小范围内的山猫种群遗传结构，而所有种群分布范围内的种群遗传结构、以及其与现有保护政策的相关性，尚无人作相关研究。本文中用用微卫星序列和线粒体DNA来分析历史种群事件和现有种群隔离如何影响北美山猫的遗传多样性和种群分化。本文研究的意义在于为广泛分布物种的保护措施提供参考。

方法

采样与DNA提取

1995年-2006年间采集了587个野生山猫组织样本，包括耳、舌、肝组织。组织样本来源于各州省大学、科研机构以及个人的野生动物研究工作。室温样本保存、加20%的二甲基亚砜溶液中，用氯化钠浸泡直到提取DNA。肝组织样本来源于解剖实验，-70℃冻存。组织样DNA提取试用DNeasy tissue kit。 样本采集地包括美国的16个州和加拿大的2个省： Arkansas (AR)、California(CA)、Florida

(FL)、Illinois (IL)、 Indiana (IN)、Kentucky(KY)、Louisiana (LA)、Maine (ME)、Michigan [UP和LP]、Minnesota(MN)、Missouri (MO)、New Brunswick (NB)、North Dakota(ND)、Nova Scotia (NS)、Nevada (NV)、Texas (TX)、Wisconsin (WI)和Wyoming (WY)。来自Michigan州的样本被分为UP和LP，由于河流将该地区分割为上下半岛，并且因为早期研究证明两个地点来源的采样存在显著分化。因此，所采集的样本分为19个群体，代表早先分类中12个亚种中的8个亚种。有些样本提供了县级水平的采样地信息，而由于采样方法的原因，某些样本只能提供州、省级级别的采样地信息。由于山猫的保护管理是由州、省级部门进行，故对采样命名也以州省边界分别、取各个州省名缩写字母代表。

标记使用与分析

本文使用微卫星序列和线粒体DNA两种方法进行研究。所用10个微卫星座位已被用于其他种的猫科动物PCR反应中。其中六对引物的设计最初用于家猫研究（FCA023、FCA043、FCA045、FCA077、FCA090、FCA096），三对引物的设计用于加拿大猞猁研究(LC109、LC110、LC111)，一对引物最初用来研究北美山猫。PCR反应参数，参见Croteau所用的针对所有微卫星序列PCR反应参数。

PCR产物用含去离子甲酰胺、蓝色葡聚糖的EDTA上样缓冲液按1:1稀释，用36cm长度5%浓度变性胶分离，2500scan/h条件下，跑胶2.5小时。凝胶图像用Genescan3.1.2扫描，Genotyper

2.5用于等位基因分型，重复3次，以保证没有分型错误。用MICROCHECKER2.3.3检测无效等位基因位点。本文用PCR方法扩增线粒体DNA控制区基因，所用两引物为CatPro5’-CAAGGAAGAAGCAACAGC-3’和Cat12S5’-TRRAGGGCATTTTCACCG-3’，引物曾用于家猫线粒体DNA研究，锚定位点为环状线立体DNA的16249位和1018位，扩增长度近为1742个碱基。由于时间和技术原因，从587个样本中选取一部分用于DNA测序。从每个群体中选取一部分样本以保证每个地区都能被有效代表。但是由于测序分辨率原因，某些选样容量被高估，低于期望值。PCR反应体积为50μl，用2倍浓度的Thermoprime ABGene的PCR混合液，0.5μmol引物和30-50ngDNA模板。反应条件包括变性温度94℃2min，35次循环步骤为94℃1min，60℃1min，72℃1min，延伸反应72℃5min。产物纯化用QIA-quick PCR纯化试剂盒。设计三个引物用于该区域内的HVS-1序列和保守序列，上游引物为LruFwd3 5’-CACTATCAGCACCCAAAG

C-3’，锚定在家猫线粒体DNA该区域16,269位点，本反应中锚定于环状线粒体DNA的3位点，下游引物为LruRev2 5’-GACCCCGCATAGAGAATAAG-3’，锚定在家猫的160位点，本反应中锚定于环状线粒体DNA的882位点。中间引物为LruRevSeq 5’-AGGATTGCTGGTTTCTCG-3’锚定在家猫线粒体DNA该区域16,862位点，本反应中锚定于环状线粒体DNA的574位点。引物对共扩增813bp碱基对。循环测序反应为Eppendorf Mastercycler，参数为变性温度96℃4min，99次循环步骤96℃30s，50℃15s，60℃4min。用SephadexG-50柱分离扩增片段，36cm长度5%变性凝胶，1,200scans/h跑胶7小时，用ABI377automated sequencer读取序列信号。凝胶图像用Genescan3.1.2分析。DNA序列信息检测和比对工作用SEQUENCHER4.7完成。

该扩增序列中含有串联重复区，其区域大小、变异位点数目和重复度存在变化。由于对重复序列的比对存在不确定性，只重复序列两侧非464bp的重复序列可用于比对分析。因为扩增反应不佳，或者由于测序分辨率不高，某些个体样被再次测序并重新进行序列比对，因此近50%的样本被重新测序以保证正确的序列比对结果。

分析遗传多样性

根据微卫星序列标记结构数据检测群体当前遗传变异度。用GENETIX4.05计算观测杂合度和估计杂合度，用FSTAT 2.9.3.2计算等位基因数目、等位基因相对丰度、等位基因频率。用GENEPOP4.0分析每个群体中10个位点的连锁非平衡LD值，用GENEPOP4.0检测群体偏离遗传平衡HWE的显著值。

用线粒体DNA控制区变异数据观测采样地群体历史遗传多样性。用DnaSP4分析序列变异位点数目、单倍型、碱基转换和颠换数目以及插入-缺失位点。用ARLEQUIN 3.11计算样本采集地单倍型变异性h、核苷酸变异性π。h、π值均被用于群体扩张、种群瓶颈、HWE和采样地群体混合度检测。单倍型差异矩阵用于各个扩增片段之间的变异分析。

分析历史种群数量

用NETWORK 4.5构建“巢式”系统树。选用这种系统树原因在于被研究测序的单倍型被接在末端，而中间连接枝代表已经消失的、或为仍存在的原始单倍型，此种系统树更能准确描述单倍型之间的亲缘关系。

几个统计数据用于历史种群数量的的扩大、减缩或平衡分析。扩张速率S/d用于区分种群数量分析扩张和平衡，该值大则说明近期发生了种群扩张，值小则说明种群数量处于长期稳定状态。Fst值、D*值和F*值都被用来测算历史种群数量变化。较高的Fst值和较低的D*值与F*值，说明种群处于扩张状态；而相反则说明，种群变化是由于自然选在的作用。核酸比对错配分布以及rg值用于区分种群扩张和碱基漂变平衡。 分析群体结构

STRUCTURE2.3.1分析现有群体结构，推断采样群体的聚类簇数目K，并将各个群体归类到相应聚类簇中。用Bayesian聚类计算模型来在特定假设K值下计算聚类“后可能性”，并且寻找最可能K值，模拟计算首先假设HWE和连锁平衡条件。设定不同K值所产生的∆K，在∆K最大时，K值能最好解释聚类簇数目。