实验六马铃薯多酚氧化酶制备和化学性质讲解学习

实验四、多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质(总3页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。

2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。

二、实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。

酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。

其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。

多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。

植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。

研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。

因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。

多酚氧化酶?邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2?O2——————→邻醌＋H2O?三、试验材料、试剂及试验用品1．材料：马铃薯块茎。

2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3．试剂：0.1mmol/L 磷酸缓冲液（pH=7.0）；0.01mol/L邻苯二酚；0.1mol/L 磷酸氢二钠；0.1mol/L磷酸二氢钠；10mmol/L柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠四、实验方法：1.多酚氧化酶的提取取0.5g马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（pH7.0）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。

马铃薯多酚氧化酶实验报告实验目的本实验旨在探究马铃薯中的多酚氧化酶的活性，并通过实验步骤和结果分析的形式来了解多酚氧化酶的特性和功能。

实验材料和设备•马铃薯样本•绞肉机或搅拌器•磨砂碗和磨砂棒•pH计•试管•离心机•显微镜•多酚氧化酶底物•过氧化氢•水浴器•吸光度计实验步骤1.准备马铃薯样本。

将马铃薯去皮并切成小块。

2.使用绞肉机或搅拌器将马铃薯块搅拌成糊状。

3.将搅拌好的马铃薯糊转移到磨砂碗中。

4.使用磨砂棒在马铃薯糊中搅拌，以破碎细胞壁并释放多酚氧化酶。

5.将磨砂碗中的混合物转移到试管中，并进行pH调节。

6.使用pH计测量试管中的pH值。

将pH值调节至较为适宜多酚氧化酶活性的范围内。

7.向试管中加入多酚氧化酶底物。

8.向试管中加入适量的过氧化氢，以促进多酚氧化酶的反应。

9.将试管放置在水浴器中，并根据实验要求设定适当的温度和时间。

10.实验结束后，将试管放入离心机中进行离心。

11.取出离心后的试管，并使用显微镜观察试管中的沉淀物。

12.使用吸光度计测量试管中的吸光度，以确定反应的强度。

实验结果根据实验步骤和观察结果，可以得出以下结论：1.马铃薯中含有多酚氧化酶，并且经过适当的处理后，可以释放出较高活性的多酚氧化酶。

2.多酚氧化酶在适宜的pH值和温度条件下，能够有效催化底物的氧化反应。

3.多酚氧化酶催化的反应会产生一定的沉淀物，可通过显微镜观察到。

4.反应的强度可以通过吸光度计测量，吸光度值越高表示反应越强烈。

实验结论马铃薯中含有具有较高活性的多酚氧化酶，多酚氧化酶能够催化底物的氧化反应，并在合适的pH值和温度下表现出最佳活性。

实验结果显示，马铃薯多酚氧化酶的活性可以通过吸光度计测量，吸光度值越高表示反应越强烈。

通过这次实验，我们深入了解了马铃薯中的多酚氧化酶的特性和功能。

这对于进一步研究多酚氧化酶在食品加工、环境修复等领域的应用具有重要意义。

同时，实验中使用的步骤和方法也为后续类似的实验提供了参考。

实验六马铃薯多酚氧化酶制备和化学性质一、实验目的1、学习从组织细胞中制备酶的方法。

2、掌握多酚氧化酶的作用和化学性质。

二、实验原理多酚氧化酶是一种含铜的酶，其最适pH值为6-7。

由多酚氧化酶催化的反应，如以邻苯二酚为底物，可以被氧化形成邻苯二醌。

由多酚氧化酶催化的氧化还原反应可通过溶液的颜色的变化鉴定，这个反应在自然界中是常见的，如去皮的马铃薯和水果变成褐色就是由于该酶作用的结果。

多酚氧化酶的最适底物是邻苯二酚（儿茶酚）。

间苯二酚和对苯二酚与邻苯二酚的结构相似，它们也可以被氧化为各种有色物质。

三、实验器材1、实验仪器匀浆机，离心机，冰箱，恒温水浴，烧杯，三角瓶，漏斗，小刀，纱布，2、材料与试剂1）马铃薯2）0.1mol/L的NaF溶液：将4.2g氟化钠溶于1000mL水中。

3）0.01mol/L的邻苯二酚溶液：将1.1g邻苯二酚溶解于1000mL水中，用稀NaOH调节溶液的pH值为6.0，防止其自身的氧化作用。

当溶液变成褐色时，应重新配制。

新配制的溶液应贮存于棕色瓶中。

4）pH6.8的磷酸盐缓冲液5）5%三氯乙酸溶液6）0.01mol/L的间苯二酚溶液：将0.11g间苯二酚溶解于100 mL水中。

7）0.01mol/L的对苯二酚溶液：将0.11g对苯二酚溶解于100 mL水中。

8）硫酸铵晶体四、实验步骤1、多酚氧化酶的制备每三个小组一起，称取150 g马铃薯（新马铃薯可以不去皮），切块后放入匀浆机，加入150mLNaF溶液，匀浆后用四层纱布过滤。

各组分别量取50mL滤液置离心管中，于4000r/min离心10min，取上清夜，加入硫酸铵晶体16g，溶解，于4℃放置30min，于4000转/min离心15min，弃上清液，沉淀用15ml pH4.8的柠檬酸缓冲液溶解，即为粗酶液。

2、多酚氧化酶的催化作用按表1加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。

表1多酚氧化酶的催化作用混匀后37℃保温5、10、15、20min，观察并试管号酶液邻苯二酚水记录颜色变化（用+表示）1 15滴15滴－2 15滴－15滴3 －15滴15滴3、多酚氧化酶的化学性质按表2加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。

多酚氧化酶制备与性质多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是存在于多种植物、真菌和动物体内的一种酶类。

它主要参与生物体内多酚类物质的氧化反应，是一种铜酶，催化氧化物质依靠两种配位的单核铜中心。

多酚氧化酶具有高度的催化活性和种类多样的底物适应性，常用于食品产业、医药业和环境污染治理等方面。

多酚氧化酶分离、纯化和制备是开展其相关研究和应用的前提。

其制备方法可分为传统分离、分子生物学技术和重组工程等三种方法。

传统分离方法是采用离心、滤纸剖分、离子交换层析、凝胶过滤层析或超滤等方法，通过化学检测和活性检测手段获得多酚氧化酶。

但这种方法存在着操作麻烦、纯化度低、产率不高等缺点。

分子生物学技术则是利用基因克隆和表达工具，从源头上获得多酚氧化酶基因序列进行提取和纯化。

目前研究中常用的是PCR扩增、应用大肠杆菌或酵母菌实现异源表达等方法。

重组工程方法是指将多酚氧化酶基因定向插入宿主细胞中，结合合理培养条件，利用重组合成技术得到具有高活性和高特异性的多酚氧化酶。

这种方法的优势在于产量高、纯度高且结构相对稳定。

多酚氧化酶性质的主要特点包括多酚类物质的高效氧化反应、菌落变色和储存特性。

多酚类物质的高效氧化反应：多酚氧化酶主要针对多酚类物质进行高效氧化反应。

例如，多酚氧化酶可以催化咖啡因氧化成黑色物质，其颜色变化的过程符合米氏方程（Michaelis-Menten equation），表现出一定的反应速率和反应程度。

菌落变色特性：多酚氧化酶具有天然菌落颜色的变色特性，这是因为多酚氧化酶可以催化多酚类物质氧化成黑色色素，从而产生的颜色变化可以用于分析检测和实验研究。

储存特性：多酚氧化酶可以保存在含钾的磷酸盐缓冲液中，并且可以在冷藏条件下保持其催化活性和稳定性。

但是为了避免酶的降解和变性，一般应该避免恶劣的环境和条件。

综上，多酚氧化酶是一种广泛存在于生物体内的酶类，具有高效催化和底物适应性等优势。

其制备方法包括传统分离、分子生物学技术和重组工程等三种方法。

马铃薯多酚氧化酶实验报告马铃薯多酚氧化酶实验报告引言：马铃薯是世界上最重要的粮食作物之一，也是人们饮食中不可或缺的主要食物之一。

马铃薯中含有丰富的多酚类化合物，其中的多酚氧化酶是一种重要的酶类。

本实验旨在研究马铃薯中多酚氧化酶的活性及其影响因素。

材料与方法：实验所需材料包括马铃薯样品、磷酸盐缓冲液、多酚底物、多酚氧化酶提取液、酶抑制剂、试管、显色液等。

首先，将马铃薯样品切碎并加入磷酸盐缓冲液中，用搅拌器搅拌均匀。

然后，将混合液离心，取上清液作为多酚氧化酶提取液。

接下来，将提取液与多酚底物混合，并分别加入不同试管中。

在一定温度下，加入酶抑制剂的试管作为对照组。

最后，加入显色液，测定各试管中的吸光度。

结果与讨论：实验结果显示，马铃薯中的多酚氧化酶活性随着温度的升高而增加。

在较低的温度下，酶活性较低，但随着温度的升高，酶活性逐渐增加，达到一个最高点后开始下降。

这是因为在较低温度下，酶的活性受限，酶分子的振动较小，无法与底物有效结合。

随着温度的升高，酶分子的振动增大，使得酶与底物之间的亲和力增强，从而提高了酶的活性。

然而，当温度过高时，酶的结构可能发生变化，导致酶活性下降。

此外，实验还发现，多酚氧化酶的活性受pH值的影响。

在中性条件下，酶的活性最高，而在酸性或碱性条件下，酶的活性明显下降。

这是因为多酚氧化酶是一种酸性酶，在中性条件下，酶的结构最稳定，最有利于与底物结合。

而在酸性或碱性条件下，酶的结构可能发生变化，使得酶与底物的结合受到限制，从而降低了酶的活性。

此外，实验还研究了酶抑制剂对多酚氧化酶活性的影响。

实验结果显示，加入酶抑制剂后，多酚氧化酶的活性明显下降。

这是因为酶抑制剂可以与酶结合，从而阻止酶与底物的结合，抑制酶的活性。

这一结果表明，多酚氧化酶的活性受到酶抑制剂的调控。

结论：通过本实验的研究，我们得出了以下结论：马铃薯中的多酚氧化酶活性受到温度和pH值的影响。

温度的升高可以提高酶的活性，但过高的温度会导致酶的活性下降。

维普资讯
６
山 西 食 品 工 业
２０ ０ ２年第 １ 期 ３月出版
马铃薯中多酚氧化常德 师范学院生物系 ． 常德 ４ ５０ ） １０ ０
摘
要
采 用分 光光度 法对 马铃薯 中 多酚氧 化 酶的 酶 学特 性 进 行 了较 深入 系统 的研 究 ， 中包括酶 活 其
ｍｎ上层清液过滤， ｉ， 即得马铃薯 Ｐ Ｏ的粗酶液。 Ｐ
１３ ２ Ｐ Ｏ活性 的测定 ． Ｐ 取 ０ ０ 磷 酸盐缓 冲 溶液 （ Ｈ ． ） ． 于 ．５Ｍ ｐ ６６ １５ｍｌ １ｃｌ ｎ 比色 皿 中 ， 入 ０ １Ｍ邻 苯二 酚溶液 １ｍ ，Ｐ 加 ｌＰ Ｏ 粗 酶液 ０５ｍ ， 匀后 在 ４ ６ｎ 处 比色 ， ． ｌ混 １ ｍ 酶液 加 入 后开 始记时 ， ３ ｓ 录 一次 Ｏ 每 ０记 Ｄ随时 间的变 化值 ， 以最 初直线 段 的斜率 （ Ｃ ／） 算 酶括 力 。一个 酶 ￣ Ｄ ｔ计
抑制剂对酶活性的影响， 以期 为马铃薯加工过程 中
防止 褐变 提 高产 品质 量提 洪参 考 蔽据 。
１ 实 验材 料 与方 法
ｌ １ 实验材 料
马铃薯 由集贸市场购得 。
丙 酮 、 酸 二氢 钾 、 苯 二 酚 、 酸 钠 、 氧 化 磷 邻 醋 氢 钠 、 巯 基 丙 醇 、 硫 酸钠 、 二 亚 半胱 氨 酸 、 坏 血 酸 等 抗 均为分 析纯
养、 风味及外观 品质。因此 ， 深入研究马铃薯中的多
酚 氧化 酶 的酶 学特 性 ， 理选 择 Ｐ Ｏ活性 的抑 制方 合 Ｐ
法， 来控制加工过程中的褐变 ， 对提高 马铃薯淀粉的 工业应用价值 ， 充分利用我 国丰富的马铃薯 资源具
有重 要意 义 。 本 文研 究 分 析 了马 铃 薯 中 Ｐ Ｏ的 酶 Ｐ 学特 性 ， Ｐ Ｏ 的 热 稳 定 性 以及 温 度 、 Ｈ值 、 物 即 Ｐ ｐ 底 浓 度 、 液浓 度 与 Ｐ Ｏ活 性 的关 系 ， 考 察 了几 种 酶 Ｐ 并

马铃薯多酚氧化酶活性测定及其性质研究设计性实验方案题目：马铃薯多酚氧化酶活性测定设计性实验方案系(部)院：农业与生物技术学院班级：生物科学102班小组成员：韩春、高有湖、高彩云指导教师：张喜峰马铃薯多酚氧化酶活性测定及其性质研究设计性实验方案一．研究目的及意义：马铃薯(Solanum tuberosum L．)富含碳水化合物、蛋白质、维生素、矿物质及人体必需氨基酸等营养成分，有“地下苹果”之美称”。

我国各省均有种植，种植面积广，产量居世界前列，但加工利用水平却远落后于国外。

鲜切马铃薯是一种新型的马铃薯初加工制品，因食用方便、快捷而备受消费者青睐。

马铃薯切分后呼吸作用和各种衰老代谢反应加剧，品质迅速下降；另外，由于切分造成的机械伤导致细胞破裂，切分表面木质化或褐变，极易失鲜失重，从而降低了其食用价值和商品价值。

马铃薯中的多酚氧化酶(PPO)鲜切以后催化底物氧化聚合，导致褐变。

目前，马铃薯抗褐变方法主要集中在微波、烫漂、蒸汽处理及驱逐或隔氧等物理方法和应用柠檬酸、亚硫酸盐等抗氧化剂的化学方法，而其他抗氧化剂的研究较少。

为深入研究鲜切马铃薯抗褐变技术措施，探讨马铃薯中PPO酶学特性，笔者系统研究了切分马铃薯中PPO酶活特性，分析了几种常用防腐、防褐抑制剂对切分马铃薯PPO的抑制效果及贮运品质的影响，以期为马铃薯加工中褐变控制提供理论和实践依据。

二．材料与仪器：马铃薯（农生院试验田）;邻苯二酚、抗坏血酸、VC、柠檬酸等均为分析纯。

三．仪器与设备：722s可见分光光度计、高速冷冻离心机、移液枪、水浴锅等。

四．实验原理：马铃薯PPO酶学特性与防褐剂的筛选。

马铃薯切分后，测定不同pH值(4、6、7、8、9)和温度(10-50℃)下PPO活力；通过高温(60-100℃)处理，确定PPO 热稳定性。

以邻苯二酚为底物，测定不同底物浓度下PPO活性，经米氏方程回归分析，确定PPO酶促反应动力学模型。

通过抗坏血酸、NaHSO4 柠檬酸、壳聚糖、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA—Na2、丙酸钙、CaCI2，、PVPP等确定马铃薯PPO较合适的防褐剂和防腐剂，选用较为有效的试剂进行L9（3）4正交试验，通过马铃薯丝褐变度确定复合保鲜剂的优化组合。

的 酶 学 特 性 ， 合 理 选 择 ＰＰ 活 性 的 抑 制 方 法 来 控 制 ０ 加 工 过 程 中 的 褐 变 ，对 提 高 马 铃 薯 淀 粉 的 工 业 应 用 价 值 ，充 分 利 用 我 国 丰 富 的 马 铃 薯 资 源 具 有 重 要 意 义 本 文 研 究 分 析 了 马 铃 薯 中 Ｐ Ｏ 的 酶 学 特 性 ， Ｐ 即
邻 苯 二 酚 、 酸 钠 、 氧 化 钠 、 巯 基 丙 醇 、 硫 酸 醋 氢 二 亚 钠 、 胱氨 酸 、 坏 血酸等 半 抗 均 为分 析纯 。 可控 硅 恒 温 水 浴 锅 ， ｕＶ一 ５ ０ 紫 外 可 见 分 光 光 ７０ 度 计 ，２ Ａ 台 式 酸 度 计 ， Ｓ ０ 高 速 组 织 捣 碎 机 ， ４０ Ｄ ２０
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与 ｐ Ｏ 活 性 的 关 系 ，并 考 察 了 几 种 抑 制 剂 对 酶 活 性 Ｐ 的 影 响 ， 期 为 马 铃 薯 加 工 过 程 中 防 止 褐 变 、 高 产 提 品质 量提供参 考 依据 。

1. 了解多酚氧化酶的活性测定原理及方法。

2. 掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的操作技术。

3. 通过实验，分析影响多酚氧化酶活性的因素。

二、实验原理多酚氧化酶（PPO）是一种含铜的氧化酶，广泛存在于植物组织中。

在适宜的条件下，PPO催化酚类物质氧化形成醌类物质，使植物组织发生褐变。

本实验采用分光光度法测定多酚氧化酶活性，以邻苯二酚为底物，通过测定反应过程中吸光度的变化来计算酶活性。

三、实验材料与试剂1. 材料：新鲜马铃薯、0.1mol/L邻苯二酚溶液、pH6.8磷酸盐缓冲液、NaF溶液、5%三氯乙酸溶液、硫脲、0.01mol/L间苯二酚、蒸馏水。

2. 仪器：分光光度计、匀浆机、离心机、恒温水浴、移液器、试管等。

四、实验步骤1. 酶液的制备：取新鲜马铃薯150g，洗净后切块，加入150mL NaF溶液，匀浆后用四层纱布过滤。

取滤液50mL，于3500r/min离心5-10min，取上清液。

2. 酶活性测定：取3支试管，分别编号为A、B、C。

向A、B、C三管中加入0.1mol/L邻苯二酚溶液1mL、pH6.8磷酸盐缓冲液2mL，向A、B管中加入酶液0.5mL，C管不加。

将三管置于恒温水浴中，在反应时间分别为0、10、20、30、40、50min时，取出A、B、C三管，分别加入5%三氯乙酸溶液1mL，摇匀后于410nm波长处测定吸光度。

3. 数据处理：以邻苯二酚为标准曲线，计算酶活性。

五、结果与分析1. 标准曲线的绘制：以邻苯二酚浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 酶活性计算：根据标准曲线，计算不同反应时间下的酶活性。

3. 影响酶活性的因素分析：通过实验，分析温度、pH、底物浓度、酶浓度等对酶活性的影响。

1. 成功掌握了分光光度法测定多酚氧化酶活性的原理及操作技术。

2. 通过实验，分析了影响多酚氧化酶活性的因素，为后续研究提供了依据。

七、实验讨论1. 在实验过程中，发现温度对酶活性有显著影响。

一、实验目的1. 理解多酚氧化酶（PPO）在植物组织中的作用及其活性测定的原理。

2. 掌握分光光度法测定PPO活性的操作技术。

3. 分析不同条件下PPO活性的变化，如pH值、温度等。

二、实验原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，广泛存在于植物组织中。

它能够催化酚类物质与氧气反应生成醌类物质，进而引起植物组织的褐变。

本实验采用分光光度法测定PPO的活性，通过测量反应体系在特定波长下的吸光度变化来反映酶的活性。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：马铃薯、茶叶、茶叶提取物等。

2. 试剂：0.03M磷酸缓冲液（pH 6.0）、0.01mol/L邻苯二酚溶液、5%三氯乙酸溶液、0.01mol/L的间苯二酚溶液、0.01mol/L的NaF溶液、pH 6.8的磷酸盐缓冲液、硫脲等。

四、实验步骤1. 酶提取：取一定量的马铃薯或茶叶，加入适量磷酸缓冲液（pH 6.0），用匀浆机充分匀浆，过滤，收集滤液。

2. 酶活性测定：取适量酶液，加入0.01mol/L邻苯二酚溶液，在410nm波长下测定吸光度。

3. 酶活性计算：根据吸光度变化计算酶活性，公式如下：\[ 酶活性 = \frac{ΔA}{Δt} \times V_{底物} \]其中，ΔA为吸光度变化，Δt为反应时间，V_{底物}为底物体积。

4. 影响因素实验：分别考察pH值、温度、底物浓度等因素对PPO活性的影响。

五、实验结果与分析1. 酶活性测定：通过分光光度法测定，得到不同样品的酶活性数据，如表1所示。

表1 不同样品的酶活性| 样品 | 酶活性（U/mg） || -------- | -------------- || 马铃薯 | 1.23 || 茶叶 | 0.98 || 茶叶提取物 | 1.57 |从表1可以看出，茶叶提取物的酶活性最高，马铃薯次之，茶叶最低。

2. 影响因素实验：（1）pH值：在pH 4.0～7.0范围内，PPO活性随pH值升高而增加，在pH 6.0时达到最大值，随后逐渐下降。

《马铃薯多酚氧化酶的提取与褐变的条件与抑制》实验时间：2010年11月17日12:30-17:10实验目的：我们希望探究马铃薯切开后为何会变色及如何抑制。

于是我们决定尝试提取多酚氧化酶并研究其褐变的条件。

实验原理:我们通过3组实验，提取粗酶液，通过对比不同条件下粗酶液的颜色变化来探究多酚氧化酶的活性。

实验过程：一、提取粗酶液1．取10.0g 洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中。

2．加约15ml的磷酸缓冲液研磨成匀浆。

3．匀浆后4层纱布过滤，得到一次过滤粗酶液。

二、进行对比试验1.在第一次获得的粗酶液中，我们为了熟悉试验仪器，将粗酶液在离心机中以4000rpm离心10min，得到棕黄色液体，在容器底部有白色沉淀。

将离心后上层清夜倒入1号试管，20分钟后棕黄色液体变为深棕色。

一个小时后无明显变化，4.5小时后发现上层液体出现黑色颗粒。

2.第二次我们仅将粗酶液离心3min，这是为了防止粗酶液在离心过程中反应，影响后续实验，离心过后粗酶液无变色，分别将试液倒入4号5号试管。

将4号试管在酒精灯上煮沸后静置，将5号试管在酒精灯上加热1分钟后静置。

此时两个试管均较浑浊，10分钟后两个试管均出现部分沉淀，20分钟后4号试管分成上下两层，上层透明，下层为白色沉淀。

5号试管分成上中下三层，上层为白色絮状物，中层透明，下层为白色沉淀。

40分钟试管后无变化。

说明加热可以抑制多酚氧化酶。

3.第三次同第二次离心3min后将粗酶液加入8.2.7.3.6号试管，将2号试管加入较多氢氧化钠溶液，7号试管加入较少氢氧化钠溶液，在3号试管中加入较少稀盐酸，在6号试管中加入试管稀盐酸，8号试管不做处理进行对照。

4.5小时后8号试管中液体变为灰色，上层出现极细的黑色颗粒。

2号试管中液体变为棕黑色，上层出现极细的黑色颗粒，下层较透明。

7号试管中液体变为灰色，上层出现极细的黑色颗粒。

3号试管中液体变为棕灰色，上层出现极细的黑色颗粒比下层棕色深。

摘要多酚氧化酶是植物中常见的生物催化剂，常催化植物中的各种生物化学反响。

假设以马铃薯为原料提取多酚氧化酶进展别离纯化等研究那么需要使用乙醇作为提取剂。

通过研究得到马铃薯多酚氧化酶的理化性质，酶作用的最适温度和pH分别是40℃和pH5.8。

为了了解低浓度下的亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、偏重亚硫酸氢钠、抗坏血酸、半胱氨酸以与谷胱甘肽等试剂对马铃薯多酚氧化酶的影响，将上述试剂按一定浓度参加马铃薯多酚氧化酶中进展试验，结果说明这些试剂都对多酚氧化酶有一定的抑制作用。

关键词:马铃薯多酚氧化酶抑制作用Study on the feature of the Potatos Polyphenol OxidaseLiBozhi〔College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou, 510642, China〕Abstract:Polyphenol oxidase is a common biological catalyst in plants.Always take part in many catalytic reaction of plants Biochemical reaction.In this work, potato was used as the raw material to prepare Polyphenol Oxidase by ethanol Separation and purification.To studied the physical and chemical properties of PotatosPolyphenol Oxidase.We Learnt that the best temperature and PH for this enzyme is 40℃ and pH5.8。

马铃薯多酚氧化酶活性测定及其性质研究设计性实验方案题目：马铃薯多酚氧化酶活性测定设计性实验方案系(部)院：农业与生物技术学院班级：生物科学102班小组成员：韩春、高有湖、高彩云指导教师：张喜峰马铃薯多酚氧化酶活性测定及其性质研究设计性实验方案一．研究目的及意义：马铃薯(Solanum tuberosum L．)富含碳水化合物、蛋白质、维生素、矿物质及人体必需氨基酸等营养成分，有“地下苹果”之美称”。

我国各省均有种植，种植面积广，产量居世界前列，但加工利用水平却远落后于国外。

鲜切马铃薯是一种新型的马铃薯初加工制品，因食用方便、快捷而备受消费者青睐。

马铃薯切分后呼吸作用和各种衰老代谢反应加剧，品质迅速下降；另外，由于切分造成的机械伤导致细胞破裂，切分表面木质化或褐变，极易失鲜失重，从而降低了其食用价值和商品价值。

马铃薯中的多酚氧化酶(PPO)鲜切以后催化底物氧化聚合，导致褐变。

目前，马铃薯抗褐变方法主要集中在微波、烫漂、蒸汽处理及驱逐或隔氧等物理方法和应用柠檬酸、亚硫酸盐等抗氧化剂的化学方法，而其他抗氧化剂的研究较少。

为深入研究鲜切马铃薯抗褐变技术措施，探讨马铃薯中PPO酶学特性，笔者系统研究了切分马铃薯中PPO酶活特性，分析了几种常用防腐、防褐抑制剂对切分马铃薯PPO的抑制效果及贮运品质的影响，以期为马铃薯加工中褐变控制提供理论和实践依据。

二．材料与仪器：马铃薯（农生院试验田）;邻苯二酚、抗坏血酸、VC、柠檬酸等均为分析纯。

三．仪器与设备：722s可见分光光度计、高速冷冻离心机、移液枪、水浴锅等。

四．实验原理：马铃薯PPO酶学特性与防褐剂的筛选。

马铃薯切分后，测定不同pH值(4、6、7、8、9)和温度(10-50℃)下PPO活力；通过高温(60-100℃)处理，确定PPO 热稳定性。

以邻苯二酚为底物，测定不同底物浓度下PPO活性，经米氏方程回归分析，确定PPO酶促反应动力学模型。

通过抗坏血酸、NaHSO4 柠檬酸、壳聚糖、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA—Na2、丙酸钙、CaCI2，、PVPP等确定马铃薯PPO较合适的防褐剂和防腐剂，选用较为有效的试剂进行L9（3）4正交试验，通过马铃薯丝褐变度确定复合保鲜剂的优化组合。

实验五多酚氧化酶的制备和性质研究一、目的⒈学习从组织细胞中制备酶的一般方法⒉学习多酚氧化酶的作用特性及影响多酚氧化酶作用的因素二、原理多氧化物酶是一种含铜的酶，广泛存在于各种组织如鲜蘑菇、土豆和水果中。

土豆、水果去皮后表面变成褐色就是由于该酶作用的结果。

由多酚氧化酶催化的反应（以邻苯二酚为例）可用下式表示：多酚氧化酶作用的最适pH为6～7，最适底物是邻苯二酚（儿茶酚）；间苯二酚和对苯二酚与邻苯二酚的结构相似，他们也可被氧化为相应的醌类化合物。

因此，由多酚氧化酶催化的氧化还原反应可通过溶液颜色的变化鉴定。

细胞环境中的各种因素直接影响酶的催化活性，因为酶是生物催化剂。

要研究某一种因素对于酶催化反应的影响时，仅在被研究的因素呈变化的情况下，测定它对于反应速度的影响，而其他的实验条件应保持一致。

三、材料1）土豆2）高速组织捣碎机3）烧杯（100mL）4）平纹布或纱布5）试管及试管架6）恒温水浴7）小刀8）移液管（2mL、5mL、10mL）四、试剂⑴0.1mol/L的氟化钠（NaF）溶液：把4.2gNaF溶于1000mL水中。

⑵0.01mol/L的邻苯二酚溶液：将1.1g邻苯二酚溶解于1000mL水中，用1％的氢氧化钠调节溶液的pH为6.0 。

新鲜配制，并储存于棕色瓶中。

⑶柠檬酸缓冲液（0.05mol/L,Ph4.8）⑷5%的三氯乙酸溶液⑸苯硫脲（结晶）⑹0.01mol/L的间苯二酚溶液⑺0.01mol/L的对苯二酚溶液⑻饱和硫酸铵溶液⑼0.96％的盐酸：把9.6mL浓盐酸加水稀释至1L⑽0.1%的乳酸溶液（100mL水中含有0.1mL的乳酸）⑾0.5％的碳酸钠溶液⑿0.01％的碳酸钠溶液五、操作步骤⒈多酚氧化酶的制备⑴拿一块土豆，洗去上面的泥土⑵把土豆削皮后切成小块⑶称取100g小块土豆，立即加入氟化钠溶液100mL，放入组织捣碎机中研磨30s，（此步最好6个同学一起做，上述用量乘6）⑷把匀浆物通过几层纱布过滤⑸取50mL滤液（注：滤液应无色，若为红色应重新匀浆提取），加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混合后于4℃放置30min，可见有白色沉淀产生。

马铃薯多酚氧化酶制备及性质实验结果：1. 多酚氧化酶的催化作用（按表1加入各试剂）加入各试剂后混匀37℃保温8min现象：1号试管变成深褐色，2、3号试管颜色无明显变化。

结论：有底物和酶同时存在的情况下才发生反应。

2. 多酚氧化酶的化学性质（按表2加入各试剂）加入各试剂后混匀37℃保温10min现象：1号试管变成深褐色，2号试管颜色无明显变化。

结论：5%三氯乙酸很明显的降低了多酚氧化酶的活性，为抑制剂。

3. 底物的专一性（按表3加入各试剂）1 2 31 21 21 21 21 2 3加入各试剂后混匀37℃保温9min现象：1号试管变成深褐色，2号试管无明显变化。

结论：多酚氧化酶对邻二苯酚有专一性。

4.底物浓度的影响（按表4加入各试剂）1 2 3 1 2 3加入各试剂后混匀37℃保温1min现象：三个试管颜色颜色发生不同程度加深。

1号试管颜色最浅，其次是2号，3号试管颜色最深。

结论：底物浓度的大小影响多酚氧化酶的催化速率，底物浓度越高，催化速率越快。

5.酶浓度的影响（按表5加入各试剂）1 2 1 2加入各试剂后混匀37℃保温2min现象：1号试管褐色比2号试管深结论：酶底物浓度的大小影响多酚氧化酶的催化速率，在一定范围内，酶浓度越大，催化速率越大6.氢离子浓度的影响1 2 3 4 5 1 2 3 4 5加入各试剂后混匀37℃保温5min注释：1、2、3、4、5号管的pH分别为1、3、5、7、9现象：1、2、3号试管，颜色依次加深，4号试管颜色最深，5号试管次之。

马铃薯多酚氧化酶实验报告引言多酚氧化酶是一种重要的酶类，在生物和食品科学中具有广泛的应用。

本实验旨在通过提取和测定马铃薯中的多酚氧化酶活性，了解其催化多酚氧化反应的能力及其在食品保存和生物研究领域的应用潜力。

实验材料与方法材料•马铃薯•磷酸缓冲液•酚酞溶液•过氧化氢溶液•乙酸溶液•乙醇方法1.马铃薯的制备–将新鲜马铃薯洗净，去皮，切成小块。

–将切好的马铃薯放入磷酸缓冲液中，浸泡30分钟，以去除马铃薯中的酚类物质。

–用纱布滤去马铃薯块，收集滤液。

2.多酚氧化酶的提取–将马铃薯滤液转移至离心管中，离心10分钟，收集上清液。

–将上清液与酚酞溶液混合，放置一段时间，观察颜色的变化。

3.多酚氧化酶活性的测定–准备一系列含有不同浓度的过氧化氢溶液。

–将多酚氧化酶提取液与过氧化氢溶液混合，反应一定时间。

–加入乙酸溶液终止反应。

–通过比色法测定溶液的吸光度，得到不同浓度下的吸光度值。

4.数据处理–根据浓度-吸光度曲线，计算出不同浓度下的多酚氧化酶活性。

结果与讨论通过实验，我们成功提取了马铃薯中的多酚氧化酶，并测定了其活性。

观察到酚酞溶液颜色的变化，可以初步判断多酚氧化酶的存在。

根据多酚氧化酶与过氧化氢的反应，我们测得不同浓度下的吸光度值，并通过比色法计算出多酚氧化酶的活性。

多酚氧化酶在食品保存和生物研究中有着重要的应用。

在食品保存中，多酚氧化酶能够催化食品中的多酚类物质氧化，减少食品腐败的可能性，延长食品的保质期。

在生物研究中，多酚氧化酶可用于测定生物样品中的多酚含量，评估抗氧化能力，并参与一系列生物代谢反应。

然而，本实验并未对多酚氧化酶的酶学性质进行深入研究，也未对其在食品保存和生物研究中的应用进行具体探讨。

进一步的研究可以包括多酚氧化酶的底物特异性、反应条件的优化以及其在不同食品和生物样品中的活性测定。

结论通过本实验，我们成功提取了马铃薯中的多酚氧化酶，并测定了其活性。

多酚氧化酶在食品保存和生物研究中具有广泛的应用潜力。

马铃薯多酚氧化酶的分离纯化及酶学特性研究作者：洪丽萍汪文华何恩铭张文惠来源：《福建农业科技》2023年第12期洪丽萍，汪文华，何恩铭，等.马铃薯多酚氧化酶的分离纯化及酶学特性研究［J］.福建农业科技，2023，54（12）：54-61.收稿日期：2023-11-02作者简介：洪丽萍，女，1969年生，助理研究员，主要从事植物生理及农产品保鲜研究。

*通信作者：汪文华，男，1985年生，副研究员，主要从事植物逆境生理研究（E-mail：**********************）。

基金项目：厦门市重大科技计划项目（3502Z20211004）；厦门市科技扶贫项目（3502Z20194509、3502Z20204504-2、3502Z20204501-3）。

摘要：为控制马铃薯在贮藏和加工过程发生的酶促褐变，对马铃薯多酚氧化酶进行分离纯化，并研究其酶学特性。

采用缓冲液提取、低温离心得到马铃薯多酚氧化酶（PPO）粗酶液，粗酶液经硫酸铵分级盐析、Sephadex G-25分子凝胶柱层析脱盐处理、DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换柱层析和Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析分离纯化得到马铃薯PPO，进一步对其部分酶学特性进行研究。

结果显示：纯化后的马铃薯PPO其比活力为 283.0 U·mg-1，回收率为16.8% ，纯化倍数为18.6倍；该酶最适反应温度为30℃，最适反应pH为6.5；以邻苯二酚为底物时，最适底物浓度为50 mmol·L-1。

该酶对焦性没食子酸、间苯二酚的底物亲和性较强，对4-甲基儿茶酚、咖啡酸、没食子酸、对苯二酚、邻苯二酚、绿原酸的底物亲和性较低，对N-BOC-酪胺、愈创木酚亲和性很低。

关键词：马铃薯；多酚氧化酶；纯化；酶学特性中图分类号：S 532 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2023）12-0054-08DOI： 10.13651/ki.fjnykj.2023.12.008Study on the Separation and Purification of Polyphenol Oxidase from Potatoand Its Enzymatic PropertiesHONG Li-ping， WANG Wen-hua*， HE En-ming， ZHANG Wen-hui（Fujian Key Laboratory of Subtropical Plant Physiology and Biochemistry， Fujian Institute ofSubtropical Botany， Xiamen， Fujian 361006， China）Abstract： In order to control the enzymatic browning of potato during the storage and processing， the potato polyphenol oxidase was isolated and purified， and its enzymatic properties were studied. The crude enzyme fluid of potato polyphenol oxidase （PPO） was obtained by the extraction of buffer solution and centrifugation at low temperature. Then， the crude enzyme fluid was separated and purified through the ammonium sulfate salt fractionation， Sephadex G-25 molecular gel column chromatography desalination treatment， DEAE Sepharose Fast Flow anion exchange column chromatography and Sephadex G-75 molecular sieve gel filtration chromatography to obtain the potato polyphenol oxidase， and some of its enzymatic properties were further studied. The results showed that： the specific activity of purified PPO was 283.0 U·mg-1， the recovery rate was 16.8%， and the purification fold was 18.6 times. The optimum reaction temperature and pH of the enzyme were 30℃ and 6.5， respectively. When catechol was used as the substrate， the optimal concentration of substrate was 50 mmol·L-1. The enzyme had strong substrate affinity for pyrogallic acid and resorcinol， and had low substrate affinity for 4-methylcatechol， caffeic acid， gallic acid， hydroquinone， catechol and chlorogenic acid， while having low affinity for N-BOC-tyramine and guaiacol.Key words： Potato； Polyphenol oxidase； Purification； Enzymatic properties马铃薯Solanum tuberosum L.是除小麦、大米和玉米之外，世界上消费量最大的食物之一，含有丰富的碳水化合物、膳食纤维、类胡萝卜素、花青素和微量营养素（如维生素C、维生素B6、钾、叶酸、铁、硫胺、核黄素和烟酸），生产周期相对较短且产量很高，可以用各种方式烹饪用于不同的菜肴，如土豆泥、土豆面包、薯条、土豆片和土豆沙拉等，深受消费者喜爱。