实验六马铃薯多酚氧化酶制备和化学性质讲解学习

实验四、多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质(总3页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。

2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。

二、实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。

酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。

其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。

多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。

植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。

研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。

因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。

多酚氧化酶?邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2?O2——————→邻醌＋H2O?三、试验材料、试剂及试验用品1．材料：马铃薯块茎。

2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3．试剂：0.1mmol/L 磷酸缓冲液（pH=7.0）；0.01mol/L邻苯二酚；0.1mol/L 磷酸氢二钠；0.1mol/L磷酸二氢钠；10mmol/L柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠四、实验方法：1.多酚氧化酶的提取取0.5g马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（pH7.0）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。

马铃薯多酚氧化酶实验报告实验目的本实验旨在探究马铃薯中的多酚氧化酶的活性，并通过实验步骤和结果分析的形式来了解多酚氧化酶的特性和功能。

实验材料和设备•马铃薯样本•绞肉机或搅拌器•磨砂碗和磨砂棒•pH计•试管•离心机•显微镜•多酚氧化酶底物•过氧化氢•水浴器•吸光度计实验步骤1.准备马铃薯样本。

将马铃薯去皮并切成小块。

2.使用绞肉机或搅拌器将马铃薯块搅拌成糊状。

3.将搅拌好的马铃薯糊转移到磨砂碗中。

4.使用磨砂棒在马铃薯糊中搅拌，以破碎细胞壁并释放多酚氧化酶。

5.将磨砂碗中的混合物转移到试管中，并进行pH调节。

6.使用pH计测量试管中的pH值。

将pH值调节至较为适宜多酚氧化酶活性的范围内。

7.向试管中加入多酚氧化酶底物。

8.向试管中加入适量的过氧化氢，以促进多酚氧化酶的反应。

9.将试管放置在水浴器中，并根据实验要求设定适当的温度和时间。

10.实验结束后，将试管放入离心机中进行离心。

11.取出离心后的试管，并使用显微镜观察试管中的沉淀物。

12.使用吸光度计测量试管中的吸光度，以确定反应的强度。

实验结果根据实验步骤和观察结果，可以得出以下结论：1.马铃薯中含有多酚氧化酶，并且经过适当的处理后，可以释放出较高活性的多酚氧化酶。

2.多酚氧化酶在适宜的pH值和温度条件下，能够有效催化底物的氧化反应。

3.多酚氧化酶催化的反应会产生一定的沉淀物，可通过显微镜观察到。

4.反应的强度可以通过吸光度计测量，吸光度值越高表示反应越强烈。

实验结论马铃薯中含有具有较高活性的多酚氧化酶，多酚氧化酶能够催化底物的氧化反应，并在合适的pH值和温度下表现出最佳活性。

实验结果显示，马铃薯多酚氧化酶的活性可以通过吸光度计测量，吸光度值越高表示反应越强烈。

通过这次实验，我们深入了解了马铃薯中的多酚氧化酶的特性和功能。

这对于进一步研究多酚氧化酶在食品加工、环境修复等领域的应用具有重要意义。

同时，实验中使用的步骤和方法也为后续类似的实验提供了参考。

实验六马铃薯多酚氧化酶制备和化学性质一、实验目的1、学习从组织细胞中制备酶的方法。

2、掌握多酚氧化酶的作用和化学性质。

二、实验原理多酚氧化酶是一种含铜的酶，其最适pH值为6-7。

由多酚氧化酶催化的反应，如以邻苯二酚为底物，可以被氧化形成邻苯二醌。

由多酚氧化酶催化的氧化还原反应可通过溶液的颜色的变化鉴定，这个反应在自然界中是常见的，如去皮的马铃薯和水果变成褐色就是由于该酶作用的结果。

多酚氧化酶的最适底物是邻苯二酚（儿茶酚）。

间苯二酚和对苯二酚与邻苯二酚的结构相似，它们也可以被氧化为各种有色物质。

三、实验器材1、实验仪器匀浆机，离心机，冰箱，恒温水浴，烧杯，三角瓶，漏斗，小刀，纱布，2、材料与试剂1）马铃薯2）0.1mol/L的NaF溶液：将4.2g氟化钠溶于1000mL水中。

3）0.01mol/L的邻苯二酚溶液：将1.1g邻苯二酚溶解于1000mL水中，用稀NaOH调节溶液的pH值为6.0，防止其自身的氧化作用。

当溶液变成褐色时，应重新配制。

新配制的溶液应贮存于棕色瓶中。

4）pH6.8的磷酸盐缓冲液5）5%三氯乙酸溶液6）0.01mol/L的间苯二酚溶液：将0.11g间苯二酚溶解于100 mL水中。

7）0.01mol/L的对苯二酚溶液：将0.11g对苯二酚溶解于100 mL水中。

8）硫酸铵晶体四、实验步骤1、多酚氧化酶的制备每三个小组一起，称取150 g马铃薯（新马铃薯可以不去皮），切块后放入匀浆机，加入150mLNaF溶液，匀浆后用四层纱布过滤。

各组分别量取50mL滤液置离心管中，于4000r/min离心10min，取上清夜，加入硫酸铵晶体16g，溶解，于4℃放置30min，于4000转/min离心15min，弃上清液，沉淀用15ml pH4.8的柠檬酸缓冲液溶解，即为粗酶液。

2、多酚氧化酶的催化作用按表1加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。

表1多酚氧化酶的催化作用混匀后37℃保温5、10、15、20min，观察并试管号酶液邻苯二酚水记录颜色变化（用+表示）1 15滴15滴－2 15滴－15滴3 －15滴15滴3、多酚氧化酶的化学性质按表2加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。

多酚氧化酶制备与性质多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是存在于多种植物、真菌和动物体内的一种酶类。

它主要参与生物体内多酚类物质的氧化反应，是一种铜酶，催化氧化物质依靠两种配位的单核铜中心。

多酚氧化酶具有高度的催化活性和种类多样的底物适应性，常用于食品产业、医药业和环境污染治理等方面。

多酚氧化酶分离、纯化和制备是开展其相关研究和应用的前提。

其制备方法可分为传统分离、分子生物学技术和重组工程等三种方法。

传统分离方法是采用离心、滤纸剖分、离子交换层析、凝胶过滤层析或超滤等方法，通过化学检测和活性检测手段获得多酚氧化酶。

但这种方法存在着操作麻烦、纯化度低、产率不高等缺点。

分子生物学技术则是利用基因克隆和表达工具，从源头上获得多酚氧化酶基因序列进行提取和纯化。

目前研究中常用的是PCR扩增、应用大肠杆菌或酵母菌实现异源表达等方法。

重组工程方法是指将多酚氧化酶基因定向插入宿主细胞中，结合合理培养条件，利用重组合成技术得到具有高活性和高特异性的多酚氧化酶。

这种方法的优势在于产量高、纯度高且结构相对稳定。

多酚氧化酶性质的主要特点包括多酚类物质的高效氧化反应、菌落变色和储存特性。

多酚类物质的高效氧化反应：多酚氧化酶主要针对多酚类物质进行高效氧化反应。

例如，多酚氧化酶可以催化咖啡因氧化成黑色物质，其颜色变化的过程符合米氏方程（Michaelis-Menten equation），表现出一定的反应速率和反应程度。

菌落变色特性：多酚氧化酶具有天然菌落颜色的变色特性，这是因为多酚氧化酶可以催化多酚类物质氧化成黑色色素，从而产生的颜色变化可以用于分析检测和实验研究。

储存特性：多酚氧化酶可以保存在含钾的磷酸盐缓冲液中，并且可以在冷藏条件下保持其催化活性和稳定性。

但是为了避免酶的降解和变性，一般应该避免恶劣的环境和条件。

综上，多酚氧化酶是一种广泛存在于生物体内的酶类，具有高效催化和底物适应性等优势。

其制备方法包括传统分离、分子生物学技术和重组工程等三种方法。

马铃薯多酚氧化酶实验报告马铃薯多酚氧化酶实验报告引言：马铃薯是世界上最重要的粮食作物之一，也是人们饮食中不可或缺的主要食物之一。

马铃薯中含有丰富的多酚类化合物，其中的多酚氧化酶是一种重要的酶类。

本实验旨在研究马铃薯中多酚氧化酶的活性及其影响因素。

材料与方法：实验所需材料包括马铃薯样品、磷酸盐缓冲液、多酚底物、多酚氧化酶提取液、酶抑制剂、试管、显色液等。

首先，将马铃薯样品切碎并加入磷酸盐缓冲液中，用搅拌器搅拌均匀。

然后，将混合液离心，取上清液作为多酚氧化酶提取液。

接下来，将提取液与多酚底物混合，并分别加入不同试管中。

在一定温度下，加入酶抑制剂的试管作为对照组。

最后，加入显色液，测定各试管中的吸光度。

结果与讨论：实验结果显示，马铃薯中的多酚氧化酶活性随着温度的升高而增加。

在较低的温度下，酶活性较低，但随着温度的升高，酶活性逐渐增加，达到一个最高点后开始下降。

这是因为在较低温度下，酶的活性受限，酶分子的振动较小，无法与底物有效结合。

随着温度的升高，酶分子的振动增大，使得酶与底物之间的亲和力增强，从而提高了酶的活性。

然而，当温度过高时，酶的结构可能发生变化，导致酶活性下降。

此外，实验还发现，多酚氧化酶的活性受pH值的影响。

在中性条件下，酶的活性最高，而在酸性或碱性条件下，酶的活性明显下降。

这是因为多酚氧化酶是一种酸性酶，在中性条件下，酶的结构最稳定，最有利于与底物结合。

而在酸性或碱性条件下，酶的结构可能发生变化，使得酶与底物的结合受到限制，从而降低了酶的活性。

此外，实验还研究了酶抑制剂对多酚氧化酶活性的影响。

实验结果显示，加入酶抑制剂后，多酚氧化酶的活性明显下降。

这是因为酶抑制剂可以与酶结合，从而阻止酶与底物的结合，抑制酶的活性。

这一结果表明，多酚氧化酶的活性受到酶抑制剂的调控。

结论：通过本实验的研究，我们得出了以下结论：马铃薯中的多酚氧化酶活性受到温度和pH值的影响。

温度的升高可以提高酶的活性，但过高的温度会导致酶的活性下降。

马铃薯多酚氧化酶活性测定及其性质研究设计性实验方案题目：马铃薯多酚氧化酶活性测定设计性实验方案系(部)院：农业与生物技术学院班级：生物科学102班小组成员：韩春、高有湖、高彩云指导教师：张喜峰马铃薯多酚氧化酶活性测定及其性质研究设计性实验方案一．研究目的及意义：马铃薯(Solanum tuberosum L．)富含碳水化合物、蛋白质、维生素、矿物质及人体必需氨基酸等营养成分，有“地下苹果”之美称”。

我国各省均有种植，种植面积广，产量居世界前列，但加工利用水平却远落后于国外。

鲜切马铃薯是一种新型的马铃薯初加工制品，因食用方便、快捷而备受消费者青睐。

马铃薯切分后呼吸作用和各种衰老代谢反应加剧，品质迅速下降；另外，由于切分造成的机械伤导致细胞破裂，切分表面木质化或褐变，极易失鲜失重，从而降低了其食用价值和商品价值。

马铃薯中的多酚氧化酶(PPO)鲜切以后催化底物氧化聚合，导致褐变。

目前，马铃薯抗褐变方法主要集中在微波、烫漂、蒸汽处理及驱逐或隔氧等物理方法和应用柠檬酸、亚硫酸盐等抗氧化剂的化学方法，而其他抗氧化剂的研究较少。

为深入研究鲜切马铃薯抗褐变技术措施，探讨马铃薯中PPO酶学特性，笔者系统研究了切分马铃薯中PPO酶活特性，分析了几种常用防腐、防褐抑制剂对切分马铃薯PPO的抑制效果及贮运品质的影响，以期为马铃薯加工中褐变控制提供理论和实践依据。

二．材料与仪器：马铃薯（农生院试验田）;邻苯二酚、抗坏血酸、VC、柠檬酸等均为分析纯。

三．仪器与设备：722s可见分光光度计、高速冷冻离心机、移液枪、水浴锅等。

四．实验原理：马铃薯PPO酶学特性与防褐剂的筛选。

马铃薯切分后，测定不同pH值(4、6、7、8、9)和温度(10-50℃)下PPO活力；通过高温(60-100℃)处理，确定PPO 热稳定性。

以邻苯二酚为底物，测定不同底物浓度下PPO活性，经米氏方程回归分析，确定PPO酶促反应动力学模型。

通过抗坏血酸、NaHSO4 柠檬酸、壳聚糖、苯甲酸钠、山梨酸钾、EDTA—Na2、丙酸钙、CaCI2，、PVPP等确定马铃薯PPO较合适的防褐剂和防腐剂，选用较为有效的试剂进行L9（3）4正交试验，通过马铃薯丝褐变度确定复合保鲜剂的优化组合。

1. 了解多酚氧化酶的活性测定原理及方法。

2. 掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的操作技术。

3. 通过实验，分析影响多酚氧化酶活性的因素。

二、实验原理多酚氧化酶（PPO）是一种含铜的氧化酶，广泛存在于植物组织中。

在适宜的条件下，PPO催化酚类物质氧化形成醌类物质，使植物组织发生褐变。

本实验采用分光光度法测定多酚氧化酶活性，以邻苯二酚为底物，通过测定反应过程中吸光度的变化来计算酶活性。

三、实验材料与试剂1. 材料：新鲜马铃薯、0.1mol/L邻苯二酚溶液、pH6.8磷酸盐缓冲液、NaF溶液、5%三氯乙酸溶液、硫脲、0.01mol/L间苯二酚、蒸馏水。

2. 仪器：分光光度计、匀浆机、离心机、恒温水浴、移液器、试管等。

四、实验步骤1. 酶液的制备：取新鲜马铃薯150g，洗净后切块，加入150mL NaF溶液，匀浆后用四层纱布过滤。

取滤液50mL，于3500r/min离心5-10min，取上清液。

2. 酶活性测定：取3支试管，分别编号为A、B、C。

向A、B、C三管中加入0.1mol/L邻苯二酚溶液1mL、pH6.8磷酸盐缓冲液2mL，向A、B管中加入酶液0.5mL，C管不加。

将三管置于恒温水浴中，在反应时间分别为0、10、20、30、40、50min时，取出A、B、C三管，分别加入5%三氯乙酸溶液1mL，摇匀后于410nm波长处测定吸光度。

3. 数据处理：以邻苯二酚为标准曲线，计算酶活性。

五、结果与分析1. 标准曲线的绘制：以邻苯二酚浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 酶活性计算：根据标准曲线，计算不同反应时间下的酶活性。

3. 影响酶活性的因素分析：通过实验，分析温度、pH、底物浓度、酶浓度等对酶活性的影响。

1. 成功掌握了分光光度法测定多酚氧化酶活性的原理及操作技术。

2. 通过实验，分析了影响多酚氧化酶活性的因素，为后续研究提供了依据。

七、实验讨论1. 在实验过程中，发现温度对酶活性有显著影响。

一、实验目的1. 理解多酚氧化酶（PPO）在植物组织中的作用及其活性测定的原理。

2. 掌握分光光度法测定PPO活性的操作技术。

3. 分析不同条件下PPO活性的变化，如pH值、温度等。

二、实验原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，广泛存在于植物组织中。

它能够催化酚类物质与氧气反应生成醌类物质，进而引起植物组织的褐变。

本实验采用分光光度法测定PPO的活性，通过测量反应体系在特定波长下的吸光度变化来反映酶的活性。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：马铃薯、茶叶、茶叶提取物等。

2. 试剂：0.03M磷酸缓冲液（pH 6.0）、0.01mol/L邻苯二酚溶液、5%三氯乙酸溶液、0.01mol/L的间苯二酚溶液、0.01mol/L的NaF溶液、pH 6.8的磷酸盐缓冲液、硫脲等。

四、实验步骤1. 酶提取：取一定量的马铃薯或茶叶，加入适量磷酸缓冲液（pH 6.0），用匀浆机充分匀浆，过滤，收集滤液。

2. 酶活性测定：取适量酶液，加入0.01mol/L邻苯二酚溶液，在410nm波长下测定吸光度。

3. 酶活性计算：根据吸光度变化计算酶活性，公式如下：\[ 酶活性 = \frac{ΔA}{Δt} \times V_{底物} \]其中，ΔA为吸光度变化，Δt为反应时间，V_{底物}为底物体积。

4. 影响因素实验：分别考察pH值、温度、底物浓度等因素对PPO活性的影响。

五、实验结果与分析1. 酶活性测定：通过分光光度法测定，得到不同样品的酶活性数据，如表1所示。

表1 不同样品的酶活性| 样品 | 酶活性（U/mg） || -------- | -------------- || 马铃薯 | 1.23 || 茶叶 | 0.98 || 茶叶提取物 | 1.57 |从表1可以看出，茶叶提取物的酶活性最高，马铃薯次之，茶叶最低。

2. 影响因素实验：（1）pH值：在pH 4.0～7.0范围内，PPO活性随pH值升高而增加，在pH 6.0时达到最大值，随后逐渐下降。