分子标记在果树上的应用及前景展望

分子标记在果树上的应用及前景展望分子标记指可遗传并可检测到的DNA序列或蛋白质。

蛋白质标记主要是指同工酶、等位酶、贮藏蛋白等等，本文主要介绍DNA标记。

理想的分子标记应具有以下几个条件：①以孟德尔方式遗传。

②多态性好，自然条件下存在许多变异位点。

③遍布整个基因组，能够检测到整个基因组的变异。

④共显性遗传，即可以区别纯合体和杂合体。

⑤表现“中性”，即不影响目标性状的表达。

⑥重复性好，便于资源共享。

⑦自动化程度高。

近年来，关于分子标记的研究进展很快，本文仅就分子标记在果树研究中的应用及存在问题做一介绍，并对应用前景做一展望。

一、分子标记在果树研究中的应用：1.分子标记在种质资源研究中的应用。

（1）系谱分析和分类。

物种在进化过程中，其DNA是一个渐变的过程。

遗传关系越近，基因组DNA的差异越小，反之，差异越大。

HARADAT等用RAPD标记对两个三倍体苹果品种“乔纳金”和“陆奥”进行了分析，结果表明，作为母本的金冠提供了减数的二倍体配子。

沈向等对杏进行了RAPD分析，将41个品种分为5类。

（2）种质保存和核心种质的建立。

如何事理有效地管理和利用种质资源，当今世界出现了两种趋势，其中之一就是建立核心种质。

目的是以最少的种质样品重复而最大地包含一个种及其野生种的遗传多样性。

分子标记为人们提供了一个有效、快速的途径。

目前已建立的核心种质涉及到谷物、豆类、牧草、蔬菜和果树等。

AMY K SZEWC-MCFADDEN等用SSR结合园艺性状建立了苹果的核心种质，HOKANSON等也建立了苹果核心种质。

（3）构建指纹图谱和品种鉴别。

高质量的指纹图谱可作为新品种登记、注册和产权保护的重要依据。

特别是对于无性繁殖的果树来说，同物异名、同名异物现象很严重，利用分子标忘本中高效、准确地建立指纹图谱、鉴别果树品种。

张潞生利用AFLPs建立了清晰的狒猴桃的指纹图谱，宋婉建立了枣优良品种的DNA指纹图谱。

祝军对苹果进行了AFLP分析，得到了苹果的DNA指纹图谱，刘孟军对枣和酸枣进行了FRAPD分析，将亲缘关系极近的金丝小枣和无核小枣区分开。

（4）体细胞杂种和外源基因渗入的鉴定。

利用分子标记可在试管苗期快速、准确地对体细胞杂种进行鉴定。

史永忠对柑橘进行了体细胞杂种鉴定，认为体细胞杂种表现为双亲谱带之和。

另外，珠心胚现象使柑橘合子苗与珠心苗在苗期很难鉴别，严重阴碍柑橘的杂交育种，LURO对柠檬的实生后代RAPD分析指出，杂交合子苗由于有外源基因的渗入，谱带比珠心苗多。

2.构建分子遗传图谱。

在人类基因组计划的推动下，新西兰和欧洲的两个“苹果基因组”计划已经启动，同时美国、欧洲也启动了李属植物的基因组作图工程。

目前已经建立或初步建立了基因组图谱（险人类基因组图谱为物理图谱外，最近中科院基因研究中心构建了高分辨率的水稻基因组物理图谱，其它绝大多数为遗传连锁图谱）的果树有苹果、桃、樱桃、扁桃、核桃、草莓、葡萄、柑橘、香蕉等十几种。

建立遗传连锁图谱，首先要有一个作图群体。

作图的群体主要有F2、"F3、"BC等。

除此之外，单倍体也可应用于果树基因组作图。

“单模标本”策略最初来源于对人的精子的研究，后来用于对针叶松(用大配子群体)和斑马鱼的胚胎研究上。

STOCKINGER等以孢子来源的愈伤培养群体为试材，做了甜樱桃的遗传连锁图谱。

他认为，以单倍体为试材，大多数随机引物扩增中不能标记的杂和位点不会发生，可以促进连锁图谱的建立。

陈洪、李平等利用双单倍体(DH)进行水稻基因组作图，指出：F2代或BC1群体，不能通过种子传代维持，所以难以进一步发展已建成的图谱，而DH株系为一个永久性的作图群体，而且RAPD特别适于DH群体作图。

HEMMAT M等针对苹果和其他异型杂交的物种，因无性繁殖而且种内杂交受抑以至于很难有可利用的自交或回交群体用于作图这一事实，提出了“双假测交”(Double pseudotestcross)的构想。

“双假测交”设想最初应用于同工酶上，HEMMAT将之扩展至RFLP和RAPD技术，利用苹果“Rome Beauty”与“White Angel”杂交，获得F1代，为父、母本分别作图，获得两张遗传连锁图谱。

PATRICK J C等利用“双假测交”的构想做了三张连锁图谱，其中“WijcikMclntosh”的图谱包括238标记，分布于19个连锁群，覆盖基因组1206cM；“NY75441—67”的图谱有110个标记，分布于16个连锁群，“NY75441—58”的图谱有183个标记，分布于18个连锁群。

主要为RAPD标记，另外还有6个同工酶标记，4个形态学标记(Rf：果皮颜色；Vf：黑星病；Co：柱状生长习性；Ma：苹果酸)，标记之间的平均距离为5．"0cM。

作图群体确定后，采用分子标记对作图群体进行分析。

对于获得的标记进行“适合性测验”，不符合孟德尔遗传的标记不能用于作图。

刘孟军以苹果为试材研究了种间杂交一代的分离方式，结果表明有8．"0％的标记偏离孟德尔分离比例，1．"5％的标记属异常分离(双亲有而后代没有的标记或隔代遗传的标记)。

类似的结果在桃、核桃上也有报道，这种分离异常的原因可能与受粉、受精异常有关，另一解释是群体太小或取样有误差。

所以作图群体一般为50～200个。

“双假测交”构想中，对于父本表现为杂合而对母本表现为纯合隐性的标记用于父本作图，对于母本表现为杂合而对父本表现为纯合隐性的标记用于母本作图。

对于父、母本均表现为杂合的标记可用以确定双亲连锁图中的同源连锁群。

对于以共显性RFLP和等位酶为作图手段时，符合1∶2∶1和1∶1分离比例的标记用于作图以RAPD为作图手段时，符合3∶1和1∶1分离比例的标记用于作图。

用RAPD技术以单倍体群体为作图群体时，符合1∶1或1∶2或2∶1的分离比例，标记用于作图。

因为较高比值的标记可能是由于分离异常或非连锁片段的共迁移而形成的，所以不作为可遗传的标记，对于只在一亲本中为杂合而在另一亲本为纯合的位点，其F1代按1∶1分离，此时RAPD能提供与共显性标记RFLP一样的信息量。

采用的标记种类对作图有一定影响，POWELL等提出了MI(Marker index)值的概念，指每个反应的多态性产物的数量。

即MI值越大，多态性越好。

就MI值而言，几种分子标记按MI值由大到小依次为AFLPs、SSRs、RAPDs、RFLPs。

故此可利用几种分子标记结合起来用于建立高密度的连锁图谱。

3．基因连锁标记的寻找与基因定位。

基因定位是获得有利基因的重要条件，对于大多数果树来说，目前还不能进行准确的基因定位，所以当务之急是寻找与基因连锁紧密的分子标记。

标记目标性状基因，可以用的群体主要有两种：一是利用近等基因系(NIL，near-isogenicline)，二是利用分离群体分组分析(BSA，Bulksegregant analysis)。

近等基因系是指只有目标性状基因有差异，其它性状基因相同的两个群体。

近等基因系是通过不平衡杂交获得的。

所以在果树上是很难获得的。

目前果树上主要是利用BSA法，BSA法的具体做法是：将分离群体中研究的目标性状根据其类型(如抗病、感病)分成两组，将每组内一定数量的植株DNA等量混合，形成两个池，这两个池除在目标性状(抗病性)上有差异外，其余遗传背景均相同。

利用分子标记技术寻找两个池的扩增谱带的差异，这种多态性极可能与目标基因连锁。

再用所有的分离后代单株，验证该多态性是否真正与目标基因连锁及连锁距离的确定。

如果分离群体不易获得，可采取混合样品法。

以抗病性为例，即尽可能地把所有的抗病品种的DNA 等量混合，作为一个基因池；把所有的感病品种的DNA等量混合，作为一个基因池，对两个基因池的DNA多态性进行分析，但是这种方法不能进行遗传距离的计算，彭建营利用混合样品法找出了一个可能与枣无核性状相关的DNA片段。

另外，果树上很多性状为数量性状，对于控制数量性状的QTLs(Quan-titative trait loci)的寻找，分子标记提供了非常方便快捷的方法。

NANDIS等人利用AFLP和选择基因型(Se-lectivegenotyping)，为控制水稻抗涝的QTLs定位。

并指出选择基因型对于QTLs的定位提供了一条快速容易的途径。

选择基因型指在RIL群体中，选择目标性状是两极(如特抗涝、对涝极敏感)的个体来进行DNA多态性分析。

除了选择基因型外，间隔作图(Interval mapping)，后代测定和同时搜寻(Progeny testing andsimul-taneoussearch)，均有利于提高QTLs作图的准确度和效率。

另外，还可以利用已有的连锁图进行标记，一旦发现某一目标基因被定位在某一染色体上，就可以选择分散在染色体不同位点上的标记，进行染色体滑步(Chromosomewalking)，直至找到目标基因。

日前，已在各种果树上找到了与主要性状基因连锁的标记。

4."MAS(Marker-assistedselection)。

MAS是分子标记在育种上的一个重要应用。

当与目标基因相连锁的分子标记和目标基因相距5cM之内时，即可用于MAS。

目前果树上可用做MAS的标记不是很多。

MAS可以跟踪、检测外源基因、进行全基因组选择，辅助选择同效基因的累加，尤其是在抗病性选择上，MAS提供了一个准确、快速的方法。

利用与抗病基因紧密连锁的分子标记，可在无病侵染条件下，进行早期抗病性鉴定，无须后代测定即可进行重叠抗性基因的组建。

有关MAS的效率有人作过研究，指出：用与互斥相(Kepulsion-phase)连锁的标记可提高MAS的效率。

另外以纯合互斥相和互引相的RAPD标记的表现型为基础的个体选择与以共显性的标记(RFLPs)为基础的选择、仅用互斥相标记的选择是相似的。

再有，当用于重组近交系上时，以连锁的RAPD标记为基础的MAS与以RFLP标记为基础的MAS的效率相似，因为重组近交系的杂合水平最小。

虽然MAS在理论上对植物改良有益，但在实践上还未见成功报道。

限制应用的因素主要有以下几个方面：①连锁群中探测到的与目标性状紧密连锁的分子标记位点的数目；②探测低遗传率的数量性状所需群体的大小；③由确定多个分子标记位点的权重而带来的取样误差；④表型信息和获得每单位信息量的费用。

5.杂种优势预测。

杂种优势来源于亲本有利基因的杂合性。

由于在某种程度上，两亲本品系具有与杂种优势有关的DNA区域纯合度较高，其F1代杂种优势就可能越大。

所以可以根据各品系在这些可能与杂种优势有关的DNA区域上的多态性，构建杂种优势群，指导杂交组合的选配和杂种优势的分析和预测。

ZHANG等用RFLP和SSR标记对水稻的杂种优势作了双列分析，在果树上尚未见有这方面的报道。