2002年12月韶关学院学报(自然科学版)Dec.2002第23卷 第12期Journal of Shaoguan University(Natural Science)Vol.23 No.12分子标记及其在作物育种上的应用李海渤(韶关学院英东生物工程学院,广东韶关512005)摘要:分子标记是随着遗传学的发展而诞生的一种基于DNA多态性的遗传标记.主要综述了几种分子标记的基本原理及其在作物育种上的应用,实践证明,分子标记技术为作物育种提供了一种新的研究手段,必将在作物育种领域开拓广阔的应用前景.关键词:分子标记;作物育种;DNA多态性中图分类号:Q341 文献标识码:A 文章编号:1007-5348(2002)12-0100-07作物育种的目标之一是改良现有品种、创造新品种,使之更符合人类生产和生活需要.早期的良种选育工作主要是凭感官对当时所需要的性状进行选择,如植株的高矮、籽粒的饱满度、植株的抗性等.经过这种途径,虽然创造了一些具有优良性状的品种,但这种育种方式尚处于感性和经验性阶段,具有一定的盲目性和机遇性.随着遗传学的发展,遗传标记经历了形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记等几个阶段.在此过程中,育种家们试图利用遗传标记指导作物育种过程中的亲本选配和后代目标性状的选择,然而由于技术水平的限制,最初的遗传标记对指导育种工作带有局限性,实用性有限.分子标记的出现与发展,为作物育种注入了前所未有的活力,分子标记在作物育种上得到广泛的应用.1 分子标记的类型分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记.其特点是直接以DNA的形式存在;标记数量无限,遍布于整个染色体组;标记位点非常丰富;性状稳定,不受环境条件影响;许多标记是共显性标记,因而从它诞生的一开始就展示了极大的生命力.分子标记可根据不同的研究手段分为如下类型:111 RFL P(Restriction Fragment Length Polymorphism)标记1980年,Bostein提出了RFL P标记方法.其基本原理是由于DNA序列不同,或DNA序列发生插入、缺失、易位等结构变化,从而造成限制性内切酶的酶切位点发生改变,当基因组DNA与限制性内切酶相互作用后,便会产生不同长度的限制性片段,再通过电泳、转膜,然后用放射性标记的同源DNA片段作为探针与其杂交,经放射自显影来检测样品之间的差异.RFL P标记的优点是不受环境条件和发育阶段的影响;无表型效应;在等位基因之间收稿日期:2002-09-11作者简介:李海渤(1973-),男,河北唐山人,韶关学院英东生物工程学院助教,硕士,主要从事作物遗传育种研究.一般表现为共显性;结果稳定、重复性好.缺陷是该技术对DNA 要求量较大;要求纯度较高;运用同位素标记对人体有害;所花费的人力、物力较大.该技术广泛应用于生物的遗传作图、基因定位、种质资源评估、分子标记辅助选择等方面.112 RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA )标记该标记是由Williams 等和Welsh 等在PCR 技术基础上发展起来的一种分子标记[1,2].其原理是采用人工合成的10个碱基的寡聚核苷酸作为随机引物,以基因组DNA 为模板,在94℃左右变性后,在较低温度下分别与DNA 的两条单链发生退火反应,在DNA 聚合酶的作用下对基因组特定的DNA 区域进行反复扩增,最后通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的差异.造成RAPD 谱带差异的原因可能是:核苷酸置换造成引物无法与结合位点匹配;结合位点的缺失;结合位点间大片段的插入造成扩增中断;由于插入或缺失突变使扩增产物大小发生改变.RAPD 技术的优点是自动化程度高;费用低;无放射性污染;信息量较大及简便快速等.其缺陷是不十分稳定;重复性较差;对反应条件比较敏感.该技术现已广泛应用于遗传多样性分析、物种进化、品种鉴定、分类等研究领域.113 SSRs (Simple Sequence Repeats )技术生物体基因组中,普遍存在1～4个碱基组成的简单重复序列,其重复次数可达百次以上,且重复次数变化很大,但在该重复序列两端的序列却是高度保守的.SSRs 技术就是利用其两侧保守序列设计一对引物,再利用PCR 技术对每个位点的微卫星序列进行特异扩增,再经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物,便可确定该物种扩增片段的多态性[3].该技术的特点是需DNA 量较少;为共显性标记;显示的带型简单、客观明确.现在该技术被广泛应用于遗传图谱的构建、种质资源的鉴定、遗传多样性评估等方面.114 AFL P (Amplified Frangement Length Polymorphism )标记该技术是Vos 等于1992年发明的一种选择性扩增DNA 片段的方法[4],其基本原理是某生物基因组DNA 在两种具有不同酶切位点的限制性内切酶作用下,产生大小不同的酶切片段;再在这些片段的两端接上已知序列的接头,最后再利用根据接头序列设计的特异引物对双酶切片段进行选择性地扩增,最后通过电泳、染色,分析条带差异.AFL P 技术结合了RFL P 和PCR 的优点,具有多态性丰富、稳定性好和重复性高的特点,被广泛地应用于基因定位、基因作图、鉴定亲缘关系等领域.115 STS (Sequence -tagged Sites )标记STS 标记是由一段长为200-500bp 的序列所界定的位点,它在基因组中只出现一次.前述任何单拷贝的多态性标记都可以作为基因组的界标转变为STS 标记,转变的前提是测定长度适合的单拷贝片段两端的序列,并据其设计一对专一扩增的引物(长度为20个核苷酸左右),经PCR 途径显示STS 的特异片断[5].STS 标记的优点在于其共显性的遗传方式,因而很容易在不同组合的遗传图谱间进行转移.2 分子标记在作物育种中的应用・101・第12期李海渤:分子标记及其在作物育种上的应用由于分子标记所表现出的极大的优越性,所以在作物育种中得到广泛的应用,主要表现在以下几个方面:211 亲缘关系与种质资源多样性的研究研究物种的亲缘关系以及种质资源的多样性对作物育种有着重要的指导意义.然而,由于作物易受生长环境及发育阶段的影响,因而仅凭作物的形态学特征来研究其亲缘关系及多样性易受主观因素的影响,结果可靠性较低.分子标记所代表的是基因组DNA 水平上的差异,不受外界环境及作物生长发育阶段的影响,因而利用分子标记研究作物的亲缘关系及多样性,其结果具有客观、稳定的特点.Dires 等采用RFL P 技术对83个甘蓝型油菜品种进行了聚类分析,并将之分为三大类群,即春油菜类群、冬油菜类群及中国—日本油菜类群,该聚类结果与已知系谱大致相符[6];安贤惠通过RAPD 技术,采用31个随机引物分析了72份芥菜型油菜品种的遗传多样性,并将之划分为六大类[7].212 DNA 指纹和种子纯度的鉴定在同一物种的各个品种间存在大量的多态性标记,DNA 指纹就是一些特异DNA 标记的组合.通过DNA 指纹可以进行物种鉴定,不仅克服了根据形态特征鉴定物种的可靠性差的缺点,而且对于品种专利权的申请及保护提供了可靠途径.另外,通过DNA 指纹也可以进行种子纯度的鉴定,这种方法同样克服了根据田间表型性状以及同工酶进行种子纯度鉴定的缺陷,具有快速、准确、简便、成本低的特点,而且在幼苗或种子阶段就可对种子纯度进行鉴定.213 构建分子标记连锁图构建高密度的分子标记连锁图为基因的精细定位、物理图谱的构建和以图谱为基础的基因克隆奠定了条件.利用克隆的基因来转化其他的作物无疑是一种新的育种途径,例如转基因植物.实践证实采用分子标记构建基因连锁图具有很高的实用价值.Cheung 等用RFL P 技术构建了包括343个RFL P 标记的芥菜型油菜的遗传图谱,为辅助选择育种提供了重要的理论参考[8].美国的Cornell 实验室发表了一张水稻的分子标记连锁图,该图谱中有700多个标记,其中绝大部分是RFL P 标记[9].在玉米中已建立了数百个RFL P 标记图谱,而在西红柿中则建立了带有1000个RFL P 标记遗传图谱[9].214 基因定位和数量性状的选择利用不同的分离群体如F2群体、回交群体、DH 群体、重组自交系等可对目的基因进行定位.Jean 等找到了与Pol cms 恢复基因Rfp1紧密连锁的1个RAPD 标记和10个RFL P 标记[10].1998年,他们又用RFL P 标记和RAPD 标记将Pol cms 恢复基因Rf p1定位[11].王俊霞等在860个随机引物中找到了与Pol cms 恢复基因Rf p 连锁的两个RAPD 标记[12].另外,作物的许多经济形状是由数量性状位点(Q TL )所控制的,如产量、品质、水平抗性等.由于这些数量性状的遗传差异是由多个基因座位决定的,每个座位只对表型起较小的作用,由于遗传和环境的互作无法区别单个基因座位的贡献和各个基因座位之间的互作,因而无法对单个Q TL 进行操作.分子标记的产生和发展可把控制数量性状・201・韶关学院学报(自然科学版)2002年的单个Q TL 区分开来,为Q TL 的定位、克隆和选择提供了有力的工具.例如Toroser 等采用RFL P 标记,对甘蓝型油菜硫苷含量控制基因进行了定位,结果将两个主要控制位点GSL -1和GSL -2分别定位于L G20和L G1,三个次要控制位点GSL -3、GSL -4和GSL -5分别定于L G18、L G4和L G13[13].Tanhuanpaa 等采用RAPD 技术对油菜的亚麻酸含量控制基因进行了定位[14].215 利用分子标记进行辅助选择利用分子标记辅助育种可以方便、快速的实现品种之间的目的基因的转移,或将近缘野生种的新基因导入,给传统的育种带来了巨大的活力.利用分子标记辅助选择有以下优点:1)不受时间和环境条件的限制,在作物不同的发育阶段均可进行检测,而性状的传统鉴定方法则需要在某一特定发育阶段进行;2)利用分子标记可以实现优良基因的快速聚合,弥补了传统育种方法的费时、费力以及盲目性高的缺点.作物育种程序中对分子标记辅助选择的要求:1)分子标记与目的性状位点共分离或紧密连锁(1cM 或更小),否则会因标记与目的基因之间的交换而使检测过程中的假阳性频率变得很高;2)分子标记能对大群体进行有效检测,目前基于PCR 的分子标记技术较为容易;3)检测技术在实验室之间应该有很高的重复性,并且较为经济.在实践中,育种工作者采用分子标记辅助选择的途径培育出了一批优良品种.薛庆中等应用与Xa21紧密连锁(遗传距离仅为011cM )的分子标记,通过辅助选择培育出了一批具有Xa21基因的抗白叶枯病恢复系[15].Sheng 等利用分子标记辅助选择的方法将Xa21导入明恢63中,建立了基于分子标记辅助选择的PCR 反应体系,其中两个标记距离Xa21分别为018cM 和310cM.用均匀分布于水稻12条染色体的128个RFL P 标记进行背景选择,证明改良性明恢63除了含Xa21的318cM 片段外与原始材料完全一样[16].Huang 等利用DNA 标记辅助选择将Xa4、Xa5、Xa13、Xa21等4个水稻抗白叶枯病基因进行了聚合,聚合系表现出比单基因系更广的抗谱和更强的抗性[17].216 杂种优势的预测杂种优势利用是品种改良的一条重要途径.育种家们为了更好地利用杂种优势,对于预测杂种优势的方法和途径进行了多年的研究,其中,以玉米和水稻为对象的研究较为广泛和深入.关于杂种优势的预测,人们曾通过生理生化、形态解剖、地理距离等途径进行探索,结果都不理想.80年代末,分子标记开始运用于杂种优势预测的研究.Lee 用33个RFL P 探针检测了8个玉米自交系及其28个杂交组合,结果认为RFL P 的遗传距离与F1产量呈显著正相关[18].Smith 用分布于整个玉米基因组的257个RFL P 探针检测了37个玉米自交系及其123个杂交组合,结果表明,亲本的RFL P 遗传距离与F 1产量和杂种优势相关达极显著水平[19].Stuber ,Melchinger 等均采用RFL P 标记方法发现RFL P 遗传距离与F1杂种优势表现存在高度的相关性[20].但也有与上述研究不一致的结果,如Melchinger 等研究发现亲本间RFL P 遗传距离与杂种F 1产量相关性很低,不能用于杂种优势的预测[21].Dudley 等用52个RFL P 标记和14个同工酶标记研究了14个玉米自交系・301・第12期李海渤:分子标记及其在作物育种上的应用与其F 1产量的关系,同样发现遗传距离与产量并无相关性[22].Melchinger 等认为,造成这两种不同结论的原因是亲本来源的不同,当亲本来自于相同的杂种优势群时,亲本间RFL P 遗传距离和F 1表现的关系呈显著相关,当亲本来自于不同的杂种优势群时,这种相关性较低[20].吴敏生等采用RAPD 标记对玉米杂种产量进行了预测研究,发现RAPD 遗传距离与杂种产量相关显著,但决定系数很小,表明遗传距离在决定杂种产量方面只占很小的比例,遗传距离大的F 1产量不一定高,遗传距离小的F 1产量不一定低[23].彭泽斌等用RAPD 方法研究了15个6类玉米自交系间的RAPD 遗传距离与其杂交组合F 1产量、特殊配合力、中亲杂种优势值的关系,认为RAPD 遗传距离与组合产量、中亲优势值、双亲特殊配合力存在极显著的正相关,说明用RAPD 遗传距离在杂交组合选配中有一定的参考价值[24].实践证实,关于利用不同分子标记预测杂种优势准确性及其机理有待于进一步研究.3 结语和展望分子标记是随着遗传学的发展而诞生的,在作物育种方面应用虽然仅有十几年时间,却显示了巨大的生命力,成为作物育种的重要途径之一.分子标记的发展和应用不仅促进了作物育种的发展而且对一些经典概念的再认识,提出了一些新的观点.如Huang 等提出质量性状基因和Q TL 可能仅是同一座位的不同等位基因[17].目前分子标记在育种上的应用还有一定的局限性,主要包括以下几个方面:1)开发的分子标记数量较少,很难找到与目标基因紧密连锁的分子标记,需要构建更为精密饱和的遗传图谱;2)分子标记技术本身的局限性造成检测结果的偏差;3)众多的农艺性状是受多基因控制的,而分子标记对数量基因的精确定位还有较大差距;4)有待于建立自动化的实验程序,实现对大群体快速、准确的鉴别;5)分子标记与表型之间的关系有待于进一步研究.分子标记是一种新的技术,它的技术体系并不全面,不能脱离传统的育种技术而单独使用,必须要与传统的育种技术有机结合,分子标记的检测结果和效应最终要到大田中验证.另外,分子标记技术的成本较高,限制了它的广泛应用.随着分子生物学理论与技术的发展,我们相信科学家们必将不断开发出分析速度快、成本低、信息量更大的分子标记.分子标记技术必将在作物育种方面得到更加广泛的应用.参考文献:[1]williams J G ,Kubelik A R ,et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic makers[J ].Nucl Acid Res ,1990,18:6531-6535.[2]Welsh J.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers[J ].Nucl Acid Res ,1990,18:7213-7218.[3]Weber J L.Human DNA polymorphisms based on length variations in simple -sequence tandem repeats [A ].K E Davis ,S M Tilghman (eds ).G enome analysis[C ].New york :Cold S pring Harbor Laboratory Press ,1990.159-181.・401・韶关学院学报(自然科学版)2002年[4]Vos P ,Hogers R ,Beleaker M.AFL P :a new technique for DNA fingerprinting[J ].Nucl Acid Res 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