De novo 转录组揭示真菌与微生物的共生机制
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第四章 细菌和真菌——思维导图页数:3
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第四章 细菌和真菌——思维导图页数:3
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真菌de novo测序
[2] Riley R, Salamov A A, Brown D W, et al. Extensive sampling of basidiomycete genomes demonstrates inadequacy of the white-rot/brown-rot paradigm for wood decay fungi [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2014, 111(27): 9923-99容 项目周期
真菌Survey50
无
重复序列 非编码RNA
基因预测 基本功能注释
致病性分析
30个自然日
真菌框架图
真菌精细图
基因组DNA1] Wu J, Kou Y, Bao J, et al. Comparative genomics identifies the Magnaporthe oryzae avirulence effector AvrPi9 that triggers Pi9‐mediated blast resistance in rice [J]. New Phytologist, 2015, 206(4): 1463-1475.
1
真菌de novo，是基于高通量测序数据对真菌基因组进行从头组装的方法。基于组装结果，我们可以预测真菌基因组中所包含的基因，并通过功能数据库比
对获得基因的功能信息。根据不同组装精细程度的需求，分为真菌框架图、真菌精细图两种不同策略。此外我们还提供真菌Survey服务，用于评估基因组的基 本情况，作为真菌精细图测序的前置及组装策略的优化依据。
产生木质纤维素酶对植物细胞壁成分进行降解。一直以来，人们通过II
类过氧化物酶
真菌Survey50
无
重复序列 非编码RNA
基因预测 基本功能注释
致病性分析
30个自然日
真菌框架图
真菌精细图
基因组DNA1] Wu J, Kou Y, Bao J, et al. Comparative genomics identifies the Magnaporthe oryzae avirulence effector AvrPi9 that triggers Pi9‐mediated blast resistance in rice [J]. New Phytologist, 2015, 206(4): 1463-1475.
1
真菌de novo，是基于高通量测序数据对真菌基因组进行从头组装的方法。基于组装结果，我们可以预测真菌基因组中所包含的基因，并通过功能数据库比
对获得基因的功能信息。根据不同组装精细程度的需求，分为真菌框架图、真菌精细图两种不同策略。此外我们还提供真菌Survey服务，用于评估基因组的基 本情况，作为真菌精细图测序的前置及组装策略的优化依据。
产生木质纤维素酶对植物细胞壁成分进行降解。一直以来，人们通过II
类过氧化物酶
《Denovo技术介绍》PPT课件
DNA测序
Nanopore是对DNA链直接测序可以直接 测序同时直接检测碱基修饰。 获得DNA链上的甲基化修饰结果，较 PacBio更为准确有效
目录
Hi-C 技术
Hi－C技术，一种高通量染色体构象捕获技术（High-throughput chromosome conformation capture），可以实现单个样本辅助基因组组装，使基因组达到染色体水 平
《Denovo技术介绍》PPT课件
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谢谢 本课件仅供大家学习学习
学习完毕请自觉删除 谢谢
目录
什么是Denovo？
也叫从头测序。是指对基因组序列未知或没有近源物种基 因组信息的某接、组 装和注释，从而获得该物种完整的基因组序列图谱。
Pacific Bio 测序缺点
错误率高达12.5%，每读8个碱基，就有一个是读错的，错误类型多 为“插入”，即会多读一个碱基。测序错误是随机的，可以通过测序深 度的提高来校正。
目录
BioNano光学图 谱技术
技术原理
BioNano光学物理图谱技术，简而言之是利用单链酶切技术在DNA上 做荧光标记，再通过纳米孔道对长达几百kb的长链DNA单分子线性化，经 过高分辨率光学系统进行拍照，在较短时间获得更完整的基因图谱，在辅助 基因组组装和结构变异（structural variants，SV）检测等方面有广泛的应 用。
主要产品
人类基因组测序
动植物基因组测序 细菌基因组测序 真菌基因组测序 宏基因组测序
测序工具
一代测序-sanger 二代测序-illumina 三代测序PB/Bionano/nanopore
原理
优势
劣势
转录组Denovo手册(无答案)
对于初级分析的项目，只需要给合作伙伴提供过滤后的数据即可，所以会对过滤后的数 据做dt1h LReenagdt2h
N3Z5123 FUNzPTEARAA 503060871000;536871 5725.71;52. 99.9971;99. 75 75
确定的？我们所说的插入片段长度是指 括了 read1 和 read2 本身的长度？
read1
和
read2
之间没有测到的那一段的长度还是包
1112..什解么释是Soilnedxeax测测序序中，几进个行关in键de的x技测术序：的边主合要成目边的测是序什（么S？BS），可逆阻断技术和桥式 。 PCR
2.信息分析流程：
软件（Conesa, A., S. Gotz, et al. (2005). "Blast2GO: a universal tool for annotation, visualization 得到 的 and analysis in functional genomics research." Bioinformatics 21(18): 3674-6.) Unigene
Unigene
相似根性的据蛋KE白G，G从注而释得信到息该我U们n能ige进ne一的步蛋得白到功U能ni注ge释ne信的息P。athway 注释。
统计我，如们将下图Un所ig示en：e 和 COG 数据库进行比对，预测 Unigene 可能的功能并对其做功能分类
根据nr注释信息我们能得到GO功能注释。我们根据nr注释信息，使用 （ ） Blast2GO 2.3.5
本节问题： 1.Q20 是什么意思？ 2.BMS 系统上给出的 Q20%值是如何计算出来的？ 3.转录组暂时执行数据质量标准是怎样的？你有什么更好的建议（拿出自己的测试数据）？ 4.在统计数据信息时，read1 和 read2 长度相等吗？ 5.read每个碱基测序错误率的分布如何？read测序长度增加有什么好处？为什么SOAP比对 的时候允许 3’端有更多的错配？ 6.如何根据 BMS 上的碱基频率分布图查找建库或测序失败的问题？
DNA的质量监测通常有两个方法
2）DNA的质量监测通常有两个方法：首先OD260/OD280比值应该在1.8左右（1.7-1.9），否则意味着DNA样品中存在大量的蛋白质或RNA污染。
其次，琼脂糖电泳分析时应主要以超螺旋条带为主。
最多不超过三条带（分别为超螺旋DNA，线性化DNA和环状DNA）。
否则意味质粒DNA的质量不高，应该重新制备。
2.限制性内切酶的活性1）限制性内切酶一般需要低温保存，而且反复的升降温过程对酶活性的损害很明显。
因而为了确保在有效期内的限制性内切酶不会失活，限制性内切酶的日常保存和使用应当很小。
2）建议购买具有保温功能的冻存盒保存限制性内切酶（-20度），而且取用限制性内切酶时，也应该使用具有保温功能的冻存盒，尽量防止酶的温度反复出现大的波动。
3.限制性内切酶的用量1）限制性内切酶的单位定义通常为：在合适的温度下，完全消化1ugDNA底物所需的酶量定义为一个单位。
2）在这个单位定义中，有几个不确定因素：首先是底物，不同的酶单位定义是选择的底物可能不同（常用的几个底物DNA包括：Lambda DNA ,AD2 DNA 和一些质粒DNA）；第二个不确定因素是限制性内切酶在底物DNA上的酶切位点的个数。
由于单位定义中要求完全消化，因而底物上某个酶的酶切位点的个数的多少，就直接影响了该酶的单位定义。
3）因而，在进行酶切时，用1ul酶（一般10IU/ul）消化1ugDNA的通常做法是很不科学的，这也导致在实际工作中，大家要进行多次预实验才能确定最合适酶切条件。
4）以前，我推荐了一个在线的双酶切设计软件，double digestion designer, 可以精确地计算酶切时的限制性内切酶的用量。
使用中，能够注意到，用来进行双酶切的两个酶的用量有时竟然相差近20倍（EcoRI + NheI)，而且发现，小片段PCR产物（100-500bp）进行酶切时，需要的酶量比质粒DNA酶切时用量多10倍以上。
5）该软件目前可以免费使用，用户名和密码都是test。
高通量测序 名词解释
高通量测序基础知识汇总一代测序技术：即传统的Sanger测序法，Sanger法是根据核苷酸在待定序列模板上的引物点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。
它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，通过检测得到DNA碱基序列。
二代测序技术：next generation sequencing（NGS）又称为高通量测序技术，与传统测序相比，二代测序技术可以一次对几十万到几百万条核酸分子同时进行序列测定，从而使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序（Deep sequencing）。
NGS主要的平台有Roche（454 & 454+），Illumina（HiSeq 2000/2500、GA IIx、MiSeq），ABI SOLiD等。
基因：Gene，是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。
基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。
DNA：Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸，一个脱氧核苷酸分子由三部分组成：含氮碱基、脱氧核糖、磷酸。
脱氧核糖核酸通过3',5'-磷酸二酯键按一定的顺序彼此相连构成长链，即DNA链，DNA链上特定的核苷酸序列包含有生物的遗传信息，是绝大部分生物遗传信息的载体。
RNA：Ribonucleic Acid，，核糖核酸，一个核糖核苷酸分子由碱基，核糖和磷酸构成。
华大基因转录组结题报告(de novo)
华大基因转录组分析（de novo）结题报告
2009 年 月 日
华大基因转录组分析（de novo）结题报告
目录
一、 项目信息................................................................ 2 二、 工作流程说明............................................................ 3
Total Length N50 Length Mean Length
59,067,262 1,968 1,260
表 4 补洞后 gap 长度占 scaffold 长度的百分比统计：
Gap Length Percentage (to scaffold) Gap number Gap percentage (to total gaps)
3.2.5 Scaffold-gene表达差异分析
说明：我们利用软件 soap 将不同样本中得到的 Reads 比对到 scaffold-gene 上，获得 scaffold 上 reads 的数目，然后计算 scaffold 在不同样本之间表达差异的 P value，一般
6
华大基因转录组分析（de novo）结题报告
2.1 实验流程说明........................................................... 3 2.2 信息分析流程说明....................................................... 3 三、 项目结果报告............................................................ 4 3.1 数据处理和质控报告..................................................... 4
2009 年 月 日
华大基因转录组分析（de novo）结题报告
目录
一、 项目信息................................................................ 2 二、 工作流程说明............................................................ 3
Total Length N50 Length Mean Length
59,067,262 1,968 1,260
表 4 补洞后 gap 长度占 scaffold 长度的百分比统计：
Gap Length Percentage (to scaffold) Gap number Gap percentage (to total gaps)
3.2.5 Scaffold-gene表达差异分析
说明：我们利用软件 soap 将不同样本中得到的 Reads 比对到 scaffold-gene 上，获得 scaffold 上 reads 的数目，然后计算 scaffold 在不同样本之间表达差异的 P value，一般
6
华大基因转录组分析（de novo）结题报告
2.1 实验流程说明........................................................... 3 2.2 信息分析流程说明....................................................... 3 三、 项目结果报告............................................................ 4 3.1 数据处理和质控报告..................................................... 4
微生物基因组学研究中的数据分析方法与技巧
微生物基因组学研究中的数据分析方法与技巧微生物基因组学是研究微生物种类和功能的学科，通过研究微生物的基因组可以了解它们的生物学特性和在环境中的角色。
而对于微生物基因组学的研究，数据分析方法和技巧是至关重要的。
本文将介绍微生物基因组学研究中常用的数据分析方法和技巧。
1.序列比对和组装技术在微生物基因组学研究中，首先要对微生物的基因组进行测序。
常用的测序技术包括Sanger测序、第二代测序（如Illumina测序）和第三代测序（如PacBio测序）。
得到基因组序列后，需要进行序列比对和组装。
序列比对是将测序获得的短序列与参考序列进行比对，以确定序列的准确位置和变异信息。
比对可以使用常见的比对工具如Bowtie2、BWA和BLAST等。
组装是将测序获得的短序列拼接成长的连续序列，以获取完整的基因组序列。
组装方法包括de novo组装和参考基因组组装。
de novo组装是从头开始组装，不需要参考序列，而参考基因组组装则是基于已有的参考序列进行组装。
2.基因预测和注释基因预测是确定基因组序列中存在的基因的位置和功能。
实现基因预测的常用工具包括Glimmer、Prodigal和GeneMark等。
通过这些工具可以预测基因的开放阅读框（ORF）和编码的蛋白质序列。
基因注释是对预测的基因进行功能描述和分类。
注释可以使用多种数据库和工具进行，如NCBI的NR和NT数据库、UniProt数据库和KEGG数据库等。
这些数据库可以提供关于基因功能、跨物种比较和代谢通路等信息。
3.基因表达分析基因表达分析是研究基因在不同条件下的表达水平和变化趋势。
常用的基因表达分析方法包括差异表达分析和聚类分析。
差异表达分析用于比较两个或多个样品（如野生型和突变型）中基因的表达差异。
常见的差异表达分析方法包括DESeq2、edgeR和limma等。
聚类分析用于将样品按照基因表达模式进行分类和分组。
常见的聚类分析方法包括层次聚类、K均值聚类和PCA等。
全基因组从头测序(de novo测序)
[2] Li RQ, Fan W, Tian G, Zhu HM, He L, Cai J, et al. The sequence and de novo assembly of the giant panda genome. Nature. 2009 463, 311-317.
[3] Junjie Qin, Yujun Cui, et al. Open-Source Genomic Analysis of Shiga-Toxin–Producing E. coli O104:H4. N Engl J Med. 2011 Aug 25; 365(8): 718-24.
从头测序（de novo 测序）
从头测序即 de novo 测序，不需要任何参考序列资料即可对某个物种进行测序，用生物信息学分 析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。利用全基因组从头测序技术，可以获得 动物、植物、细菌、真菌的全基因组序列，从而推进该物种的研究。一个物种基因组序列图谱的完成， 意味着这个物种学科和产业的新开端！这也将带动这个物种下游一系列研究的开展。全基因组序列图 谱完成后，可以构建该物种的基因组数据库，为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台；为后 续的基因挖掘、功能验证提供 DNA 序列信息。华大科技利用新一代高通量测序技术，可以高效、低 成本地完成所有物种的基因组序列图谱。
Medicine，NEJM）上在线发表。德国致病性大肠杆菌研究项目首次展示了快速的基因组测序
技术和及时的数据共享给全球各科研领域所带来的巨大贡献，证实了信息数据的快速共享在
公共卫生事件中可发挥至关重要的作用，同时也为应对全球重大突发性紧急公共卫生事件提
供了一个全新的解决思路。
德国肠出血性大肠杆菌项目进展时间轴
[3] Junjie Qin, Yujun Cui, et al. Open-Source Genomic Analysis of Shiga-Toxin–Producing E. coli O104:H4. N Engl J Med. 2011 Aug 25; 365(8): 718-24.
从头测序（de novo 测序）
从头测序即 de novo 测序，不需要任何参考序列资料即可对某个物种进行测序，用生物信息学分 析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。利用全基因组从头测序技术，可以获得 动物、植物、细菌、真菌的全基因组序列，从而推进该物种的研究。一个物种基因组序列图谱的完成， 意味着这个物种学科和产业的新开端！这也将带动这个物种下游一系列研究的开展。全基因组序列图 谱完成后，可以构建该物种的基因组数据库，为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台；为后 续的基因挖掘、功能验证提供 DNA 序列信息。华大科技利用新一代高通量测序技术，可以高效、低 成本地完成所有物种的基因组序列图谱。
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供了一个全新的解决思路。
德国肠出血性大肠杆菌项目进展时间轴
高通量测序常用名词汇总
高通量测序常用名词汇总技术支持Q20值是指的测序过程碱基识别（Base Calling）过程中,对所识别的碱基给出的错误概率. 如果质量值是Q20,则错误识别的概率是1%,即错误率1%,或者正确率是99%；如果质量值是Q30,则错误识别的概率是0.1%,即错误率0.1%,或者正确率是99.9%；如果质量值是Q40,则错误识别的概率是0.01%,即错误率0.01%,或者正确率是99.99%；你发现规律没有,Q“N”0的质量值,就是正确率有N个9的百分比,这样就非常容易记忆了.基因高通量测序中，每测一个碱基会给出一个相应的质量值，这个质量值是衡量测序准确度的。
碱基的质量值13，错误率为5%，20的错误率为1%，30的错误率为0.1%。
行业中Q20与Q30则表示质量值≧20或30的碱基所占百分比。
例如一共测了1G的数据量，其中有0.9G的碱基质量值大于或等于20，那么Q20则为90%。
Q20值是指的测序过程碱基识别（Base Calling）过程中，对所识别的碱基给出的错误概率。
质量值是Q20，则错误识别的概率是1%，即错误率1%，或者正确率是99%；质量值是Q30，则错误识别的概率是0.1%，即错误率0.1%，或者正确率是99.9%；质量值是Q40，则错误识别的概率是0.01%，即错误率0.01%，或者正确率是99.99%；一代测序技术：即传统的Sanger测序法，Sanger法是根据核苷酸在待定序列模板上的引物点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。
利用de novo测序分析蚕豆瓣酱醅微生物多样性
利用de novo测序分析蚕豆瓣酱醅微生物多样性周评平;李治华;董玲;赵驰;朱永清【期刊名称】《西南农业学报》【年(卷),期】2018(031)005【摘要】[目的]分析蚕豆瓣醅微生物多样性并比较与过去采用16S、ITS等扩增子测序的差异.[方法]利用de novo测序方法研究微生物菌群多样性.[结果]嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)是蚕豆瓣酱醅的优势微生物,相对丰度占一半以上(mOTUs方法为64.26％,Metaphlan2方法为50.80％),Metaphlan2方法发现破布子乳酸菌(Lactobacillus pobuzihii)也是优势菌株,其相对丰度为17.60％,另外,存在大量未分离到的微生物有待进一步研究.[结论]该方法能分析到蚕豆瓣醅微生物中种或菌株的水平,研究结果不仅为后续深入研究提供了技术支撑,而且对郫县豆瓣的微生物安全性评价提供了有效的方法.【总页数】3页(P1055-1057)【作者】周评平;李治华;董玲;赵驰;朱永清【作者单位】四川省农业科学院,四川成都610066;四川省农业科学院农产品加工研究所,四川成都610066;四川省农业科学院农产品加工研究所,四川成都610066;四川省农业科学院农产品加工研究所,四川成都610066;四川省农业科学院农产品加工研究所,四川成都610066;四川省农业科学院农产品加工研究所,四川成都610066【正文语种】中文【中图分类】Q93【相关文献】1.利用de novo组装策略解析猪的基因组变异 [J], 田仕林;唐茜子;李学伟;李明洲2.一株耐受蛋清蛋白的鸡蛋腐败菌S菌株的分离鉴定及其De novo测序分析 [J], 张璟;陈倩;顾丽红;阮瑶;张新帅;郭爱玲3.应用Illumina MiSeq高通量测序技术分析巴东地区豆瓣酱中微生物多样性 [J], 赵馨馨;崔梦君;董蕴;倪慧;单春会;郭壮4.基于高通量测序分析玉米黄酒微生物多样性 [J], 李永翔;蒋海娇;郭建华5.不同来源及不同发酵阶段豆瓣酱微生物多样性的比较分析 [J], 杨帆;邓维琴;李恒;唐浪;马嫄因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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然而，利用以上研究数据，另有文章发表：
NGS项目文章
猪苓，非褶菌目多孔菌科树花属，是一种药用真菌；
蜜环菌，伞菌目蜜环菌属，夏秋季常寄生于树丛根部，是一种根腐菌。
猪苓的生长需要蜜环菌提供营养，二者之间存在共生关系。
在共生关系建立的过程中，蜜环菌的菌索会吸附并侵染猪苓的菌核，
而猪苓则会激发自身防御机制，如菌核细胞壁不规则地增厚以抵抗蜜环菌进一步侵染。
这个抵抗侵染过程的分子机制是怎样的？
2015年10月，猪苓对蜜环菌的防御机制研究成果发表在Scientific Reports上，
该研究由中国医学科学院药用植物研究所郭顺星教授课题组负责，
其中De novo
转录组测序工作由诺禾致源完成。
研究内容与结果
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De novo 转录组
揭示猪苓对蜜环菌的防御机制
3. 差异基因功能分析
利用DESeq软件进行CT和CK的差异基因筛选，得到10,933个DEG，包括
8,780个上调基因和2,213个下调基因（图2）。
表达上调的差异基因GO富集分析发现：在molecular function部分，富集
最明显的是苏氨酸型肽链内切酶活性、肽酶活性以及特异性DNA结合等
term；在cellular component部分，富集显著的是蛋白酶复合体、膜组成
等term；而在biological process部分，蛋白质折叠、三羧酸循环以及染色
质组装等term下显著富集。
而下调的DEG被富集到对有机物反应、细胞组
分合成等功能term，这预示着猪苓受到侵染时会限制自身的生长与繁殖。
对DEG进行KEGG富集分析发现：精氨酸和脯氨酸代谢通路富集显著；免疫
相关基因精氨酸酶（ARG）显著上调，推测其与猪苓抵抗蜜环菌侵染相关。
而在核糖体合成途径通路中，含有11个下调基因，这与GO富集中发现下调
基因在生物学过程相关term富集的结果是一致的，从而推测猪苓受到侵染
会减弱自身的生物学过程以保存能量。
2. 转录本功能注释
对拼接得到的转录本进行功
能注释，采用Nr, Nt, Swiss
-Prot, KEGG, GO, KOG 和
Pfam 七大数据库。
并对
unigene进行GO和KOG功
能分类（图1和图2）。
1. 转录本拼接
四个文库测序下机的原始
数据进行质控，将各样本
的clean reads进行混合拼
接，得到38444条
unigene，作为参考序列用
于后续分析。
4. qPCR验证差异表达基因
选取13个DEG进行实时荧光定量PCR，检测结果与RNA-seq一致。
结论与讨论
本研究首次通过RNA-seq研究蜜环菌侵染和未侵染的猪苓样本，筛选出差异表达基因10933个；
通过GO富集和KEGG富集分析，鉴定到了可能与抵御反应相关的若干差异基因。
其中，且热休克蛋白（Hsps）基因、抗氧化防御相关基因、凝集素基因、致病相关蛋白（TLP）基因、
次级代谢相关基因、细胞壁水解与融合相关基因、PDR家族基因、WD40蛋白基因等
在蜜环菌侵染的猪苓样本中呈现表达上调，均可能与抵御反应相关。
图3 转录数据的SSR分析
图2 对差异基因进行筛选
图1 unigene的GO功能分类
郭顺星教授课题组继续利用本次RNA-seq的数据结
果进行SSR分析，丰富了药用猪苓的因地域而异的
遗传多态性，并为猪苓群体遗传和行为生态学研究
提供了依据。
阅读原文>>
阅读原文>>
Scientific Reports。