免疫组化教程

第一章 免疫细胞化学基本概念及发展简史

一．免疫细胞化学的基本概念

免疫细胞化学（ immunocytochemistry)是利用特异性抗原抗体反应，观察和研究组织细胞特定抗原(或抗体)的定位和定量的技术。

应用免疫细胞化学技术可以在光镜和电镜水平观察细胞膜及细胞内某种抗原物质的存在。从而为生物医学研究生命大分子,特别是那些对细胞化学方法来说尚无作用物或作用物特异性不强的酶、蛋白质、激素及受体蛋白等在组织内分布、细胞内定位以及代谢状态等，提供了特异性强、灵敏度高而又直观化的原位分析细胞组成物质的细胞化学手段。

二．免疫细胞化学的发展简史

1941年， Coons等创立了荧光抗体法

1959年， Singer创立了铁蛋白法

1966年， Nakane等创立了免疫酶技术

1971年， Faulk和Taylor 创立了免疫胶体金法

1976年， Bayer等提出了亲合组织化学法

第二章 免疫细胞化学相关的组织学和细胞学技术

一． 取材

（一） 组织标本的取材

1. 活检钳的刃口锋利，以免组织受挤压。

2. 取所需组织：主要病变区、病灶与正常组织交界区。必要时取远离病变区的正常组织作为对照。

3. 为充分保存组织的抗原性， 取材要快，尽量保持组织新鲜。

（二） 细胞标本的取材

1． 印片法

应用：活检标本、手术切除的标本。

方法:新鲜标本以最大面剖开暴露病区，载玻片轻压病区，脱落细胞黏附于载玻片上，立即浸入固定液中5－10分钟，取出自然干燥,低温保存。

优点:简便省时，细胞抗原保存较好。

缺点:细胞分布不均重叠，影响标记效果.

2． 穿刺吸取涂片法

应用：实质器官的病变区.

方法： ①穿刺液较少时直接涂片，力求均匀。

②穿刺液较多时，穿刺液滴入1－2毫升Hanks液（RPMI

1640液）内，轻搅，500rpm离心5－10分钟，弃上清，制成细胞悬液(2x106细胞/ml)，吸一滴于载玻片上，轻涂，干后固定。

优点：细胞均匀.

缺点：细胞易变形。

3． 体液沉淀涂片法

①细胞数多，取一滴直接涂片。

②细胞数少，取5毫升自然沉淀液以1500rpm离心10分钟，弃上清，将沉淀涂片，略干后固定备用。

4． 培养细胞

①贴壁生长的细胞：将盖玻片插入培养液中。

②悬浮生长的细胞：可用离心涂片法制成涂片。

5． 离心涂片机法

细胞悬液2105~6， 1000r/min， 2min，50~100l。

注意事项：

①防止脱片, 涂黏附剂，。

②为节省试剂及便于镜下观察和计数，将细胞集中到直径0.6—1.0cm圆圈内，细胞总数以105为宜。

③粘液丰富的标本如胃液、痰液等未经特殊处理，不宜作免疫组化.

二．固定

（一）免疫组化的固定法

选择最佳固定的标准

最好的保存细胞和组织的形态结构。

最大限度的保存抗原的免疫活性。

固定有：

（1）物理固定：血膜空气快速干燥，冻结干燥。

（2）化学固定：

固定方法

1. 浸润法（ immersion method） 4－24小时. 2. 灌流法 ( irrigation method ）

麻醉动物，经动物左心室主动脉插管,生理盐水冲洗,注入固定液,组织在30分钟内取材。

（二）重要的固定液

1． 10%中性缓冲福尔马林

双功能交联剂.使组织间相互交联，保存抗原于原位.特点是对组织穿透性强，收缩性小，易使组织硬化而浸蜡困难。固定时间不宜过长。

2． 4％多聚甲醛磷酸缓冲液

适应性较广泛的固定液，固定时间不宜过长.

3． Bouin,s液

对组织固定力强且较均匀。比单独醛类固定更适合免疫组化染色，4 0C。

4． Zamboni,s液

可用于光镜、电镜免疫细胞化学观察.采用2。5％多聚甲醛和30％饱和苦味酸，更可增加对组织的穿透力和固定效果，以保存更多的组织抗原.6～18小时。

5． 丙酮

用于冰冻切片及细胞涂片的固定。固定较好，对组织穿透性很强 ，保存抗原的免疫活性较好,染色效果稍差。4 0C,5－10分钟，干燥后低温保存。

6． 95%乙醇 用于冰冻切片及细胞涂片的后固定。固定效果差，可和其他试剂混合使用，染色较好。

7． AAF液：

较常用的固定液.（95-100%酒精85ml, 冰醋酸5ml， 浓甲醛10ml.）

（三）固定剂的选择

各种抗原的最佳固定剂的选择见表.鉴于10％中性甲醛是国际最通用的固定剂，虽然它对保存Ig抗原方面较差，若采用合适的蛋白酶消化处理，进一步暴露抗原，结合使用敏感的免疫组化方法,如PAP,ABC法，仍不失为一可用的固定剂.固定时间可适当缩短至16-24小时。

免疫球蛋白类抗原可选用含汞类的固定液，（如Zenker固定液),或蛋白沉淀性固定液（如Bouin固定液，甲醛醋酸酒精固定液等)。扁桃体、淋巴结和骨髓还可用甲缩醛(formal—Saline）加2—10％醋酸，石蜡切片，能有效地保存Ig.

肿瘤胚胎抗原(如甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA）对多种固定均稳定。一般可用中性福尔马林固定，石蜡包埋切片）

激素类中的多肽类激素宜选用Bouin.

组织之中酶和一些组织特殊抗原(如肌球蛋白、凝血蛋白和第VIII凝血因子等）可用10％中性甲醛。

待测抗原与固定液的关系

抗原 适 用 固 定 液

细胞表面抗原 100％丙酮,95%乙醇，10％福尔马林,Bouin液

免疫球蛋白 Zenker固定液，10%福尔马林，95%乙醇，100%丙酮，

酶，蛋白类 10%福尔马林，Bouin液，95％乙醇，100%丙酮

肽类激素 Bouin液，10%福尔马林，FAA固定液

固醇类 10％福尔马林，Bouin液

补体 95％乙醇,100%丙酮，10%福尔马林,Bouin液

肿瘤胚胎抗原 10％福尔马林，

(四）注意事项

免疫组化固定方法的原则是：在保持细胞形态完好和所测抗原的前提下，应采用浓度最低的固定液和最短的固定时间。为此，固定组织时应该:

1． 组织新鲜，尽早、尽快固定。

2． 组织块尽量小（<220.4cm）。

3． 固定液体积大于组织体积20倍以上。

4．固定后充分水洗，减少固定液造成的人为假象

5．针对抗原、染色法选择最佳固定方法。

三．包埋和切片法

固定的和未经固定的组织、细胞以及各种涂片和切片方法均可用于免疫组化，但其效果不同。

(一）冰冻切片 优点：是能较好地保持抗原活性(尤其是表面抗原)和酶。冰冻切片简便快速,省去固定、包埋和切片处理等一系列繁琐步骤。

缺点：是不能用于回顾性研究,不利于常规检查和长期保存标本，不如石蜡切片清晰。常用致冷切片和恒冷箱切片机(Cryostat），以后者最佳,可制成4~6μm的薄片.组织切片可直接贴附于玻璃载片，或贴附于涂有明胶或histostik(商品粘附剂）的玻璃片上,以减少组织片脱落。

为防止冷冻过程中冰晶形成，破坏组织结构和保持抗原，取材后立即将标本浸入深低温预冷的（干冰容器内，－70度）正已烷液内骤冷30-60秒，取出后再冰冻切片.切片最好尽快进行组化染色亦可吹干储存于片盒内，外包塑料袋,置于－20度低温冰箱，一个月内使用.染色前，从冰箱内取出切片,置室温干燥10分钟，再经丙酮固定5—10分（未固定者)，即可进入染色程序。

(冰冻切片OCT包埋,置液氮液面上10－20秒，低温保存。)

(二）石蜡切片

一般厚约3—5μm，切片于37度烘烤过夜，可置4度保存。切片前，固定的组织块需经酒精逐级脱水，二甲苯透明，再浸蜡包埋.各步骤时间均不宜过长（1-2小时)，以免组织变脆。

（石蜡切片①脱水、透明在4 0C进行。②浸蜡、包埋时石蜡温度低于60 0C。）

(三）振动切片

可把新鲜组织（不固定不冷冻，或低浓度固定液稍稍固定)切成20~100m厚，漂浮免疫组化染色,检出阳性部位,后固定，常规电镜样品制备。适于免疫电镜细胞化学观察。

（四）塑料包埋切片

优点是组织块可同时用于光镜切片、半薄切片（0.5～1.5m）和电镜超薄切片。目前常用包埋塑料有两大类：甲基丙烯酸盐类和环氧树脂类。前者能较好地保存抗原，染色前不必脱去包埋材料,但切片易皱折.

（五）超薄切片

载玻片及盖玻片的处理和切片的附贴

载玻片及盖玻片的处理

①载玻片： 清洗液（酸）浸泡12－24小时,水洗，95％酒精浸泡2小时后擦干或烤干.

②盖玻片:清洗液浸泡2小时,或盐酸酒精浸泡后水洗，95％酒精浸泡，擦干。

切片的附贴

免疫组化染色过程较长，并需用含表面活性剂的缓冲液多次浸泡切片。有的石蜡切片染色前要用蛋白酶消化。新鲜组织如用灌注法或浸润法固定后再作冰冻切片会失去粘附性。以上这些因素常常造成染色过程中切片的脱落.要防止这一问题的发生，常规的蛋白甘油附贴法已不符合要求。

免疫组化染色中可选用的附贴剂. (1) 甘油—明胶:

1%明胶 100ml 混匀，涂布载破片上，切片附贴后置多聚甲醛蒸气(80度）

甘油 12ml 中1小时

麝香草酚 数滴

(2) 甲醛—明胶：

1%明胶 5ml 涂布载片上，切片附贴后置37度温箱中1小时或过夜

2%甲醛 5ml

(3) 铬明矾——-明胶:

1%明胶与0.1％铬明矾(硫酸铬钾）等量混合后即可涂片。600C晾干.

(4) 多聚赖氨酸:Poly-L—Lysine

0。5％ 多聚赖氨酸（MW>300，000)水溶液，涂布载片后，晾干或45 0C烤干，一周内应用。

此溶液需冷冻贮藏。

（5)APES：3-Amino propyltriethoxy silane

APES/丙酮（1/50）涂片晾干。

(6）APES 和Poly—L—lysine(PLL）联合应用

适于特别容易脱片的情况。

第三章 免疫细胞化学染色

免疫细胞化学的类型

根据标记物的性质，可将免疫组化染色法分为以下几种：

(1) 免疫荧光法(Immunofluorescence technique)

(2) 免疫酶法(Immunoperoxidase technique)

(3) 亲合组织化学法(affinity histochemistry）

(4) 免疫金银法（Immunogold technique）

(5) 其它：放射免疫法。

此外,尚有根据染色及抗体滴加步骤，分类为直接法，间接法，桥法等。