酶切注意事项及问题

酶切应注意的酶切应注意的--重组质粒的构建重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。

但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。

在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能让大家在实验中少走弯路。

所涉及内容如下：1) 克隆基因的酶切位点问题2) 载体酶切的问题3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。

一、克隆基因的酶切位点问题1、克隆位点选择的问题。

首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。

然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。

这是常识，不赘述。

2、保护碱基数目的问题。

在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。

但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。

这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。

一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DN段上。

如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。

下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。

NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6 SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4XhoI 3 XbaI 3 SmaI 4案例分析一：本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。

后查文献得知症结所在，在NdeI序列后加上六个保护碱基后，迎刃而解。

引以为戒！现在普通酶我都引入三个保护碱基。

药厂酶切工艺流程及注意事项新手下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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酶切鉴定步骤1. 任务概述酶切鉴定是一种常用的分子生物学实验技术，用于确定DNA或RNA分子的特定序列。

该技术主要依赖于酶切酶的作用，通过将DNA或RNA分子切割成特定的片段，然后使用凝胶电泳等方法来分离和鉴定这些片段。

本文将详细介绍酶切鉴定的步骤及相关注意事项。

2. 实验材料和试剂准备在进行酶切鉴定实验前，需要准备以下材料和试剂： - DNA或RNA样本 - 酶切酶- 缓冲液 - 脱水酒精 - 乙酸钠 - 等电聚丙烯酰胺凝胶（PAGE） - DNA分子量标记物 - DNA染料3. 实验步骤3.1 样本处理首先，需要从细胞或组织中提取DNA或RNA样本。

提取方法可以根据具体实验目的和样本来源选择合适的方法，如酚/氯仿法、离心柱法等。

提取的样本应该纯净且浓度适中。

3.2 酶切反应将提取的DNA或RNA样本加入适量的缓冲液中，然后加入所需的酶切酶。

酶切酶的选择应根据目标序列的特点来确定，常用的酶切酶有限制性内切酶、反转录酶等。

在酶切反应中，需要注意以下几点： - 反应温度和时间：根据酶切酶的要求，选择适当的温度和反应时间。

一般来说，酶切反应温度在37°C到65°C之间，反应时间从数分钟到数小时不等。

- 缓冲液配制：根据酶切酶的要求，准确配制适量的缓冲液。

不同的酶切酶可能需要不同的缓冲液pH值和离子浓度。

- 酶切酶浓度：根据样本的浓度和酶切酶的活性，确定合适的酶切酶浓度。

一般来说，酶切酶浓度在10-1000单位/μg DNA或RNA之间。

- 酶切反应控制：在酶切反应中，需要设置阴性对照和阳性对照。

阴性对照是不加酶切酶的样本，用于判断实验中是否存在非特异性切割。

阳性对照是已知酶切酶切割位点的样本，用于验证酶切酶的活性。

3.3 凝胶电泳分析将酶切反应产物进行凝胶电泳分析，以确定酶切的效果和片段的大小。

具体步骤如下： - 准备1X TBE缓冲液：将10倍浓度的TBE缓冲液稀释至1倍浓度。

1、DNA纯度一般而言，纯度高的DNA（即混入的蛋白质、RNA或多糖类物质较少）容易被限制性内切酶消化，基因重组是严重洪的所有酶促反应都有类似共性，因此应尽量提高DNA纯度。

若DNA不能被限制性内切核酸酶切割，应对DNA样品进行酚抽提、乙醇沉淀等操作，以提高DNA纯度。

下列因素影响DNA纯度：(1)DNA样品中常常杂有RNA，虽然它的存在不影响酶的反应速度，但RNA可和酶蛋白发生非特异性结合而减少酶的有效浓度，使酶解不彻底。

另外，RNA在凝胶电泳中呈现的区带会掩盖该区带范围内的DNA片段的呈现，干扰DNA片段的观察。

(2)一般来说，少量蛋白质的污染对DNA酶解的影响不大，但如果杂有核酸酶等蛋白质，就会干扰酶切反应，并影响酶解产物。

有一类蛋白质叫结合蛋白，他能与DNA发生非特异结合，不仅封闭DNA上的识别序列而影响酶切反应，而且DNA与蛋白质结合物在凝胶电泳上迁移甚慢，从而改变DNA片段在电泳图谱中的位置，影响DNA片段的定性分析。

(3)样品中杂有其他DNA，如制备的质粒DNA中含有染色体DNA片段等，它们不影响酶解作用，但干扰酶解产物电泳图谱并影响以后的重组连接反应。

(4)DNA样品中的其他杂志，如Hg2+、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，这些杂质常常是制备过程中不慎带进的，它们影响酶切速度，甚至改变识别特异性，出现酶的第二活性。

2、DNA甲基化限制性内切核酸酶的识别序列若被修饰酶产生了修饰反应（如甲基化酶的甲基化反应），则该DNA不能被限制酶再切割。

甲基化酶是大多数大肠杆菌菌株中都存在的酶系之一，有dam甲基化酶和dcm甲基化酶两大类。

Dam甲基化酶在5’GATC3’的A上甲基化，dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’的C上甲基化。

若出现甲基化影响，则应使用甲基化酶缺陷菌株（dcm或dam），或使用不受甲基化酶影响的限制性内切核酸酶，如MboI和Sau3A是同裂酶，因MboI受甲基化影响程度大，则宜使用几乎不受甲基化酶影响的Sau3A。

做酶切时要注意些什么？做酶切时要注意些什么？酶切后跑电泳无条带可能是什么原因？（排除电泳因素）参考见解：一、建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。

通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg 已纯化好的DNA。

如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。

二、选择正确的酶不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。

识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。

假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。

内切酶的产物可以是粘端的（3’或5’突出端），也可以是平端的片段。

粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。

相关信息参见目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。

三、酶内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。

酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。

酶的用量视在底物上的切割频率而定。

例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。

参见目录第244和264之"切割质粒DNA"和"包埋法切割DNA"。

四、 DNA待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。

DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。

关于甲基化的内容，参见第252页至253页之甲基化相关内容。

五、缓冲液对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。

酶切现象及影响因素详解1 先说一下酶切对象(1) 质粒要是对质粒进行酶切，那么质粒的纯度挺重要，污染有DNase 和残留质粒提取中的酚以及高盐对DNA酶切都不利，还有RNA要去除干净。

以上所提的这些这都会影响酶切效果。

解决方法 DNase污染：质粒提取的试剂都要进行灭菌，提取时不要拖拉，电泳缓冲液要长换，以免电泳液造成DNA降解，电泳液的pH不要偏酸，容易降解DNA.在最后溶解DNA时，可以采用TE和水，建议用TE，TE可以鳌合金属离子，使DNase失活。

酶切时，TE也会有一定影响，但你可以将溶解DNA时的TE少加点。

酶切时，取的DNA的体积就可以减少，经水稀释，就问题不了。

RNA 的去除：一般将RNase加到TE中，经过37度温育一段时间就可以将RNA很好的去除1－2个小时就行。

酚的污染：首先在用酚仿抽提时，就要小心不要吸到下面的有机溶液，要是为了保险可以再用氯仿单独抽提一下，就可以很好的避免酚的残留。

高盐的去除：提取质粒时一般盐的浓度很高，若有人在70％乙醇洗盐这步不做，也会影响后面酶切。

（2）PCR产物 PCR产物经电泳检测是单一目的条带可以直接酶切，若是杂带很多，就要将目的片段回收再酶切。

一般在设计引物的时候，会在5'端引入酶切位点，但是不要忘了在酶切位点外面加几个保护碱基。

加入4个比较保险，如果没有保护碱基，内切酶是无法切断DNA的，即使加入保护碱基，酶切效率也会较低，需要长时间酶切。

（3）基因组DNA 将基因组做酶切一般是在southern blot 时常用，这时酶切体系一般较大，因为基因组中目的基因的比例是很小的，酶切之后转膜又会有损失，因此多做一点酶切产物，才会获得较好的杂交效果。

内切酶也要多加一些，一般都要酶切一夜，才能完全酶切。

2 酶切试剂（1）酶切缓冲液：一般公司会给你的说明书中，告诉你用哪种缓冲液，如果是单酶切，按照说明书上提示即可。

要是双酶切，原则是先找两种酶有没有可以共用的缓冲液，最好两种酶同时酶切比较省事。

酶切注意事项嘿，朋友们！今天咱来聊聊酶切那些事儿。

酶切啊，就像是一场精细的手术，可不能马虎哟！你想想看，酶就像是一把特别的小剪刀，要在特定的地方把 DNA 咔嚓剪开。

这可不是随便乱剪就行的，要是剪错了地方，那可就糟糕啦！就好比你要剪一件衣服，得找对位置剪，不然好好的衣服不就毁了嘛。

首先呢，你得选对酶。

不同的酶有不同的脾气和喜好呢，有的喜欢这个序列，有的喜欢那个序列。

所以啊，在开始之前，一定要好好研究清楚，可别瞎选哟！这就跟找对象似的，得找个合适的，不然相处起来多别扭呀。

然后呢，反应条件也很重要。

温度啦、pH 值啦，这些都得把握好。

温度太高，酶可能就被热坏啦；温度太低，酶可能又懒得干活。

pH 值不合适的话，酶也会不高兴的哟。

这就像人一样，在舒服的环境里才愿意好好工作嘛。

还有啊，酶切的时候用量也得注意。

用少了吧，切不完全；用多了吧，又浪费。

这就跟做菜放盐似的，放少了没味道，放多了又咸得没法吃。

再有就是反应时间啦。

太短了可能没切完，太长了又怕酶把不该切的地方也给切了。

这就像跑步比赛，跑太快容易摔倒，跑太慢又赢不了比赛呀。

另外，可别小瞧了那些杂质哦。

一点点杂质都可能影响酶切的效果。

就好像一碗汤里掉进了一粒沙子，那喝起来感觉可就差远啦。

而且呀，做实验的时候一定要仔细再仔细。

别毛手毛脚的，把试剂弄洒了或者搞错了顺序，那可就前功尽弃咯。

这就像搭积木，一步错步步错呀。

总之呢，酶切虽然看似简单，里面的学问可大着呢！大家一定要认真对待，多积累经验，这样才能保证实验的成功呀。

可别不当回事儿，不然到时候哭都没地方哭去！酶切可是很重要的一步，它关系到后续的实验能不能顺利进行呢。

所以呀，大家一定要好好记住这些注意事项，让我们的酶切实验顺顺利利的，加油吧！原创不易，请尊重原创，谢谢!。

酶切常见问题限制性内切酶酶切的常见问题及解决⽅法，个⼈觉得总结得很好，特转贴供本供⼤家分享。

酶切出现问题，先看内切酶说明书，相应试剂公司⽬录。

不同公司出产的内切酶，菌株来源、制备⼯艺、纯度活⼒、酶切活性优化可能不同，酶切效果也有差别。

可在上⾯找到酶单位定义、保存条件、酶切体系[buffer及与其它酶双切的buffer等]、酶切反应温度[有些酶是在50、55或30等温度下反应的]、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活可能因素、保护性碱基，同尾酶、同裂酶等等。

1. 酶切不开或不完全1.1 质粒问题纯度差或残留酶切抑制物最为常见。

杂蛋⽩存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制物常见酚、盐、⼄醇等。

[重新提DNA，使⽤可靠试剂盒或可靠⼿⼯提取试剂]1.2 酶的问题：确认内切酶有效 [很多内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，可⽤。

确认酶切效果不好，做标记，更换] 。

【题外话：⽤内切酶注意】a. 内切酶如⽆特殊要求，保存-20~-30度。

并⾮越低越好，酶通常是保存在50％⽢油缓冲液中，温度过低时，酶会发⽣冻结（运输过程例外，由于酶需要低温运输，所以⽅便的情况下是使⽤⼲冰，酶会冻结，但冻结次数有限，相对是⼀种⽐较好的选择），如果是经常使⽤的话，酶会被反复冻融，从⽽降低了活性。

当然如果温度过⾼，呵呵，你就⾃⼰想去吧。

b. 酶在使⽤时应置于冰盒中取酶。

这点⼤家都清楚，不过多强调也没坏处。

因为实验室有些同学，酶取出后是放在冰盒上的，但有两点忽略了：拿酶的时候，⼿不是抓着管⼦上端，⽽握在管⼦的底部，相当于⽤⼿在给酶进⾏加热；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的时候，还是将酶拿出来。

偶尔⼀次没有⼤碍，反复如此，可能会影响酶活。

c. 酶使⽤完后应尽快旋紧盖⼦。

有时我们可以发现，即使是-20~-30度放置，酶仍然会冻结。

个⼈认为的可能原因是由于在配置酶切反应时，酶管的盖⼦在较长时间的开着，⽢油会吸取空⽓中的⽔分，对于常⽤的⼤包装的酶有时就会出现冻结现象。

质粒dna的酶切注意事项
在进行质粒DNA的酶切实验时，需要注意以下事项：
1. 选择合适的酶：根据质粒DNA上的目标片段的长度和序列选择适合的限制性内切酶。

确保酶的活性和适应温度等符合实验要求。

2. 控制酶切反应条件：酶切反应通常需要在特定的缓冲液中进行，确保缓冲液中的离子浓度、pH、温度等参数符合酶的要求，以保证酶的活性和稳定性。

3. 质粒DNA的纯度和浓度：使用纯度较高且浓度适当的质粒DNA进行酶切实验，以避免其他污染物的干扰或质粒DNA浓度过低的问题。

4. 酶切反应时间和温度：根据酶的特性和实验要求，控制酶切反应的时间和温度。

一般情况下，酶切反应需要在适宜的温度下进行一定时间，以保证完全的酶切反应。

5. 酶切后的处理：酶切反应结束后，需进行适当的处理。

如加入加热退火酶、磷酸酶等对酶活进行灭活；对反应产物进行凝胶电泳分析；采用柱层析、酚/氯仿提取等方法纯化目标片段等。

6. 实验操作的严谨性：酶切实验需要操作具有较高的严谨性和技巧性，避免因操作失误引入额外的误差。

在操作过程中，应保持实验环境的清洁，避免外源性
污染。

7. 安全措施：在进行酶切实验时，应遵守实验室的安全措施，包括佩戴实验手套、开启实验室排风设备等，以保障个人和实验室安全。

做酶切时要注意些什么？做酶切时要注意些什么？酶切后跑电泳无条带可能是什么原因？（排除电泳因素）参考见解：一、建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。

通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg 已纯化好的DNA。

如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。

二、选择正确的酶不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。

识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。

假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。

内切酶的产物可以是粘端的（3’或5’突出端），也可以是平端的片段。

粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。

相关信息参见目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。

三、酶内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。

酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。

酶的用量视在底物上的切割频率而定。

例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。

参见目录第244和264之"切割质粒DNA"和"包埋法切割DNA"。

四、 DNA待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。

DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。

关于甲基化的内容，参见第252页至253页之甲基化相关内容。

五、缓冲液对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。