L-精氨酸转运体CAT-2B siRNA干扰载体的构建及鉴定(肠外肠内投稿)
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靶向L-精氨酸转运体CAT-2 siRNA表达载体的构建及鉴定黄传江黄骞吴性江赵允召罗冰* 李宁南京大学医学院临床学院解放军普通外科研究所，临床中心实验科*，江苏南京210002 （南京军区南京总医院）摘要：目的：构建CAT-2的靶向小分子干扰RNA（siRNA）表达载体质粒并测序鉴定，为下一步研究靶向siRNA对CAT-2蛋白表达和L-argine/iNOS/NO通路的影响建立基础。
方法：根据L-精氨酸转运体CAT-2的mRNA序列及siRNA设计原则并经BLAST比对，设计合成4对siRNA 寡聚单链DNA，退火成双链dsDNA，用载体构建试剂盒BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP进行重组质粒构建，将4对dsDNA分别插入到siRNA表达载体pcDNA™6.2-GW/EmGFPmiR中构建4个siRNA表达质粒，并转化至感受态细菌DH5α。
筛选阳性克隆并提取重组质粒后测序分析。
结果：CAT-2的siRNA重组载体质粒测序结果证实表达载体构建成功。
结论：L-精氨酸转运体CAT-2 siRNA表达载体质粒成功构建，为下一步研究靶向siRNA对CAT-2蛋白表达和L-arg/iNOS/NO通路的影响建立基础。
关键词：L-精氨酸；CAT-2；siRNAConstruction and Identification of L-arginine Transporter CAT-2siRNA Recombinant PlasmidHUANG Chuan-jiang , HUANG Qian, LUO Bing, WU Xing-jiang，Li Ning （Research Institute of General Surgery, Department of Clinical Laboratory*, Clinical School of Medical College of Nanjing University/Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command, PLA, Nanjing 210002,jiangsu,China）[Abstract ]Objective: To construct and identificate the recombinant plasmid expression vector of cationic amino acid transporter-2 siRNA, and establish a foundation for researching the target siRNA influencing on the expression of CAT-2 and L-arginine/iNOS/NO pathway. Methods: According to the mRNA sequences of L-arginine transporter CAT-2, siRNA design principles and BLAST Comparison, four pairs single-strand DNA of siRNA were designed and synthesized. annealing into double-strand DNA, the four pairs of double-strand DNA of the siRNA were inserted into siRNA expression vector pcDNA ™ 6.2-GW/EmGFPmiR to construct siRNA expression plasmid with vector construction kit BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP, and transfected the recombinant plasmid into the competent Escherichia coli DH5α. selected positive Escherichia coli DH5α, extracted the recombinant plasmids, and finally identificated the sequences of the recombinant plasmids. Results: The sequencing resultsof the recombinant plasmid expressing CAT-2 siRNA confirmed construction successfully. Conclusion:The the recombinant plasmids vectors expressing L-arginine transporter CAT-2 siRNA are successfully constructed, which establish a foundation for researching the target siRNA influencing on the expression of CAT-2 and L-arginine/iNOS/NO pathway.Key words：L-arginine，CAT-2，siRNA基金项目：国家自然科学基金资助项目(批准号：30801089)作者简介：黄传江（1984-），男，江苏沭阳人，医学硕士研究生，从事普通外科专业。
通讯作者：吴性江，E－mail：wxj-wxj@0 引言左旋精氨酸（L-arginine，L-Arg）跨膜转运最重要的转运体是Na + 非依赖、pH 不敏感的转运系统y+。
转运系统y+主要有阳离子氨基酸转运体-1（Cationic amino acid transporter-1，cat-1）和阳离子氨基酸转运体-2（cat-2）两基因编码的CAT-1和CAT-2两种蛋白组成[1,2]。
生理状态下，CA T-2的表达及其低下，但是在病理生理情况下，例如脓毒症、急性呼吸性窘迫综合症等，在微生物、微生物产物（如LPS）、细胞因子（IFN-γ、IL-1、TNF-α等）等因素作用下，诱导CAT-2大量表达[3,4,5]。
L-Arg是iNOS合成NO的唯一底物，目前的研究表明脓毒症时用于iNOS合成NO的L-Arg的跨膜转运主要由CAT-2介导完成[6]，大量研究表明NO过度异常产生在脓毒症及脓毒症性休克中起着非常重要的作用[7,8] 。
因此，CAT-2对脓毒症时NO过量生成具有重要作用。
RNA 干扰( RNA interference, RNAi)是利用具有同源性互补序列的双链RNA 来诱发序列特异性的转录后基因沉默现象[9]。
RNAi可以通过人为的引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA ,诱导内源靶基因mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。
近年来RNA干扰技术在哺乳类动物中的应用迅速深入，因载体介导的RNAi能引发更为持久的基因沉默而备受关注[10]。
构建好的载体转染细胞后可以稳定表达siRNA，并可用于长效抑制的研究[11]。
本实验根据CAT-2基因设计出4对siRNA，以期成功构建L-精氨酸转运体CAT-2 siRNA表达载体，为后续实验打下基础。
1材料和方法1.1质粒和菌株pcDNA™6.2-GW/EmGFPmiR质粒及DH5a菌株购自英潍捷基（上海）贸易有限公司。
1.2主要试剂与仪器载体构建试剂盒BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP，pcDNA™6.2-GW/EmGFPmiR的反向测序引物5′- CTCTAGATCAACCACTTTGT -3′，均购自英潍捷基（上海）贸易有限公司；LB培养基，普通质粒小抽试剂盒（凯基生物有限公司）；低温高速离心机；恒温摇床。
1.3方法1.3.1 siRNA靶向序列设计及合成根据基因库收录的小鼠CAT-2基因全序列NM_007514.3和NM_001044740.1，在两个的同源区设计3个干扰序列，另外在NM_001044740.1的特异区另外设计1条干扰序列，作为靶向分子，采用通过BLOCK-iT™ RNAi Express数据库提交基因信息选择干扰位点（干扰位点序列均经过Blast检验靶基因的特异性），根据siRNA的一般设计原则及研究者经验，选择起始密码子100 nt后，G/C含量在30%~52%，基本无内部重复序列，设计并合成4对两段oligo DNA退火形成表达siRNA的ds DNA（如表1），并在线与基因库小鼠来源的基因序列进行BLAST比对，选择同源性小的4对序列由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。
表1. siRNA 寡聚单链DNA序列（附阴性对照序列）oligo名称寡聚单链DNA序列5’to 3’pSilencer-CAT2-1-F TGCTGAGAAGAGCCAGGCTCCAGGCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGCCTGGACTGGCTCTTCT pSilencer-CAT2-1-R CCTGAGAAGAGCCAGTCCAGGCTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAGCCTGGAGCCTGGCTCTTCTC pSilencer-CAT2-2-F TGCTGAAGACTTGTTGATAAGGCGCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGCGCCTTCAACAAGTCTT pSilencer-CAT2-2-R CCTGAAGACTTGTTGAAGGCGCAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTGCGCCTTATCAACAAGTCTTC pSilencer-CAT2-3-F TGCTGTGTCCTTGCAGCATGGTGACCGTTTTGGCCACTGACTGACGGTCACCACTGCAAGGACA pSilencer-CAT2-3-R CCTGTGTCCTTGCAGTGGTGACCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGGTCACCATGCTGCAAGGACAC pSilencer-CAT2-4-F TGCTGTAGCATAGATTACACGAGGCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGCCTCGTAATCTATGCTA pSilencer-CAT2-4-R CCTGTAGCATAGATTACGAGGCAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTGCCTCGTGTAATCTATGCTAC pSilencer-control-F TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT pSilencer-control-R CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTTC1.3.2重组质粒载体构建将4对寡聚单链DNA退火成双链。
