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dna分子标记技术及其在植物育种中的应用
DNA分子标记技术是一项挖掘植物DNA组的分子先导技术，它大
大提高了植物育种的效率。
该技术可以快速辨别特定品种的遗传信息，为植物育种和改良提供精确有效的工具。
DNA分子标记技术是由扩增子链式反应（PCR）和后续诸多分析技术（如电泳分析、杂交分析、SNP分析等）构成的。
PCR 可以用来检测和分析特定 DNA 的序列，它可以将一个极小的 DNA 方面成期，从而
使植物育种避免复杂和费时的繁殖过程。
这种技术还可以跨区域筛选
具有抗逆性的基因，从而获得超高产的品种，提高植物适应恶劣环境
的能力。
借助DNA分子标记技术，植物育种者可以快速准确的筛选目标遗
传特性，优化作物基因池，缩短作物改良的周期，从而实现作物质量
和产量的提升，满足社会逐渐增长的作物需求。
分子标记技术的类型及其原理08农生1班陈耀光 200830010403所谓分子标记就是基于基因组DNA 存在极其丰富的多态性而发展的一类可以直接反映生物个体间DNA 水平上差异的新型的遗传标记方法。
在遗传学发展过程中，先后出现了形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记，其中以分子标记最为理想、可靠，因为DNA分子中碱基的缺失、插入、易位、倒位或是长短与排列不一的重复序列等产生的差异，都可以通过分子标记进行检测。
DNA 分子标记较以往的形态标记其优越性表现在：(1)以核酸为研究对象，不受季节、环境限制，不存在基因表达与否的问题，也没有组织或器官特异性；(2)数量的丰富性，遍及整个基因组，标记的数量几乎是无限的；(3)多态性高，自然存在丰富的等位变异；(4)许多标记表现为共显性，能很好地鉴别纯合基因型与杂合基因型；(5)检测手段简便、快速，并且重复性好；(6)既不对目标形状的表达造成影响，也不会与不良性状之间产生必然的关联。
1 分子标记的类型及其原理分子标记技术自诞生以来，短短的几十年时间中得到突飞猛进的发展，至今被发展和利用的分子标记技术已有二十余种，为不同研究领域提供了有效的技术手段，同时也发挥着至关重要的作用。
目前，根据对DNA 多态性检测手段和所应用序列范围的不同，对部分分子标记技术分类如下。
1.1 基于全基因序列的分子标记RFLP (restriction fragment length polymorphism,限制性片段长度多态性)：RFLP 作为最早发展的分子标记技术由Grozdicker 等于1974 年创建，并由Bostein 等再次提出。
RFLP 技术的出现开创了直接在DNA 水平上进行遗传研究的新时代。
其基本原理是：基因组DNA中限制性内切酶所识别的序列由于出现碱基变化而致使酶切位点的数量也变化，从而使酶切片段长短发生差异产生长度多态性。
利用特定的限制性内切酶切割不同个体的基因组DNA，由于不同个体中酶切位点的差别就得到了长短相异的片段DNA，电泳分离后，借助Southern 杂交将DNA 片段转移至硝酸纤维素膜上，将具有放射性标记的探针与膜上的片段杂交，通过放射自显影技术就可以获得显示物种特异性的多态性图谱。
DNA分子标记技术的研究与应用一、本文概述本文旨在对DNA分子标记技术的研究与应用进行全面的概述。
DNA分子标记技术作为现代分子生物学领域的一项重要工具，已经在生物学研究、遗传育种、疾病诊断等多个领域展现出广泛的应用前景。
本文首先介绍了DNA分子标记技术的基本概念、发展历程以及主要类型，包括限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）和单核苷酸多态性（SNP）等。
接着，文章详细阐述了这些技术在不同领域中的具体应用，包括基因克隆、基因定位、遗传图谱构建、物种亲缘关系分析、基因表达和调控研究等。
本文还讨论了DNA分子标记技术在实践应用中面临的挑战和未来发展趋势，如高通量测序技术的结合、大数据分析的利用以及生物信息学的进一步发展等。
通过本文的综述，旨在为相关领域的研究人员和技术人员提供一个全面、深入的了解DNA分子标记技术的平台，以促进该技术的进一步发展和应用。
二、DNA分子标记技术的基本原理与类型DNA分子标记技术是一种直接以DNA多态性为基础的遗传标记技术，其基本原理在于利用DNA分子在基因组中存在的丰富的多态性，通过特定的技术手段将这些多态性转化为可识别的遗传信息，从而实现对生物个体或群体的遗传差异进行精确分析。
这种技术以其高度的准确性、稳定性和多态性，在生物学研究、遗传育种、种质鉴定、基因定位、分子育种、疾病诊断等领域中得到了广泛应用。
基于DNA-DNA杂交的分子标记技术：这类技术主要包括限制性片段长度多态性（RFLP）和DNA指纹技术。
它们通过比较不同个体或群体间DNA片段的杂交信号差异，揭示出基因组中的多态性。
这类标记具有稳定性高、共显性遗传等特点，但操作复杂、成本较高。
基于PCR的分子标记技术：随着聚合酶链式反应（PCR）技术的出现和发展，基于PCR的分子标记技术应运而生。
这类技术包括随机扩增多态性DNA（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）和序列特征化扩增区域（SCAR）等。
DNA分子标记技术概述1. 引言DNA分子标记技术是现代生物学和医学领域中非常重要的一项技术。
它可以通过特定的标记方法，在DNA分子上进行特异性地标记，从而实现对DNA序列的检测、定位和分析。
本文将对DNA分子标记技术进行全面、详细、完整和深入地探讨。
2. DNA分子标记技术的原理2.1 标记物选择在进行DNA分子标记之前，需要选择合适的标记物。
常用的DNA分子标记物包括荧光染料、辣根过氧化物酶标记物、生物素标记物等。
这些标记物具有不同的优势和适用范围，可以根据具体实验需求来选择合适的标记物。
2.2 标记方法DNA分子标记方法有多种，常用的包括直接标记法和间接标记法。
直接标记法是将标记物直接连接到DNA分子上，常用于荧光标记。
间接标记法是通过先引入标记物、再进行特定的反应来实现标记，常用于酶标记和生物素标记等。
2.3 标记效率和准确性DNA分子标记技术的效率和准确性是衡量其优劣的重要指标。
高效率和准确性可以保证实验结果的可靠性和准确性。
因此，在选择标记物和标记方法时，需要考虑到其标记效率和准确性，以及对实验结果的影响。
3. DNA分子标记技术的应用领域3.1 DNA测序和基因组学研究DNA分子标记技术在DNA测序和基因组学研究中有广泛的应用。
通过标记技术，可以对DNA序列进行检测和定位，从而实现对基因组的研究和分析。
3.2 分子诊断和疾病检测DNA分子标记技术在分子诊断和疾病检测中起到关键作用。
通过标记技术，可以检测和分析与疾病相关的基因或基因突变，从而实现早期诊断和治疗。
3.3 人类遗传学研究DNA分子标记技术对人类遗传学研究具有重要意义。
通过标记技术，可以进行人类遗传多样性和遗传变异的研究，为疾病发生机制和个体差异提供重要的参考和依据。
3.4 动植物遗传改良DNA分子标记技术在动植物遗传改良中有广泛应用。
通过标记技术，可以进行动植物基因分型和基因定位，为遗传改良工作提供重要的科学依据和技术支持。
常用DNA分子标记类型和特点DNA分子标记是一种广泛应用于生物学研究和诊断领域的技术，用于识别、检测和定量目标DNA序列。
常见的DNA分子标记类型包括荧光染料、酶和放射性同位素等。
每种标记类型都具有其独特的特点和应用场景。
荧光染料是DNA分子标记中最常用的类型之一、它们通过在DNA分子上附着荧光染料，使其在荧光显微镜下可见。
荧光染料具有多种颜色和化学性质，可用于多重标记和多个目标的同时检测。
其主要特点包括：1.高灵敏度：每个荧光染料分子都有较强的荧光信号，因此可以在微量样品中进行检测。
2.高选择性：荧光染料可以针对目标DNA序列进行选择性标记，从而实现目标分子的准确检测。
3.高兼容性：荧光染料可以与不同的DNA分析方法兼容，如凝胶电泳、荧光定量PCR等。
酶也是常用的DNA分子标记类型之一、通过将酶与DNA标记物结合，可以通过酶的催化反应产生可定量的信号。
常用的酶标记包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
其主要特点包括：1.高灵敏度：酶催化反应可以在大量酶底物的参与下放大信号，从而提高检测的灵敏度。
2.稳定性：酶标记的DNA可以在各种条件下稳定存在，并且可以长期保存。
3.可视性：酶催化反应可以产生可见的颜色或发光信号，从而直观地观察到标记物。
放射性同位素是DNA分子标记的传统方式之一、通过将放射性同位素与DNA标记物结合，可以通过放射性测量来定量目标DNA序列。
1.高灵敏度：放射性测量可以实现非常低浓度目标DNA的检测。
2.高特异性：放射性同位素标记DNA具有非常高的特异性，可以准确检测目标序列。
3.长期保存：放射性同位素标记的DNA可以长期保存，方便未来的回溯和再分析。
虽然放射性同位素标记具有较高的灵敏度和特异性，但其使用需要特殊的设备和技术，并且存在较高的辐射风险，因此在现代实验室中较少使用。
总结而言，DNA分子标记在生物学研究和诊断中起着至关重要的作用。
不同类型的DNA标记具有各自的特点和应用场景，研究人员可以根据实验需求选择合适的标记方式，以便实现高灵敏度、高特异性和可视化的目标DNA检测。
DNA分子标记技术在药用植物研究方面的应用
一、绪论
药用植物的研究对于促进人类健康有着重要的作用。
在现代药学的发展中，DNA分子标记技术已经成为一种重要的技术，它可以帮助我们更好地利用药用植物，也可以更好地了解药用植物的分子基础。
本文将从以下几方面探讨DNA分子标记技术在药用植物研究方面的应用：
1、DNA分子标记技术的基本原理
2、DNA分子标记技术的种类
3、DNA分子标记技术在药用植物研究中的应用
4、DNA分子标记技术的发展前景
二、DNA分子标记技术的基本原理
DNA分子标记技术是一种利用DNA来识别和定位细胞或分子的技术。
它可以通过检测特定的DNA序列，从而让研究者更好地了解一个基因的结构、功能以及其与其他基因周围交互的方式。
DNA分子标记技术可以根据特定的DNA片段的存在或缺失来鉴定它们在特定的细胞内是否存在，从而给出有关它们起作用的生物过程的其中一种细胞活性的信号。
三、种类
1、RFLP（限制性片段长度多态）是最常使用的DNA分子标记技术之
一、它的原理是对特定DNA片段进行限制性酶切，并使用电泳技术对酶切产物进行纯化，从而产生具有特定长度的DNA条带。
借助于这种特定的DNA条带长度，研究者可以定位特定的DNA片段，进而进行基因定位。
2、RAPD（随机扩增多态位点）也是一种常用的DNA分子标记技术。
DNA分子标记种类及相应的优缺点摘要： 对RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR 等常用的DNA 分子标记技术以及其他几种新兴的标记技术( SNP、EST 等) 的原理、特点进行了综述,并对各自的优缺点进行了探讨。
关键词：DNA分子标记优缺点分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。
分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。
每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。
植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。
②不受环境影响。
因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。
③标记数量多,遍及整个基因组。
④多态性高,自然存在许多等位变异。
⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。
⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。
⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。
因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。
1. 1 第1 代分子标记1.1. 1 RFLP 标记技术。
1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术 。
RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。
优点：RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于构建遗传连锁图。
缺点：在进行RFLP 分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。
另外,RFLP 对DNA 多态性检出的灵敏度不高,RFLP 连锁图上还有很多大的空间区。
1.1. 2 RAPD 标记技术。
为了克服RFLP 技术上的缺点,Williams等于1990 年建立了随机扩增多态DNA (Randomamplified polymorphic DNA ,RAPD) 技术,由于其独特的检测DNA 多态性的方式使得RAPD 技术很快 渗透于基因研究的各个领域。
RAPD 是建立于PCR 基础之上的分子标记技术,基本原理是利用一个随机引物(8～10 个碱基) 通过PCR 反应非定点地扩增DNA 片段,然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA 多态性研究。
对任一特定引物而言,它在基因组DNA 序列上有其特定的结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA 片段插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物的数量和大小发生改变,表现出多态性。
优点：与RFLP 相比,RAPD 技术简单,检测速度快,DNA 用量少,实验设备简单,不需DNA 探针,设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析,不依赖于种属特异性和基因组的结构,合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,而且不需要同位素,安全性好。
缺点：当然,RAPD 技术受许多因素影响,实验的稳定性和重复性差,首先是显性遗传,不能识别杂合子位点,这使得遗传分析相对复杂 ,在基因定位、作连锁遗传图时,会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性属特异性和基因组的结构,合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,而且不需要同位素,安全性好。
当然,RAPD 技术受许多因素影响,实验的稳定性和重复性差,首先是显性遗传,不能识别杂合子位点,这使得遗传分析相对复杂 ,在基因定位、作连锁遗传图时,会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降;其次,RAPD 对反应条件相当敏感,包括模板浓度、Mg2 +浓度,所以实验的重复性差 。
1. 1. 3 AFLP 标记技术。
扩增片段长度多态技术(AFLP) ,又名限制片段选择扩增技术(Selective restriction fragmentamplifi2cation ,SRFA) ,于1993 年由荷兰KEYGENE 公司的Zabean 和Vos 等发明,并已申请专利。
AFLP 是近年来迅速发展起来的一种分子标记技术,它将基因组DNA 用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头(与酶切位点互补) 连接起来,并通过5′端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA 片段,从而形成指纹图谱的分子标记技术。
AFLP 指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传。
优点：它兼具RAPD 与RFLP 的优点,有较高的稳定性,用少量的选择性引物能在较短时间内检测到大量位点,并且每对引物所检测到的多个位点都或多或少地随机分布在多条染色体上,各染色体上AFLP 标记的数目与染色体长度呈正相关( r = 0. 501) ,而一对引物获得的标记涉及的染色体数与标记数呈正相关( r = 0. 826) 。
因此,通过少量效率高的引物组合,可获得覆盖整个基因组的AFLP 标记 。
目前,AFLP 作为一种高效的指纹技术,已在遗传育种研究中发挥它的优势。
缺点：不过也有研究认为,AFLP 对基因组纯度和反应条件要求较高,另外用于遗传作图时,少数的标记与图谱紧密度有出入。
此外, 在RAPD 和RFLP 技术基础上建立了SCAR(Sequence characterize damplified regions ,序列特异性扩增区域) 、CAPS(Cleaved ampli2fied polymorphic sequence ,酶切扩增多态序列) 和DAF(DNA am2plified fingerprints ,DNA 扩增指纹) 等标记技术 。
这些技术的出现,进一步丰富、完善了第1 代分子标记技术,增加了人们对DNA 多态性的研究手段。
1. 2 第2 代分子标记1. 2. 1 SSR 标记技术。
在真核生物基因组中存在许多非编码的重复序列,如重复单位长度在15～65 个核苷酸的小卫星DNA(Minisatellite DNA) ,重复单位长度在2～6 个核苷酸的微卫星DNA (Microsatellite DNA) 。
小卫星和微卫星DNA 分布于整个基因组的不同位点。
由于重复单位的大小和序列不同以拷贝数不同,从而构成丰富的长度多态性。
Moore 等于1991 年结合PCR 技术创立了SSR (Simple sequence repeat ,简单重复序列) 标记技术。
SSR 也称微卫星DNA ,是一类由几个(多为1～5 个) 碱基组成的基序串联重复而成的DNA 序列,其中最常见的是双核苷酸重复,即(CA) n和(TG) n ,每个微卫星DNA 的核心序列结构相同,重复单位数目10～60 个,其高度多态性主要来源于串联数目的不同。
不同遗传材料重复次数不同,导致了SSR 长度的高度变异性,这一变异性正是SSR 标记产生的基础。
SSR 标记的基本原理:根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物,通过PCR 反应扩增微卫星片段。
由于核心序列重复数目不同,因而扩增出不同长度的PCR 产物,这是检测DNA 多态性的一种有效方法。
微卫星序列在群体中通常具有很高的多态性,而且一般为共显性,因此是一类很好的分子标记。
目前已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠、水稻、小麦、玉米等物种的染色体遗传图谱。
优点：这些微卫星标记已被广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析或品种鉴定、农作物育种、进化研究等领域。
此外,SSR 标记不仅能够鉴定纯合体和杂合体,而且结果更加可靠,方法简单,省时省力。
1. 2. 2 ISSR 标记技术。
ISSR 即内部简单重复序列,是一种新兴的分子标记技术。
1994 年Zietkiewicz 等对SSR 技术进行了发展,建立了加锚微卫星寡核苷酸(Anchored microsatellite oligo nucleotides) 技术 。
他们用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物,即在SSR 的5′端或3′端加上2～ 4 个随机选择的核苷酸,这可引起特定位点退火,从而导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR 扩增。
这类标记又被称为ISSR ( Inter2simple sequence repeat ) 、ASSR(Anchored simple sequence repeats) 或AMP2PCR 。
在所用的两翼引物中,可以一个是ASSR 引物,另一个是随机引物。
如果一个是5′端加锚的ASSR 引物,另一个是随机引物,则被称为RAMP 技术[19] 。
用于ISSR2PCR 扩增的引物通常为16～18 个碱基序列,由1～4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA 中SSR 的5′或3′末端结合,通过PCR 反应扩增SSR 之间的DNA 片段。
优点：SSR 在真核生物中的分布是非常普遍的,并且进化变异速度非常快,因而锚定引物的ISSR2PCR 可以检测基因组许多位点的差异。
与SSR2PCR 相比,用于ISSR2PCR 的引物不需要预先的DNA 测序,也正因如此,有些ISSR 引物可能在特定基因组DNA 中没有配对区域而无扩增产物,通常为显性标记,呈孟德尔式遗传,且具有很好的稳定性和多态性。
1. 3 第3 代分子标记1. 3. 1 SNP 标记技术。
单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism ,SNP) 被称为第3 代DNA 分子标记,是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异,这种差异包括单个碱基的缺失或插入,更常见的是单个核苷酸的替换,且常发生在嘌呤碱基(A 与G) 和嘧啶碱基(C 与T) 之间。
SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异,被认为是应用前景最好的遗传标记。
目前,已有2 000 多个标记定位于人类染色体上,在拟南芥上也已发展出236 个SNP 标记。
在这些SNP 标记中大约有30 %包含限制性位点的多态性。
优点：检测SNP 的最佳方法是DNA 芯片技术,最新报道的微芯片电泳(Microchip electrophoresis) ,可以高速度地检测临床样品的SNP ,它比毛细管电泳和板电泳的速度可分别提高10 和50倍 。
