郑州大学2008年博士学位论文

郑州大学2008年博士学位论文SV40T抗原基因在转基因小鼠胃壁细胞特异性表达及生物学特性研究SV40T抗原基因在转基因小鼠胃壁细胞特异性表达及生物学特性研究博士研究生陈辉导师张钦宪郑州大学基础医学院郑州450052摘要胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居各种恶性肿瘤之首位。

近年来，随着分子生物学、免疫学、细胞生物学、病理学等高新技术的迅速发展，国内外对胃癌的基础和防治研究取得了长足进步。

但这些研究大部分是在临床基础上对胃癌患者的回顾性研究，在时间和空间上存在许多局限性。

如要验证各种可疑的致癌、促癌因素，阐明胃癌发生的发病机制，探讨抗癌药物的作用机制并对其进行筛选，则必须建立胃癌动物模型。

人类疾病动物模型在医学发展中起着十分重要的作用。

多年来一般采用诱变剂处理的方法来筛选建立肿瘤动物模型，但此方法诱变发生的不确定性、肿瘤产生的随机性、动物无法在整体水平产生生物学效应等缺点，使其应用受到一定的限制。

而转基因动物模型则克服了以上缺点，能在动物整体水平观察所转入基因的生物学效应，探讨其在动物体内的组织特异性表达或调控过程，为癌基因作用机理、癌细胞发生、发展过程、基因表达调控等方面研究提供宝贵资料，并为建立人类疾病动物模型开创新的科研途径。

转基因动物(transgenic animal)是用基因工程技术将外源基因通过生殖细胞或早期胚胎导入动物胚胎染色体基因组中，使之稳定整合并传递给后一代的动物。

转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，在医学、分子生物学、分子遗传学、畜牧兽医学等研究领域有无限广阔的前景。

目前转基因技术大多采用受精卵细胞的显微基因注射技术或电转移技术，其操作包括外源基因重组载体的构建、受精卵细胞的采集、外源基因的显微注射、注射后受精卵(或胚胎)的移植、转基因小鼠的检测等步骤。

国外已建立了人遗传病和癌基因的转基因动物模型，用于肿瘤和遗传学研究，但这方面的研究在我国尚属起步阶段。

转基因动物模型研究中广泛采用的SV40 (Simian Virus 40, SV40)属乳多郑州大学2008年博_l:学位论文SV40T抗原基因在转基因小鼠胃壁细胞特异性表达及生物学特性研究空病毒科(papo va vi ri dae)多瘤病毒属(pol yoma vi rus)，在病毒DNA复制前编码2种转化蛋白，即大T抗原(large T antigen, Tag)和小T抗原(small t antigen,tag) o Tag是一种磷酸化蛋白，在细胞转化中起决定性作用，为细胞转化所必需。

tag是非磷酸化蛋白，对细胞转化并非必需，但可起加强作用。

SV40基因编码的大T抗原己广泛应用于转基因动物肿瘤模型的建立。

如Santarelli等将SV40T基因导入小鼠细胞构建了小鼠乳腺癌动物模型;Brister等将SV40T基因和含金属筑基基因的融合基因质粒导入小鼠生殖系产生的转基因小鼠成年后可发生脑脉络从乳头状瘤，Hochman建立了眼部肿瘤转基因小鼠模型。

胃壁细胞是胃底腺的主要细胞类型之一，能合成和分泌盐酸，从而刺激胃肠道内分泌细胞和胰液的分泌。

H丫K'ATP酶(H丫K"ATPase )基因在胃壁细胞中特异性表达，和胃酸的合成与分泌有着直接关系。

Gordon建立了在胃壁细胞中特异性表达人生长激素(human growth hormone, hGH )、内在因子(intrinsic factor,INF)的转基因动物模型，为研究胃薪膜上皮细胞的发生、演化过程奠定了基础。

我们构建胃壁细胞H丫K'ATPase亚基启动子驱动下的SV40T基因的真核表达载体，并将其导入小鼠受精卵细胞建立转基因动物模型。

该模型动物将实现SV40T基因在胃壁细胞中的特异性表达，并诱发小鼠胃壁细胞增生，胃薪膜发生癌前病变、癌变等一系列病理性改变，从而为胃癌发生机理的研究、胃癌的诊断与治疗、胃癌特异性药物的筛选提供十分有用的实验动物模型。

方法一、SV40T基因胃壁细胞特异性表达载体的构建1.扩增H'/K'ATPase亚基启动子:采用酚一氯仿法从小鼠肝细胞中提取基因组DNA, PCR扩增H'/K'ATPase亚基启动子，PCR产物命名为HK.2. pMT/HK的制备:将PCR产物纯化回收后与pMT18一载体相连，转化感受态E.coli DN5Q细胞，从转化平板上随机挑取8个单菌落，37℃摇菌过夜培养，取菌液提取质粒DNA, Xba I , BamH I双酶切鉴定出阳性克隆，命名为pMT/HK并进行测序鉴定。

3.构建pcDNA3. 1 /HK质粒:将pMT/HK用Xba I, BamH I双酶切，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收约1060bp的DNA片段。

将回收产物与用Xba I, BamH I双酶切的pcDNA3. 1(一)质粒连接，转化感受态DH5 a细胞，从转化平板上挑单菌落，郑州大学2008年博士学位论文SV40T抗原基因在转基因小鼠胃壁细胞特异性表达及生物学特性研究提取质粒DNA，限制性内切酶消化鉴定出阳性重组克隆，记作pcDNA3. 1 /HK o4.构建pcDNA3.l/HKSV质粒:将pLITAg(含SV40T基因片段)质粒用BamH I酶切，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收约2700bp的DNA片段，将回收产物与用Bamff I 酶切的pcDNA3. 1/HK连接，转化感受态细胞DH5 a，从转化平板上挑取单菌落，37℃摇菌过夜培养，取菌液提取质粒DNA，酶切鉴定重组体，并测序鉴定SV40T 基因插入的方向及DNA序列，插入方向正确的重组体记为pcDNA3.1/HKSV o5.构建pcDNA3. 1/SV质粒:将pLITAg质粒用BamH I酶切，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收约2700bp的DNA片段，将回收产物与用BamH I酶切的pcDNA3. 1(一)连接，提取质粒DNA，酶切鉴定重组体，经测序鉴定插入方向正确的重组体记为pcDNA3. 1/SV o二、特异性表达SV40T基因转基因小鼠的建立1.制备转基因用DNA:提纯pcDNA3.1/HKSV质粒DNA，用限制性内切酶Xba I,l(pn I双酶切。

反应产物用0.7%琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收试剂盒回收3. 7kbH'/K+ATPase亚基启动子//SV40T基因片断，用于显微基因注射。

2.准备结扎雄鼠、供体雌鼠、假孕雌鼠等实验动物，采集受精卵，进行受精卵雄原核的显微基因注射，将注射后形态良好的胚胎移植到假孕雌鼠输卵管中。

三、特异性表达SV40T基因转基因小鼠的鉴定与繁殖1. PCR检测转基因阳性首建鼠与Fl代仔鼠:剪取出生仔鼠尾尖，提取基因组DNA,PCR扩增鉴定转基因阳性首建鼠与F1代仔鼠。

2. Southern blot检测F1代转基因阳性鼠:取PCR检测阳性F1代鼠的肝组织，提取基因组DNA, Southern blot鉴定转基因阳性F1代仔鼠。

3. RT-PCR检测SV40T mRNA的表达:Trizol试剂盒提取68"首建鼠、未转基因B6阴性鼠胃及转基因阳性鼠胃、食管、十二指肠、盲肠、空肠、肝脏、心脏、肺、肾、脾、骨骼肌等组织的RNA，进行逆转录PCR，检测SV40T mRNA的表达。

4.免疫组化检测SV40T蛋白表达:取F1代阳性鼠与未转基因B6阴性鼠胃、食管、十二指肠、盲肠、小肠、肝脏、心脏、肺、肾、脾等组织进行石蜡包埋与常规切片，免疫组化检测SV40T抗原表达。

四、特异性表达SV40T基因转基因小鼠的生物学特性1. HE染色观察转基因鼠胃粘膜形态学改变:取F1代阳性鼠与未转基因B6阴性鼠郑州人学2008年博士学位论文SV40T抗原基因在转基因小鼠胃壁细胞特异性表达及生物学特性研究胃组织进行常规切片，HE染色后观察转基因鼠胃粘膜厚度与形态学改变。

2.透射电镜观测胃粘膜细胞亚显微结构的变化:取未转基因B6鼠与转基因阳性鼠的胃组织，固定、脱水、包埋、聚合、切片、染色后透射电镜观测胃粘膜壁细胞亚显微结构的变化。

3.小鼠胃液酸度值的测定:取未转基因B6鼠与阳性转基因鼠各8只，禁食24 h后，采用幽门结扎法收集胃内容物，离心分离胃液上清液，检测胃液PH值。

4. TUNEL实验检测细胞凋亡:取未转基因B6鼠与转基因阳性鼠的胃组织，常规操作制备石蜡切片，按TUNEL原位杂交试剂盒推荐方法进行细胞凋亡检测。

5.统计学分析:应用SPSS12. 0统计学软件进行统计处理，计量数据均用均数士标准差(z士:)表示，两组均数的比较采用t检验，多样本均数的比较采用方差分析，检验水准a二0.05.结果一、SV40T基因胃壁细胞特异性表达载体的构建1. pMT/HK质粒的构建:小鼠肝组织基因组DNA用引物PI, P:扩增得到H"/K'ATPase亚基启动子，扩增产物经lOg/L琼脂糖凝胶电泳可见约1060bp的DNA条带，与预期长度吻合。

构建的pMT/HK质粒用Xba I、BamH I双酶切电泳，可见到约1. 06kb与2. 6kb的两条DNA条带，与预期结果一致。

2. H'/K'ATPase亚基启动子DNA测序:pMT/HK测序显示，PCR扩增的H'/K'ATPase亚基启动子长度为1057bp。

测序结果与lorenz发表序列经NCBI网站的Blast 2 sequences对比分析，发现一501bp与一634bp之间均存在碱基重复序列，并且不同小鼠扩增产物测序以及与文献序列之间比对发现存在1到2个重复序列的不同，推测此段序列可能为多态性位点。

3. pcDNA3.1/HKSV质粒的鉴定:pcDNA3.1/HKSV用Xba I , BamH I双酶切电泳，可见到约I kb, 2. 7kb与5. 4kb的三条DNA条带;用Xba I , h加I双酶切电泳，可见到约3. 7kb与5. 4kb的两条DNA条带;用BamH I单酶切电泳，可见到2. 7kb与6. 4kb的两条DNA条带;用EcoR I单酶切，只见到约9. lkb的一条DNA条带，酶切电泳结果均与设计一致。

4. pcDNA3.1/SV表达载体的鉴定:pcDNA3.1/HKSV用BamH I单酶切电泳，可见到约2. 7kb与6. 4kb两条DNA条带;pcDNA3. 1 /SV用Bamfl I单酶切电泳，可郑州大学2008年博士学位论文SV40T抗原基因在转基因小鼠胃壁细胞特异性表达及生物学特性研究见到约2. 7kb与5. 4kb两条DNA条带;pcDNA3. 1用BamH I单酶切电泳，仅见到一条5. 4kb的DNA条带，酶切电泳结果均与设计一致。

5. SV40T基因测序结果:经DNA测序分析验证了pcDNA3. 1 /SV2是SV40T基因以正确方向插入而构建的重组质粒，且pcDNA3.1/HKSV质粒中SV40T基因测序结果与NCBI公布的NC-00 1669序列完全一致。