第21卷 第1期1999年1月北 京 林 业 大 学 学 报JOURNAL OF BEI J IN G FORESTR Y UN IV ERSIT Y Vol.21,No.1Jan.,1999研究简报组织培养过程中PPO 活性和总酚含量的研究3罗晓芳 田砚亭 姚洪军(北京林业大学生物学院,北京,100083;第一作者女,58岁,教授)摘要 该文研究了阿月浑子、枣树和葡萄组织培养苗生长过程中多酚氧化酶(PPO )活性和总酚含量的变化规律.结果表明:多酚氧化酶活性与组织培养材料的褐变指数相关性不明显,总酚含量与材料褐变指数有一定的相关性,即褐变严重、褐变指数高的材料多酚含量特别高.说明褐变发生的条件是复杂的,不只是多酚和多酚氧化酶直接作用的结果.关键词 组织培养,多酚氧化酶活性,总酚含量,褐变指数中图分类号 Q946.5Polyphenol Oxidase Activities and Phenol Contents in Tissue CultureLuo Xiaofang Tian Yanting Yao Hongjun(College of Plant Sciences ,Beijing For.Univ.,100083,P.R.China )ABSTRACT The regulation of Polyphenol oxidase (PPO )and phenol contents of Ziz yphus j u 2j uba Mill ,V itis vi nif era L.and Pistacia vera L.were studied.The results are as follows :PPO activities have no interrelation with browning index but to some extent phenol contents has.That is to say ,material browning is not the result of directly interaction between PPO and phenol ,there are more reasons to influence it.KE Y WOR DS tissue culture ,Polyphenol oxidase activities ,phenol contents ,browning index1998206209收稿3国家自然科学基金资助项目(39570580)组织培养过程中的褐变现象已经成为影响组培成功的重要因素.褐变现象主要是由多酚氧化酶(PPO )作用于天然底物酚类物质而引起的[1].鞠志国[2～4]研究发现,果实内总酚含量与其褐变密切相关.Maira 和Halevy [6]进行花卉组培时发现酚类物质的含量与其褐变率成正相关,与成活率成负相关.李焕秀等[5]研究梨芽和茎尖多酚氧化酶活性和总酚含量时也发现同样的规律.因此,研究不同种植物组织培养继代过程中的多酚氧化酶活性和总酚含量的变化规律,有助于找到组培材料褐变的机理以及在生产过程中克服褐变的有效方法.1 试验材料与方法1.1 材 料 试验所选用的材料是北京林业大学良种繁育中心组织培养成功的苹果枣(Zizyphus jujuba Mill )、红地球葡萄(V itis vi nif era L.)、阿月浑子(Pistacia vera L.)3个品种.供试材料为同步培养的组织培养苗,接种和培养条件一致.取材方法为随机取样和混合采样,即先在组培室内的培养材料中随机取3瓶,测定时在3瓶中进行混合取样,每5d 取1次样品进行测定,所取测定样为组培苗的叶片,每个品种重复3次.1.2 方 法1.2.1 总酚含量的测定 参考李焕秀[5]的研究方法,进行改进.将所取得的供试材料在分析天平上精确称取,剪碎后进行研磨提取,提取液为50%的乙醇(p H =310),充分提取后过滤在容量瓶中定容,适当稀释后在岛津UV 2120型分光光度计上读取光密度值,检测波长为270nm.以邻苯二酚作标准曲线,计算每克鲜样中总酚的毫克数.1.2.2 多酚氧化酶活性的测定 将混合取得的材料取适量在分析天平上称重,冷冻研磨提取,提取液为0.1mol ・L -1,p H 610的磷酸柠檬酸缓冲液.充分研磨后定容10mL ,0～4℃,3000r ・min -1冷冻离心15min ,上清液即为多酚氧化酶活性待测液,取待测液5mL ,取5mL 反应体系(810mL ,011mol ・L -1磷酸柠檬酸缓冲液,016mL ,1%邻苯二酚,014mL ,011%脯氨酸),充分混合2min 后在30℃的水浴上保温30min ,取出后4min 在UV 2120型分光光度计上读取光密度值,检测波长为460nm.1.2.3 褐变指数 在取样前测定每株材料的高度、褐变级别、株数. 褐变性状分级:0级:茎叶生长正常,分化正常,平均苗高315cm 以上,茎基部无褐色物质;1级:茎叶生长正常,分化后有效苗较少,平均苗高315cm 以上,茎基部有少量褐色物质;2级:茎叶生长缓慢,分化后有效苗较少,平均苗高310cm 以下,茎基部有少量褐色物质;3级:茎叶生长受阻,不分化,平均苗高210cm 以下,茎基部有大量褐色物质;4级:茎叶和茎基部均褐变,材料死亡.褐变指数计算公式:褐变指数=∑(褐变级数×该病级株数)总株数×4×100%2 结果与分析图1 不同种植物组织培养苗继代培养时多酚氧化酶活性变化FIGURE 1 The variety of PPO activity in different speciesmaterial during culturing i n vit ro2.1 不同种植物组培苗继代过程中多酚氧化酶活性的变化 1997年7月5日转接3种材料于分化培养基上,每5d 进行1次测定,其多酚氧化酶活性的变化情况见图113个材料中苹果枣多酚氧化酶活性最高,继代初(0～10d )多酚氧化酶活性有一个下降的趋势,10d 左右后开始回升,并且随着继代时间延长活性不断提高,到下一个继代初达到最高值.红地球葡萄多酚氧化酶活性次之,虽然也有随着继代时间不断提高的趋势,但变化比较平稳.而多酚氧化酶活性最小的阿月浑子在培养初期有1个峰值,继代两周后多酚39第1期罗晓芳等:组织培养过程中PPO 活性和总酚含量的研究 氧化酶活性明显下降,至下一个继代周期开始.2.2 不同种植物组织培养苗继代过程中总酚含量的变化 由图2可以看出:3种材料在组培继代过程中总酚含量都有随继代时间延长逐渐增高的趋势,而且在继代的后期都有所下降.其中,阿月浑子总酚含量最高,并且基本上保持一定含量,但变化幅度较大.其次是苹果枣,在继代过程中呈平稳上升趋势.红地球葡萄的总酚含量最低,随继代时间上升幅度较大.培养初期阿月浑子的总酚含量是红地球的3～4倍,而后期二者的总酚含量已非常接近.图2 不同种植物组织培养苗继代时总酚含量变化FIGURE 2 The phenol content variety of differentspecies material during culturing i n vitro 图3 不同种植物组织培养苗继代培养时褐变指数的变化FIGURE 3 The browning index of different species material during culturing i n vit ro2.3 不同种植物组织培养苗继代过程中的褐变指数 由图3可以看出,阿月浑子的褐变指数随着继代时间的延长有明显增高的趋势,在继代末期可以达到近60%,材料生长严重受抑,部分褐变死亡.苹果枣不发生褐变,红地球葡萄在继代末期有轻微的褐变发生,但是能通过加入一定量的抗坏血酸抑制褐变的发生.而阿月浑子不能通过加入抗坏血酸这一单一措施来抑制.3 结论与讨论(1)多酚氧化酶活性与组织培养材料的褐变不呈正相关.从本研究的结果可以看出,褐变现象较严重的材料阿月浑子的多酚氧化酶活性却是最低的,而不褐变的苹果枣多酚氧化酶活性相当高,说明酶活性的高低不是判断褐变是否严重的充分条件.苹果枣的酶活性在培养初期是下降的,可能是由于继代产生的损伤,使之生活力下降,从而使酶活力也产生一个下降过程.而阿月浑子在培养两周后多酚氧化酶活性就开始下降,这由于随培养过程中褐变的毒害,使材料的生活力下降,从而导致酶活力的下降.因此,对易于褐变的材料及时转接会减轻褐变的毒害作用.(2)3种材料的总酚含量研究表明:褐变与繁殖材料的总酚含量关系很大,对于易褐变的阿月浑子来说,总酚含量在培养过程中一直保持在很高的水平.但相应的是,苹果枣的总酚含量也较高,而且多酚氧化酶活性也很高,而其组培过程中却不发生褐变,原因和鞠志国研究报道的多酚和多酚酶在细胞内存在区域化分布有关.由于区域化分布的存在,总酚含量、多酚氧化酶活性高的苹果枣不易发生褐变,易褐变的阿月浑子是由于材料本身区域化分布的打破而导致.(3)易褐变的材料的褐变指数随着培养时间的延长不断增加,原因是由于褐变产生的氧化49北 京 林 业 大 学 学 报第21卷 产物(醌类物质)对材料的毒害作用使材料生长势变弱,材料的代谢减弱,同时材料的膜透性增加,导致更多的酚类物质渗出液胞,更多的氧化产物进一步毒害材料,直至材料死亡.(4)植物组织培养过程中的褐变是由多种因素综合作用的结果,单一的多酚氧化酶活性和总酚含量并不能说明褐变的机理,二者在外植体褐变过程中也没有明显的相关性.由于多酚氧化酶活性高和总酚含量高的苹果枣并不发生褐变,因此,褐变的发生有其内在的机制,形成酚和酶区域化分布的膜系统是褐变发生的关键因素,这一方面的工作有待于进一步的研究.参考文献1 陈秀芳,王坤范.桃果实发育中褐变因子变化规律的研究.园艺学报,1995,22(3):230～2342 鞠志国,朱广廉,曹宗巽.莱阳茌梨果实褐变与PPO 及酚类物质区域化分布的关系.植物生理学报,1988,14(4):256～2613 鞠志国.酚类物质与梨果实品质的研究进展.莱阳农学院学报,1988,5(3):59～654 鞠志国.PPO 及其底物对梨组织褐变的影响.莱阳农学院学报,1987,4(2):42～475 李焕秀,王乔春,李春秀.梨芽和茎尖多酚氧化酶活性和总酚含量的初步研究.四川农业大学学报,1994,2(2):218～2226 Mager A M ,Harel.Polyphenol oxidases in plants .Phytochemistry ,1979,18:193～215(责任编辑 李文军 胡 涌)59第1期罗晓芳等:组织培养过程中PPO 活性和总酚含量的研究 。
