质粒提取及试剂配置

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH 和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。

1M Tris-HCl[t1] (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。

在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。

溶液Ⅰ50mM 葡萄糖/ 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。

这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。

2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。

使用前临时配置[t2]。

这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。

要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。

很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。

事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。

用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。

如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。

很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。

质粒蛋白提取、纯化的具体步骤及方法携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。

蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

一、试剂准备1. LB液体培养基：Trytone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。

2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。

3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM 2-ME，pH8.0。

4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。

5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea，500 mM Imidazole，pH8.0。

6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22 um滤膜抽滤，-20℃保存。

二、获得目的基因1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2. 通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

三、构建重组表达载体1. 载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2. PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

四、获得含重组表达质粒的表达菌种1. 将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

质粒DNA提取所用试剂1)STE溶液0.1 mol/L NaCl，0.001 mol/L EDTA（pH 8.0），0.01 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）；2)Solution I溶液50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA（pH 8.0），50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）；3)Solution II溶液1%（w/v）SDS，0.2 mol/L NaOH；现用现配4)Solution III溶液11.5 mL冰醋酸，60 mL 5 mol/L乙酸钠，28.5 mL蒸馏水；5)TE缓冲液（pH 8.0）100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0）；6) 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）碱裂解法提取质粒1)挑取重组DH5α单菌落接种于5 mL LB/Amp培养基中，37ºC，200 r/min振荡培养过夜；2)吸取菌液于2 mL离心管中，12000 r/min，离心5 min，收集菌体细胞；3)用500 μL STE重悬菌体细胞，12000 r/min，离心5 min，去掉上清；4)用300 μL冰预冷的Solution I溶液重悬菌体细胞，在振荡器上振荡1 min，冰浴5 min；5)加入600 μL新配制的Solution II溶液，温和的上下颠倒离心管6~8次，使之充分混匀，冰浴5 min；6)加入450 μL Solution III溶液，立即温和的上下颠倒离心管6~8次，使之充分混匀，冰浴10 min；7)12000 r/min，离心10 min，取上清，加入等体积的酚氯仿异戊醇（25:24:1），颠倒混匀，室温静置2 min，12000 r/min，离心5 min；8)取上清，加入等体积的酚氯仿异戊醇（25:24:1），颠倒混匀，室温静置2 min，12000r/min，离心5 min；9)取上清，加入等体积的异丙醇，-80ºC沉淀30 min；10)12000 r/min，离心5 min，去掉上清，加入75%乙醇，弹起沉淀洗涤，12000 r/min，离心2 min，去掉上清，再用75%乙醇漂洗沉淀，去掉上清；11)将质粒自然晾干，用20 μL超纯水溶解质粒，加入1 μL RNaseA，37ºC，消化30 min；取部分质粒进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，其余-20ºC保存。

质粒的提取及酶切实验报告
一、实验目标
本实验旨在提取低分子量DNA、质粒，通过酶切实验检测质粒DNA片段长度，并处理实验结果。

二、实验原理
1、质粒DNA提取：使用特定的提取试剂，先提取溶菌酶凝胶中的质粒DNA；
2、质粒DNA酶切：采用酶切的方法，对质粒DNA进行切割，形成小片段；
3、质粒DNA测序：采用测序仪对质粒DNA片段进行测序，从而确定其长度。

三、实验材料
1、提取试剂：主要由蛋白酶、乙腈、缓冲液、EDTA等混合而成；
2、PCR反应液：主要由dNTP、聚合酶、反应缓冲液等组成；
3、酶：主要由DNA内切酶和DNA外切酶组成；
4、测序仪：用于测序质粒DNA的片段长度；
四、实验步骤
1、提取质粒DNA：将实验样品放入提取试剂中，加热30分钟，然后用混合物洗涤一次，最后离心得到清澈的液体，含有提取的质粒DNA；
2、进行PCR反应：将提取的质粒DNA作为反应液™添加到PCR管中，在适当温度下反应10分钟；
3、酶切：将PCR管中的反应液加入内切酶和外切酶中，在规定温度下酶切1小时；
4、离心质粒DNA片段：将酶切后的反应液离心，以得到质粒DNA片段；
5、进行测序：将质粒DNA片段放置于测序仪中，逐一测序后得到结果；
五、实验结果及分析
实验结果：
质粒DNA片段长度：
0.31kbp、0.48kbp、0.51kbp、0.58kbp、0.68kbp等。

细菌质粒DNA的提取（碱裂解法）所需试剂溶液Ｉ葡萄糖50 mMEDTA 10 mM（pH 8.0）Tris-HCl 25 mM（pH 8.0）每瓶100 ml, 在121℃高温下蒸汽灭菌15 min，贮存于4℃。

碱变形法抽提质粒溶液IINaOH 0.2 MSDS 1 %用5 M NaOH 和10 % SDS的储存液用前新鲜配制。

碱变形法抽提质粒溶液III5M 醋酸钾60 ml冰醋酸11.5 ml无菌水28.5 mlSTETTris-HCl 10 mM（pH 8.0）NaCl 0.1 MEDTA 1 mM（pH 8.0）Triton X-100 5％（V/V）TAE（1×）缓冲液Tris-Ac 40 mMEDTA 1 mMTE 缓冲液Tris-HCl 10 mM（pH 8.0）EDTA 1 mM（pH 8.0）1.2.1.7 转化后细菌质粒DNA的提取（碱裂解法）从转化后恒温培养的平板上挑取单菌落，转到含有LB液体培养基（含AMP 50 µg/ ml）的试管中，37℃剧烈震摇8-12 h。

（1）在Eppendorf 管中加入1.5 ml菌液，12000 rpm 离心30 s，弃上清。

（2）加入初始菌液1/4倍体积的STET溶液，剧烈震荡，12000 rpm 离心30 s，弃上清。

（3）将沉淀重悬于100 µL用冰预冷的溶液Ｉ中。

（4）加入200 µL新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，颠倒离心管5次，以混合内容物。

（5）加入150 µL预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒离心管5次，待溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，将管置于冰上5 min。

（6）12000 rpm离心5 min，将上清转移到另一离心管中。

（7）加入与上清液等量的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），振荡混匀，12000 rpm离心3 min，将上清转移到另一离心管中。

（8）加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，－20℃放置20 min。

质粒DNA提取方案碱裂解法的原理是利用碱性溶液来打断细菌细胞壁和细胞膜，从而释放质粒DNA。

以下是一种常用的碱裂解法质粒DNA提取方案：材料和试剂：1.细菌培养物（含有质粒的细菌株）2.稀释缓冲液（例如TE缓冲液，pH8.0）3.碱性溶液（例如10%SDS和0.2NNaOH的混合液）4.中和缓冲液（例如3M醋酸和5MNaCl的混合液）5.离心管和离心机6.微量移液器和离心管管盖7.筛网或滤纸（用于分离细菌细胞碎片）步骤：1.将适量的细菌培养物加入离心管中。

2.离心管离心，收集细菌细胞沉淀。

3.弃去上清液。

4.加入适量的稀释缓冲液，悬浮细菌细胞。

5.离心管离心，收集细菌细胞沉淀。

6.弃去上清液。

7.加入适量的碱性溶液，充分混匀。

8.将离心管放入70°C水浴中，孵育5分钟。

9.在离心机中以最大转速离心10分钟，以沉淀细菌细胞碎片。

10.弃去上清液。

11.加入适量的中和缓冲液，充分混匀。

12.在离心机中以最大转速离心10分钟，收集质粒DNA沉淀。

13.弃去上清液。

14.用适量的冷稀释缓冲液溶解质粒DNA沉淀。

15.使用微量移液器将溶解的质粒DNA转移到干净的离心管中。

16.使用筛网或滤纸分离细菌细胞碎片。

17.将离心管盖盖好，储存质粒DNA在-20°C冰箱中。

注意事项：1. 操作过程中尽量保持洁净和细菌污染的最小可能性，并勿让细菌接触到DNase。

2.在所有步骤中尽量避免剧烈振荡和搅拌，以防止DNA的破坏。

3.稀释缓冲液、碱性溶液和中和缓冲液的配方可以根据实验需求进行调整。

以上是一种常用的碱裂解法质粒DNA提取方案，该方法简单可行，适用于实验室中常见的质粒DNA提取需求。

在实际操作过程中，可以根据实验要求和具体样本进行一定的调整和优化。

质粒抽提详细步骤质粒提取实验步骤摇菌：（先倒入锥形瓶再消毒）1 将配好的LB培养液高温消毒后，放入40C冰箱，冷却；2 在酒精灯旁操作，向锥形瓶中加入100mlLB，加入150ul氨苄（看抗性）；3 再向锥形瓶中挑入少量菌（液体：60~80ul；固体：绿豆大小）；4 放入摇床，摇一夜。

LB培养液的配方1）胰化蛋白胨（）10g/L(tryptone)2）酵母提取物5g/L（yeast extract）3）Nacl 10g/L4）去离子水（双蒸水）950ml 终体积为1000ml5）配好后，需高温消毒（纱布或报纸包）质粒提取：QIAGEN plasmid Midi kit（25）试剂盒准备2个50mlEP管，提2个质粒一共要6个50mlEP管。

使用前注意事项：1）P1在使用前要加入RNAase，终浓度为100ug/ml，P1一直放40C。

2）事先溶解P2（天冷时P2会出现沉淀，应放37 0C水浴溶解）。

3）预冷至P1、P3（P2作用为裂解细胞）至4 0C。

4）提质粒前一天消毒50ml，20ml管子及2mlEP管及LB，干燥待用。

5）摇菌和保菌都要开酒精灯，尽量保持无菌，用酒精灯擦桌子和瓶口，不能讲话或者戴口罩。

步骤：1 摇菌100ml过夜（100ml菌分两次离心，锥形瓶中剩余的菌留作保菌用）；2 酒精灯旁操作，倒入50ml管子，6000g、15min（离心力/RCF）、40C（配平及记得更换转子/Rootor）,离心完后弃去上清收集细菌；3 用3ml P1重悬细菌沉淀物（充分溶解，沉淀可通过枪反复上下吸打混匀）分两管离心，各加3ml P1，后再混合为一管，保证100ml 菌液用了3ml P1重悬。

4 加3ml P2（P2比较粘稠，用之前要晃匀），充分混匀到整个液体都变蓝（上下轻柔颠倒4~6次），室温放置5min（混匀时不可过猛，以免弄断genemic DNA；裂解物是粘性的，溶解时间切勿超过5min，一旦加入P2就应立即将管子盖上，以防酸化）；5 加入预冷的P3 3ml，立即温和的混匀至蓝色消失（上下轻柔颠倒4~6次），放置冰上避光孵育15~20分钟P3后，产生蓬松白色物质，沉淀物变得不粘（沉淀物包括genemic DNA、蛋白质、细胞碎片、SDS）；6 4 0C、≥20000g、30min离心，将上清液放入另一10ml的EP 管（注意移动时不能晃，以免将沉淀转入），直接在离心室加，加完一个扔一个，注意一点沉淀都不能吸进去，吸时用双枪头，黄枪头套在蓝枪头外，减少冲击；7 离心同时，用4mlQBT润洗QIAGEN-tip100（平衡膜），弃去脱下上液；8 用2×10mlQC洗QIAGEN-tip100两次，弃去滴下的液体（注意滤膜不要干燥，管中液体满了就弃去，液面不要触及TIP下部，如果触及则用双蒸水冲洗），加入离心后并经过萃取的上清液，萃取步骤如下图；20000g、15min、4 0C离心把离心后的上清液直接加到TIP中过滤（TIP标记）；9 待液体差不多滤过时，用5ml的QF洗脱膜上的DNA，用10mlEP管收集洗脱物（最先流出来的3~4滴弃去），收集后混匀，可用摇床10min；10 每管用3.5ml的室温异丙醇沉淀DNA，混匀10min，然后4 0C、≥15000g、离心30min，沉淀在管底的异丙醇沉淀物有玻璃样外观，非常松软，弃去上清时小心；11 先加1ml的70%乙醇洗DNA沉淀，移入1.5ml的EP管（把沉淀打散后再移入，能不用2mlEP尽量不用，TIP的架子要回收），15000g离心10分钟，倒去上液，不要触及沉淀，重复洗一次（把沉淀吹打到液体中，轻柔）；12 空气中干燥沉淀5~10分钟，待干燥后（无色透明）用合适体积（50ul）的AE溶解沉淀（560C水浴10min，加快溶解），放入4 0C冰箱过夜；13 第二天测浓度（DNA），稀释到1ug/ul，待转染用。

质粒提取试剂配制和操作步骤试剂配制(小量)1. 1M（M代表摩尔浓度即mol∕L）NaOH (400ml ): 分子量为40，秤取16gNaOH, 溶于400ml DDW中。

2. 2M Tris-HCl (500ml): 分子量为121.14, 秤取121.14g Tris,放入干净的500ml烧杯中，加400 ml DDW，置于搅拌器上搅拌溶解，用HCl调节pH值为8.0（首先直接加12M的浓盐酸约20ml，接近8.0时再用1M HCl 调节）, 定容至500ml，4℃保存。

3. 10%SDS (200ml): 称量20gSDS,放入干净的烧杯中，加100 ml DDW，定容到200ml，室温保存。

（SDS具有较强的刺激性，称量时一定带好口罩，动作轻柔）。

4. Buffer P1 (500ml): 用50ml离心管量取10ml 0.5M的EDTA，然后量取12.5ml 2M 的Tris-HCl，放入干净的烧杯中，加入300ml DDW,置于搅拌器上搅拌溶解，用HCl调节pH值为8.0（大约加12M的浓盐酸1ml ），定容至500ml，4℃保存。

5.Buffer P2（100ml）: 20ml 1M NaOH和10ml 10%SDS放入200ml的玻璃瓶中，然后加入70ml DDW，混匀，室温放置过夜，使其自溶，最后室温保存。

(注：不需要定容，严格按步骤操作)。

6. Buffer P3 (500ml) ：秤取147.21g乙酸钾，溶于300ml DDW中，置于搅拌器上搅拌溶解，用冰醋酸调节pH值为5.5，（约加80–100ml冰醋酸）, 定容至500ml，4℃保存。

7. Buffer QBT（500ml）：分别称取NaCl 21.915g, MoPS 5.23g, 放于干净的500ml烧杯中，加入300ml DDW,置于搅拌器上搅拌溶解，用1M NaOH调节pH值为7.0（约加10–15ml NaOH）,然后加入75ml 异丙醇，定容至500ml，4℃保存。

碱裂解法碱裂解液1组分浓度：25mM Tris-HCl(pH8.0),10mM EDTA,50mM glucose配制量：1L配制方法：1、量取下列溶液，置于1L烧杯中1M Tris-HCl(pH8.0) 25ml0.5M EDTA(pH8.0) 20ml20% glucose(1.11M) 45mlaH2O 910ml2、高温高压灭菌后，4℃保存3、使用前每50ml的碱裂解液1中加入2mlRNase A(20 ug/ml)1M Tris-HCl(pH8.0)配制量：1L配制方法：1、称量121.1g Tris 置于1L烧杯中2、加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解3、加入浓盐酸调节所需pH值pH 8.0 约 42ml4、定容至1L5、灭菌，室温保存注意：应使溶液冷却了再调pH值0.5M EDTA(pH8.0)配制量：1L配制方法：1、称取186.1gNa2EDTA.2H2O于1L烧杯中2、加入约800ml的去离子水，充分搅拌3、用NaOH调节pH至8.0（约20gNaOH）注意：pH至碱裂解液2组分浓度：200 mMNaOH,1%(w/v)SDS配制量：500 ml配制方法：1、量取下列溶液，置于500ml烧杯中50ml10% SDS 50ml2N NaOH 50ml2、加灭菌水定容至500ml，充分混匀3、室温保存，此溶液保存时间最好不要超过1个月注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌碱裂解液3组分浓度：3M KOAc,5M CH3COOH配制量：500ml配制方法：1、称量下列试剂，置于500ml烧杯中KOAc 147gCH3COOH 57.5 ml2、加入300ml去离子水后搅拌溶解3、加去离子水将溶液定容至500ml4、高温高压灭菌后，4℃保存Ⅰ1M Tris-HCl(pH 8.0)配制量：1L配制方法：1、称量121.1gTris置于1L烧杯中2、加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解3、加入浓盐酸调节所需的pH值Ph 8.0 约42ml4、定容至1L5、灭菌，室温保存应使溶液冷却了再调PH值0.5M EDTA(PH 8.0)配制量：1L配制方法：1、称取186.1gNa2EDTA.2H2O于1L烧杯中2、加入约800ml的去离子水，充分搅拌3、用NaOH调节pH至8.0（约20g NaOH）PH至8.0时，EDTA才能完全溶解4、加入去离子水，定容至1L5、适量分成小份，高温灭菌6、室温保存20%（w/v）glucose配制量：100ml方法：1、称取20g glucose置于100—200ml烧杯中，加入约80ml去离子水，搅拌溶解2、加去离子水定容至100ml3、灭菌，4℃保存Ⅱ2N NaOH配量：100ml方法：1、量取80ml去离子水于100-200ml塑料烧杯中2、称取8gNaOH小心加入烧杯中，边加边搅拌3、待NaOH完全溶解后，用去离子水将溶液定至100ml4、室温保存10% SDS（PH7.2）配制100ml方法：1、称取10gSDS于100-200ml烧杯中，加入约80ml去离子水，68℃加热溶解2、滴加浓HCl调至7.23、定容100ml，室温保存提取质粒注意事项：1、将菌种接种到LB培养基上（3ml），含适当培养基2、在离心管中加入1.5ml培养液，离心2min(12000改为15000rpm)3、倒去上清，重复2次，用枪吸去上清4、将菌沉淀重悬于100ul冰预冷的溶液Ⅰ，再涡旋搅拌剧烈振荡，室温放置5min5、加入200ul溶液Ⅱ，盖紧管口快速颠倒（勿振荡）ep管5次，充分混合后，充分混合内容物后，放在冰上4min6、加入150ul冰预冷溶液Ⅲ，盖紧管口，倒置振荡10s，将溶液Ⅲ分散均匀后，置于冰上3-5min，离心5min，12000rpm，取上清7、加入等量酚：氯仿：异戊醇25:24:1,12000rpm离心2min，取上清8、加入2倍体积冰无水乙醇，1/10NaOAc，冰箱放置30min（-20℃ 2小时以上，-80℃20-30min）以沉淀DNA9、4℃,12000rpm，5min离心（改为15000,8min）10、小心吸取上清，将离心管倒放在纸巾上，以使所有液体流出，并将附于管壁上的液滴除尽11、用1ml70%乙醇在4℃离心5min(12000rpm)，去上清12、干燥30min(空气中)，加入20ug（2ul）10mg/mlRNA酶和50ulTE，37℃反应1-3h，-20℃保存。

质粒提取、鉴定及保存（1）质粒的提取(Tiangen质粒提取试剂盒)：a）挑菌：选取培养板中大小中等的单个菌落，消毒牙签接种到10ml摇菌管中，其中含有卡那霉素的LB约5ml，37 °C，220rpm恒温摇床中震荡培养过夜。

b）取上述2.0ml培养液，于常温下12000 rpm离心1分钟，弃上清，干燥沉淀。

c）加入250µl溶液P1(配有去RNA酶，4 °C保存)，涡旋振荡，完全悬浮细菌，不能留有沉淀，否则会影响裂解。

d）加入250µl溶液P2，快速上下颠倒8次，常温静置3分钟，可见混合液逐渐变清、粘稠，表示已充分裂解。

e）再加入350 µl溶液Ⅲ，快速上下颠倒8次，可见白色絮状物出现。

f）常温12000rpm离心10分钟，所得上清液倒入已经用BL平衡过的过滤柱中，注意不要倒入白色絮状物沉淀，静置3分钟，12000 rpm离心1分钟。

g）加入500 µl溶液PD，12000 rpm离心1分钟。

h）加入600 µl溶液PW，12000 rpm离心1分钟；此步骤再重复1次；弃废液后空管再次12000 rpm离心2分钟。

i）于超净台通风干燥，放置2-5分钟，加入33µl已加热至65 °C的已灭菌的ddH2O，室温静置3分钟，12000 rpm离心2分钟，得到相关质粒DNA，测浓度，-20 °C保存备用。

（2）质粒鉴定及保存取100ng上述提取的质粒，进行酶切（反应体系见前），随后用0.8%琼脂糖凝胶电泳以鉴定（方法同前所述），最后将粗略鉴定正确的样本送至生物技术公司测序。

如测序正确，用50%灭菌甘油300µl+700µl的菌液，标记于-80 °C保存备用。

11）质粒或PCR产物纯化（胶回收）（1）琼脂糖电泳酶切或PCR相关产物。

（2）在紫外投射反射仪割取含有目的片段的琼脂糖凝胶片段，割取要迅速，以避免紫外线对DNA的损伤，但注意尽量割取目的片段，减少无目的片段的凝胶量，以便提高纯化回收效率。