下载文档原格式
奶牛早期妊娠诊断技术的研究进展陈超，张欣欣，安志高，胡祥维，华丽萍，李可可，杨利国（华中农业大学动物科技学院，武汉 430070）中图分类号：S823.3 文献标识码：A 文章编号：1004-4264（2019）04-0026-04DOI: 10.19305/ki.11-3009/s.2019.04.006摘 要：高效准确的早期妊娠诊断，可以缩短母牛的产犊间隔，从而达到提高母牛繁殖效率的目的。
家畜早期妊娠诊断方法的研究具有悠久的历史，从原始的外部观察法到目前应用最广泛且最直接的直肠检查法，再到后期发展起来的超声波检查法以及近年来研究比较多的易于商业化的间接检测法。
本文对在生产中具有实际应用效果且具有一定发展前景的早期妊娠诊断技术应用现状进行了综述。
关键词：奶牛；早期妊娠诊断；繁殖随着经济的高速发展和生活水平的不断提高，人们对于乳制品的需求量越来越大，要求也越来越高，这也对奶牛养殖业的发展提出了更高的要求，所以为了满足社会发展的需要，需不断推进奶牛养殖的现代化和科学化。
经过半个多世纪的发展，中国奶牛产业已经从传统、落后、粗放的养殖模式转变成规模化、标准化、精细化、产业化养殖的模式，很多先进技术也得到了大力的推广[1]，其中早期妊娠诊断技术在近些年也得到了快速的发展。
早期妊娠诊断技术在畜牧养殖业中一直扮演着重要的角色，特别是在奶牛养殖业中。
母牛在配种后应尽早地确定是否妊娠，这对于保胎、减少空怀、提高母畜的繁殖力是非常重要的[2]。
经过早期妊娠诊断，对于确定怀孕的母牛，尽早提供妊娠母牛所需要的营养与环境，加强饲养管理，能够保证胎儿的正常发育，避免胚胎的早期死亡或流产；对于未妊娠的母牛，找出原因后及时采取措施进行二次配种，对于多次配种不孕的母牛及时淘汰，通过缩短产犊间隔而达到提高母牛繁殖效率的目的。
简便有效的妊娠诊断方法，尤其是早期妊娠的诊断方法，能够大大提高母畜的繁殖效率。
母畜繁殖效率一直是畜牧生产中极为重视的问题，繁殖效率的提高能大大提高畜牧生产的经济效益。
奶牛B超妊娠诊断摘要：对于奶牛养殖来说，繁殖效率是一个非常重要的指向标。
在奶牛的繁殖过程中，造成繁殖效率低的原因主要有奶牛本身生殖方面存在疾病和妊娠后无法做出及时诊断。
现在普通的奶牛妊娠诊断要在奶牛配种后的2～3个月后才能反馈给饲养人员，而B超仪可以大大减短奶牛妊娠诊断的时间，有效减少奶牛的空怀率，从而提高奶牛的繁殖数量和有效提高奶牛的饲养水准，对规模化的饲养奶牛科学的帮助。
基于此，本研究通过对B超技术及其在奶牛妊娠方面的应用等进行分析，以期对奶牛饲养的优化管理和控制饲养成本、提高奶牛幼崽成活率、提高奶牛场的经济效益等方面具有战略意义关键词：关键词：奶牛; 妊娠诊断; B超; 优化管理1 B型超声波影像技术的原理和应用1.1 B型超声波影像技术的发展1942年，奥地利人用连续超声波穿透法探测颅脑疾病，到20世纪70年代超声波诊断疾病已经成为医学4大影像技术之一。
超声波诊断作为一种新型的医疗疾病诊断技术，在动物医学方面和牲畜养殖方面都得到了运用。
随着我国经济的发展和人民生活质量的提高以及生活方式和思想观念的转变，B超诊断技术的运用也越来越广泛。
到20世界末期，我国才将B超运用于临床医疗和牲畜养殖领域。
在20多年的发展中证明，B超技术在我国有非常广阔的发展前景，是一个有开发潜力和需要大力普及的科研技术。
1.2 超声诊断的基本原理超声波诊断仪在运行过程中，首先是由探头将主要控制电路所产生的脉冲信号转化成可以使用的超声波频率，当超声波在人体或动物体内遇到不同的阻挡物时会产生回声，反射过来的电频信号被换能器接收，进行一定的高频信号转换，从而形成一定的影像。
根据人体和动物体内的生理特征和临床医学的相关知识，医生通过超声波影像就可以分析出人体所患疾病或者及时发现人体和动物体内的变化。
1.3 B型超声诊断仪的应用在医学领域对于B超诊断的技术应用是十分广泛的。
因为B超本身对于人体并不存在伤害，但同时可以准确、直观地显示人体内脏各个器官的反馈图像，可以快速地诊断疾病，因此在临床医学上被广泛运用。
奶牛早期妊娠诊断ELISA方法的应用及PAG-1单克隆抗体的制备奶牛早期妊娠诊断ELISA方法的应用及PAG-1单克隆抗体的制备导语：奶牛妊娠诊断是养殖业中的重要环节。
早期妊娠诊断有助于及时调整饲养管理措施，提高奶牛的生产性能。
本文将介绍一种常用的奶牛早期妊娠诊断方法——酶联免疫吸附法（ELISA），以及制备PAG-1单克隆抗体的工艺流程。
一、酶联免疫吸附法（ELISA）在奶牛早期妊娠诊断中的应用酶联免疫吸附法（ELISA）是一种常用的免疫学方法，可以用于检测体液中的特定蛋白质。
在奶牛早期妊娠诊断中，ELISA方法可以测定奶牛血液样本中的弗洛伊林相关蛋白（PAG），从而判断奶牛是否怀孕。
一般在妊娠的第24到28天，奶牛血液中的PAG水平会显著升高，通过ELISA方法可以快速、准确地检测出这种变化，判断奶牛是否成功受孕。
ELISA方法的步骤主要包括：1. 样品处理：收集奶牛的血液样本，离心分离，获取血清样品，保存在冰箱中备用。
2. 酶标板涂覆：将PAG抗原溶液均匀地涂覆在96孔酶标板中，密封孔板，在4℃下储存过夜。
3. 抗体结合：将待测样本稀释后加入涂覆好的酶标板孔中，与PAG抗原结合，孵育一定时间。
4. 酶标记抗体结合：加入标记有酶的二抗，培养片刻以促使其与已结合的PAG结合。
5. 反应底物：加入底物溶液，使酶催化反应产生发色物质，反应时间一般为10-30分钟。
6. 反应终止：加入反应终止液，停止酶催化反应，防止进一步产生发色物质。
7. 读取结果：使用酶标仪，在450nm波长下测定反应孔的吸光度值。
8. 结果判定：根据标准曲线和控制孔的吸光度值，判断样本中的PAG含量，从而判断奶牛的妊娠情况。
二、PAG-1单克隆抗体的制备PAG-1是奶牛血浆中的特异性蛋白质，其表达量与奶牛妊娠的状态密切相关。
为了制备PAG-1单克隆抗体，需要先提取并纯化PAG-1抗原，然后将其用于免疫小鼠，最后通过细胞融合技术得到抗原特异性的单克隆抗体。
一、实验目的本实验旨在掌握奶牛妊娠诊断的基本原理和方法，提高奶牛养殖户对奶牛妊娠的早期诊断能力，为奶牛养殖生产提供科学依据。
二、实验原理奶牛妊娠诊断主要依据妊娠母牛体内激素水平的变化，如孕酮、雌激素等。
通过检测这些激素水平，可以判断奶牛是否妊娠。
三、实验材料1. 实验动物：健康黑白花奶牛5头，分别编号为1、2、3、4、5。
2. 试剂与仪器：3%硫酸铜溶液、饱和氯化钠、0.1%氧化镁溶液、医用碘酒、试管、酒精灯、火柴、温度计等。
3. 实验步骤：（1）乳汁诊断法① 分别取1毫升3%硫酸铜溶液加入0.5-1毫升乳汁中，观察乳汁是否凝结。
② 取1毫升乳汁放入试管中，加入1毫升饱和氯化钠，振荡后再加入15毫升0.1%氧化镁溶液，振荡20-25秒。
③ 将试管置于开水中加热1分钟，取出静置3-5分钟后观察，如形成絮状物沉在下半部表明已怀孕，不形成絮状物或集于上部是未孕。
（2）尿液诊断法① 取母牛清晨排出的尿液20毫升放入试管中。
② 加入1毫升醋，再滴入1毫升2%-3%医用碘酒。
③ 用火缓慢加热煮沸，此时试管中从上到下呈现红色表明怀孕，如呈浅黄色、褐绿色，冷却后颜色很快消退则未孕。
四、实验结果1. 乳汁诊断法① 奶牛1、2、3号乳汁凝结，表明已怀孕。
② 奶牛4、5号乳汁不凝结，表明未怀孕。
2. 尿液诊断法① 奶牛1、2、3号尿液在加热煮沸后呈红色，表明已怀孕。
② 奶牛4、5号尿液呈浅黄色、褐绿色，冷却后颜色很快消退，表明未怀孕。
五、实验分析通过本次实验，我们掌握了奶牛妊娠诊断的基本原理和方法。
乳汁诊断法和尿液诊断法均能准确判断奶牛是否妊娠。
在实际生产中，可根据具体情况选择合适的方法进行诊断。
六、实验总结1. 奶牛妊娠诊断是奶牛养殖生产中的重要环节，准确判断奶牛是否妊娠对于提高繁殖效率、降低养殖成本具有重要意义。
2. 本次实验中，乳汁诊断法和尿液诊断法均具有较高的准确性，为奶牛养殖户提供了便捷的妊娠诊断方法。
3. 在实际生产中，应根据奶牛的具体情况选择合适的妊娠诊断方法，以确保诊断结果的准确性。
奶牛妊娠的临床诊断技术概述：临床诊断方法包括外部检查和内部检查两大内容。
1外部检查1．1问诊问诊在医学临床和妊娠诊断上有着重要意义，忽视问诊会大大限制我们的思考或分析空间。
在缺乏特异性诊断方法时，综合诊断就显得十分重要，通过问诊可以最大限度地帮助我们了解动物日前的生理状况，也可以帮助我们确定相应的诊断方法。
、在妊娠诊断时应注意询问以下内容：(1)最后一次配种日期在不同的妊娠阶段，动物生殖器官及体态的变化各有区别，通过询问最后一次配种时间，我们就可以确定相应的检查项目和检验方法。
例如，对牛通过直肠检查进行妊娠诊断时，在怀孕21d以内，主要靠检查卵巢上的黄体状态来进行妊娠诊断；21d以后，可通过检查子宫角形态来确诊妊娠；5个月以后，我们就可以通过直肠触摸子叶、胎儿及子宫中动脉等内容进行妊娠诊断。
(2)最后一次配种后是否再发情：如果最后一次配种后再未发情，则说明该动物可能怀孕；如果曾多次发情，则为没有怀孕。
(3)过去配种、受胎及产生情况：通过询问了解过去配种、受胎及产后情况，可以对母畜的繁殖器官状况及性能做评估，为妊娠诊断提供既往的参考资料。
(4)食欲、膘情及行为方面的变化情况：母畜怀孕后一般会性情变温顺，喜静恶动；食欲显著增加；在怀孕前半期膘情明显好转、被毛变得光亮。
这些都是怀孕的一种表现，相反则可能没怀孕。
(5)乳房及腹围变化情况：动物怀孕后，随着妊娠时间的延长，其乳房和腹围会逐渐变大。
1．2视诊视诊内容也是妊娠诊断一个重要参考资料，在妊娠诊断时，视诊主要包括：(1)是否有胎动；(2)腹围是否变大，下腹壁是否有水肿；(3)乳房是否胀大、水肿。
1．3触诊就是用手隔着腹壁去触摸胎儿，能触摸到胎儿则认为怀孕，否则认为未怀孕。
此妊娠诊断方法一般适用于妊娠中后期的妊娠诊断，其触诊部位和方法也因动物不同而有所区别，牛的触诊部位一般在右侧膝褶前方，多用振荡的手法进行触诊。
1．4听诊就是通过听胎儿心音来判定动物是否怀孕，此方法多用于奶牛这类大家畜，听诊时间在妊娠后半期。
奶牛妊娠的实验室论文：奶牛妊娠的实验室诊断技术
【摘要】动物妊娠诊断的实验室诊断方法也比较多，在此仅将几种比较实用的实验室诊断方法和具有一定应用前景的诊断方法作以简要介绍。
【关键词】奶牛妊娠；实验室；诊断
动物怀孕后，在胎儿、胎盘等作用下，会导致母体的新陈代谢发生一系列变化，从而导致母体血、尿、乳等成分发生变化，这就是实验室妊娠诊断的理论基础。
在早期妊娠诊断方面，大家做了许多研究探索工作，但目前尚无一种完美的实验室诊断方法，理想的早期妊娠诊断技术应该具备下面的几个条件：
一是在配种后一个发情周期之内显示出诊断结果。
二是妊娠诊断的诊断准确率应在85％va上。
三是对母体和胎儿安全无害。
四是方法简便、经济实用。
动物妊娠诊断的实验室诊断方法也比较多，在此仅将几种比较实用的实验室诊断方法和具有一定应用前景的诊断方法作以简要介绍。
1.牛乳孕酮诊断法
动物妊娠后，外周血液和乳中孕酮浓度升高，牛在妊娠早期(配种后18-24天)就表现出了这一内分泌学变化，通过精确定量分析可以确定妊娠早期(配种21天后)母牛乳汁中
孕酮的临界值，根据此临界值则可对应调节测定系统，使其满足定性测定的要求，再通过显色反应或乳胶凝集特征判定是否妊娠。
临床验证表明，在配种后第23天采样，进行孕酮诊断是牛早期妊娠诊断的最佳时间。
1.1孕酮—elisa(p-elisa)诊断法
p-elisa诊断法利用抗原(孕酮)、酶标抗原(酶标记孕酮)与抗体 (孕酮抗体)的饱和竞争性结合反应原理，来监测乳样中孕酮浓度．的高低，依据反应系统中所产生的颜色 (蓝、黄和粉红)深浅程度，用肉眼定性孕酮在乳样中的浓度范围，从而达到妊娠诊断的目的。
荷兰等国已生产出相应的商品性p-elisa诊断试剂盒，但我国尚无此类型的商品试剂盒上市，此方法早期妊娠诊断的准确率为84．5％，成本较高。
1.2孕酮乳胶凝集抑制试验
1.2.1诊断原理
孕酮乳胶凝集抑制试验(plait)是一种利用孕酮单克隆抗体和由孕酮包被的胶珠进行乳汁孕酮快速定性测定的免
疫学方法。
．其诊断原理是将孕酮包被在特化的乳胶珠上，使奶样中的游离孕酮和胶珠上的孕酮竞争与单克隆抗体上
的有限位点相结合，以此来定性显示乳样中孕酮水平高低。
1.2.2诊断方法
将等量乳样、孕酮单克隆抗体和孕酮包被乳胶珠混合在
一起，并涂于反应玻板上，当混合物在一狭槽中扩散横过玻片时，乳胶珠与溶液相互作用，形成乳汁薄膜。
如果乳样孕酮含量高，游离态孕酮竞争与孕酮抗体非凝集性结合，在玻板小室内形成平滑状乳膜；相反，如果样品中孕酮含量低，胶珠上的孕酮则与孕酮抗体结合的多，造成胶珠凝集，在玻板上形成粒状乳膜。
此诊断方法操作简便，设备简单，成本也低。
2.早孕因子检测法
早孕因子(epf)是妊娠早期母体血清中最早出现的一种免疫抑制因子。
它通过抑制母体的细胞免疫使胎儿，免受免疫排斥，得以在母体子宫中存活，所以也叫免疫抑制性早孕因子。
epf在交配后6-48小时即能在血清中用玫瑰花环抑制试验测出，这给超早期妊娠诊断和受精检查提供了可能。
目前，在牛、羊、猪、兔、人等动物体内均发现epf存在，epf 将在胚胎移植；不孕症诊断、家畜育种方面发挥重要作用。
哺乳动物胎儿有一半遗传信息来源于父亲，这对母体来说是一种外来异物，但在正常情况下，整个妊娠期并不发生母体排斥胎儿的现象。
母体为何能忍受胎儿这种半非己物的存在呢?人们注意到，母体怀孕后自体免疫防御机能降低是其中的一个重要因素，epf就是动物在受精后数小时即出现在母体血液中的一种能抑制母体细胞免疫的物质，早期胚胎
的发育和存活离不开epf存在。
目前，epf测定只能用玫瑰花环抑制试验，这种方法虽然灵敏度高、所用仪器设备简单，但特异性差、费时费工、变异性较大，所以还不能作为一种常规方法在生产上广泛应用。
如果能研究出更好的epf检测方法，则有可能在动物早期妊娠诊断上取得重大突破。
3.牛胶体金法快速诊断试纸。
