核酸纯度检测

Trizol一步法提取总RNA：
附：Trizol法步骤
1）实验前取冰，4℃离心机预冷，DEPC处理水（高压灭菌 处理）配制的75%乙醇4℃预冷； 2）1ml Trizol匀浆好的样品； 3）加入0.2ml氯仿，颠倒混匀（15秒）——“慢”，氯仿使蛋
白变性
4）室温，静置3分钟； 5）离心机4℃、14000转/分，离心15分钟；静置1分钟（分
（2）体液标本
浆膜腔积液、脑脊液、尿液、关节积液等； 按水样标本方式离心，取沉淀用于核酸提取。
（二）提取用具预处理
1. DNA提取用具的处理
要求无菌；试剂、器材高压干燥等进行无DNase处理。
2. RNA提取用具的处理
要求无菌，防止二次污染。 RNA易被RNase水解，RNase无处不在且耐高温， 提取条件要求严格。
条件用-20℃、1小时，目的为了更好分层）
9）离心机4℃、14000转/分，离心10分钟 10）弃上液（移液器调至1ml，分两步快速轻轻吸弃上清：第1步，
沿液面吸弃约0.9ml上清；第2步，沿液面吸弃其余上清;注意吸头不要接 触到沉淀斑区）
11)沿试管内壁轻轻加入1ml 4℃预冷的75%乙醇,注意切勿 冲击到沉淀斑区 12）离心机4℃、10000转/分，离心5分钟 13）弃上液（用枪把里面的乙醇吸去，留极少许即可，以防干燥过 程中把RNA烤干），60℃恒温箱干燥5分钟（注意：打开管盖；或用
• 所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA 提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药 匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。
• 严格来说，所有溶液均应用0.1％DEPC于37℃ 处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高 压灭菌15分钟，去除残余DEPC。

紫外分光光度计检测核酸浓度和纯净度
A260是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值范围是0.1到1.0，如果不在次范围建议稀释或浓缩样品；样品吸光度小于0.05,检查是否存在操作因素，正常情况下，DNA样品的吸光度一定大于0.1，样品中出现杂质或者不错纯净会使吸光度减小。

A280是蛋白和酚类最高吸收峰的吸收波长。

因此A260/A280的比值可以对核酸纯度进行评估，一般情况下，纯净的DNA的A260/A280比值为1.8,纯净的RNA为2.0. 如果比值较低，表明样品中存在蛋白或者酚类物质的污染，需要纯化样品，特别说明A260/A280=1.5时，相当于50%蛋白质/DNA溶液。

A230 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，A260/A230比值可以对核酸样品纯度进行评估，纯净的DNA或者RNA的A260/A230比值为2.5。

如果比值小于2.0，说明样品存在碳水化合物、盐类、有机物的污染，需要纯化样品。

特别说明，A230产生负值主要是由于在很低的DNA浓度
A320/A340 检测吸光值用于检测样品溶液的浊度和其他干扰因子。

纯净的样品改值为0.00,如果不是，说明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。

核酸的提取与鉴定实验报告核酸的提取与鉴定实验报告引言：核酸是生命的基础，它存在于细胞的核内，承载着遗传信息的传递和表达。

在现代生物学研究中，核酸的提取与鉴定是非常重要的实验步骤。

本实验旨在探究核酸提取的方法以及鉴定核酸的质量和纯度。

一、核酸提取方法核酸的提取方法有多种，本实验采用了常用的酚-氯仿法。

首先，将待提取的细胞或组织样品加入细胞裂解液中，通过离心将细胞碎片沉淀下来。

然后，使用酚和氯仿进行提取，酚层中含有核酸和脂质，氯仿层中含有蛋白质。

通过离心将酚层和氯仿层分离，进一步提取纯净的核酸。

二、核酸的鉴定1. 纯度检测核酸的纯度是指核酸溶液中核酸与其他杂质的比例。

常用的纯度检测方法有比色法和光谱法。

本实验中使用了光谱法，即通过测量核酸溶液的吸光度来评估其纯度。

纯度越高，吸光度比值（A260/A280）越接近1.8。

实验结果显示，所提取的核酸样品的纯度在可接受范围内。

2. 浓度测定核酸的浓度是指单位体积核酸溶液中核酸的含量。

浓度测定常用的方法有比色法和荧光法。

本实验中采用了比色法，即通过比较核酸溶液的吸光度与标准曲线的关系来确定核酸的浓度。

实验结果显示，所提取的核酸样品的浓度为Xμg/μl。

3. 碱基组成分析核酸的碱基组成是指核酸中腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）的相对含量。

碱基组成分析可以通过核酸测序技术来完成。

本实验中使用了Sanger测序技术，通过测序结果可以确定所提取核酸的碱基组成。

4. 凝胶电泳分析凝胶电泳是一种常用的核酸分析方法，可以根据核酸的大小和电荷来分离核酸。

本实验中使用琼脂糖凝胶电泳，将提取的核酸样品与DNA分子量标准品一同加载到琼脂糖凝胶槽中，通电分离。

通过观察凝胶上的DNA条带，可以初步判断核酸的大小和纯度。

结论：通过本实验，我们成功提取了核酸样品，并进行了一系列的鉴定实验。

通过纯度检测、浓度测定、碱基组成分析和凝胶电泳分析，我们确定了所提取核酸的质量和纯度。

核酸的定量与纯度的测定在分子生物学实验中，核酸提取需要进行其纯度和浓度的测定。

目前实验室常用的测定方法主要有分光光度法、荧光染料法、PCR法和杂交定量法等。

分光光度法分光光度法主要包括紫外分光光度法、定糖定磷法及基于酶催化的核酸定量方法等。

（1）紫外分光光度法紫外分光光度法基于DNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，DNA/RNA在260nm 处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。

因此，可以用260nm波长进行分光测定核酸浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA，单链DNA浓度约为33µg / ml，RNA约为40μg/ml，寡核苷酸约为35μg/ml。

如用1cm光径，用H2O稀释DNA/RNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数/1000。

A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA 的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。

假如比值低，表示受到蛋白（芳香族）或分类物质的污染，需要纯化样品。

比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶液。

A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和RNA的A260/A230比值为2.5。

若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。

A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0.0。

假如不足，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。

实验步骤1、将制备的DNA悬浮溶解于TE缓冲液中pH8.0，10mmo1/L的Tris缓冲液，内含(1mmol/L EDTA)或悬浮溶解在灭菌水中(依据DNA含量加水)。

核酸质检标准-概述说明以及解释1.引言1.1 概述核酸质检是一种用于检测和评估生物体内核酸（DNA或RNA）的质量和纯度的重要技术。

在生物医学研究、生物工程、医学诊断等领域中，核酸质检扮演着至关重要的角色。

本文旨在探讨当前核酸质检的重要性、局限性和发展趋势，以及标准化对核酸质检的意义和未来发展展望。

通过对核酸质检的综合分析，我们将更好地认识到其在科研和临床实践中的重要性，以及推动其标准化和技术进步的迫切性。

1.2 文章结构文章结构部分的内容如下:文章结构部分旨在介绍整篇文章的组织结构，以便读者更好地理解文章内容的逻辑顺序和重点安排。

本文共分为引言、正文和结论三个部分。

- 引言部分将会进行概述、介绍文章结构和阐明文章的目的，通过引入核酸质检的话题引起读者的兴趣和关注。

- 正文部分将主要探讨核酸质检的重要性、目前的局限性以及未来的发展趋势，以全面系统地展现核酸质检的现状和未来发展前景。

- 结论部分将总结核酸质检的标准化意义并展望未来发展，提出对核酸质检领域的建议和展望，形成全文的完整性和逻辑性。

1.3 目的本文旨在探讨核酸质检标准的重要性和发展趋势，对目前核酸质检存在的局限性进行分析，并提出解决方案以推动标准化进程。

通过对核酸质检标准的探讨，旨在为相关行业提供指导，促进核酸质检领域的发展和进步，确保质检结果的准确性和可靠性。

同时，本文还将对未来核酸质检的发展方向进行展望，为行业相关人士和研究人员提供参考。

通过本文的阐述，旨在引起更多人对核酸质检标准化的重视，推动行业向更加规范和科学化的方向发展。

2.正文2.1 核酸质检的重要性核酸质检是一种检测生物体内核酸分子组成和含量的重要方法，它在生命科学研究、医学诊断、食品安全监测等领域具有重要的应用价值。

通过核酸质检，可以对病原体的种类、数量和变异情况进行准确的检测，为疾病的早期诊断和预防提供了重要依据。

此外，核酸质检也可以用于鉴定食品中的转基因成分和有害物质，保障食品安全。

DNA的定量和纯度测定
实验目的：
学习并掌握紫外分光光度法和定糖二苯胺显色法பைடு நூலகம்
测定DNA含量和纯度的基本原理
DNA测定的方法原理

紫外分光光度法（此法要求核酸纯度很高，1个Abs 相当于50ug/ml双螺旋DNA,除了定量测定以外还可 进行核酸纯度的检测，A260/A280比值，纯的DNA为 1.8，RNA为2.0，样品中含有蛋白质和苯酚时， A260/A280 比值降低。） 定糖法（DNA糖部分为脱氧核糖，RNA糖部分为核糖， 分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法） 定磷法（核酸的磷酸部分）


二苯胺显色法原理
DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的 糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷 酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基 -γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在 595nm波长处有最大吸收。DNA在40~400μg范围内，光 吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛， 可以提高反应灵敏度。
实验内容

DNA：1ml SC溶液溶解上次提取的DNA样品，然后转移到 50ml离心管中，用9ml0.01M NaOH溶液溶解。 A260测定:以H2O作为空白，取上清测A260值后确定稀释 倍数，使A260值在2.0左右（DNA此时的浓度约为 100ug/ml。（由于二苯胺法的测定范围是40400ug/mlDNA，所以DNA浓度如果太小会影响测定结果） 核酸含量（ug/ml）=样品A260X稀释倍数/0.02 (0.022) A280测定： A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8，RNA为 2.0。如果样品中混有RNA，则比值大于1.8；如果样品中 混有蛋白质，则比值小于1.8。

第1篇一、实验目的1. 掌握核酸纯度检测的原理和方法。

2. 熟悉紫外分光光度法在核酸纯度检测中的应用。

3. 了解核酸纯度检测的重要性及其在分子生物学研究中的应用。

二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，其纯度直接影响到后续实验结果的准确性。

核酸纯度检测主要依据核酸、蛋白质和杂质的紫外吸收特性。

在紫外光谱范围内，核酸的最大吸收峰通常位于260nm，蛋白质的最大吸收峰位于280nm。

通过测定核酸样品在260nm和280nm处的光密度值（OD值），可以计算出核酸的浓度和纯度。

三、实验材料1. 试剂：核酸提取试剂盒、超纯水、无RNA酶DNase、RNase、10×TE缓冲液、酚/氯仿/异戊醇溶液、无水乙醇、75%乙醇、SDS、NaCl等。

2. 仪器：紫外分光光度计、高速离心机、微量移液器、Eppendorf管等。

四、实验方法1. 核酸提取：按照核酸提取试剂盒说明书进行操作，提取DNA或RNA。

2. 核酸纯度检测：（1）核酸样品的制备：取适量提取的核酸，用无RNA酶DNase或RNase处理，去除杂质。

（2）核酸浓度测定：取适量处理后的核酸样品，用超纯水稀释至合适浓度。

将稀释后的核酸样品在260nm和280nm处测定光密度值。

（3）核酸纯度计算：根据核酸浓度和光密度值，计算核酸纯度。

公式如下：纯度（%）=（OD260/OD280）× 100%五、实验结果与分析1. 核酸浓度测定结果：实验结果显示，所提取的核酸样品在260nm处的OD值为0.6，在280nm处的OD值为0.4。

2. 核酸纯度计算结果：根据公式计算，核酸纯度为（0.6/0.4）× 100% = 150%。

3. 结果分析：实验结果显示，所提取的核酸样品纯度较高，符合实验要求。

这表明实验过程中操作规范，核酸提取效果较好。

六、实验结论1. 本实验采用紫外分光光度法对核酸纯度进行了检测，结果表明该方法操作简便、快速，适用于实验室常规核酸纯度检测。

掌握琼脂糖凝胶电泳检测dna的操作实验原理dna电泳速率与电荷效应无关随着碱基数的增加dna分子量增加电荷数也增加这样荷质比基本维持一个常琼脂糖凝胶作为一种固体支持基质主要利用dna分子在电场中的泳动时的分子筛效应来达到分离混合物的目的
实 验 四、 核酸浓度、纯度的检测
DNA的电泳检测
实 验 目的
0.6%
1Kb
1%
0.6Kb
1.4%
0.2Kb
2%
0.15Kb琼脂糖凝胶浓度二甲来自青迁移率：与 之相当的DNA大小
1%
2Kb
1.4%
1.6Kb
4、载样缓冲液(Loading Buffer) 注：指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液， 其作用是： 增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加 样孔内 在电泳中形成肉眼可见的指示带,可预测核酸电泳的速度 和位置 使样品呈色，使加样操作更方便 5、荧光染料(GoldView，GV) GoldView (GV) 是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核 酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同，在 100ml琼脂糖胶溶液中加入5µl GoldView即可。在紫外透射光

DNA电泳速率与电荷效应无关（随着碱基数的增加，DNA 分子量增加，电荷数也增加，这样荷质比基本维持一个常
数）。

琼脂糖凝胶作为一种固体支持基质,主要利用DNA分子在
电场中的泳动时的分子筛效应来达到分离混合物的目的。

在恒电场的一定电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于
由DNA分子的大小与构型。
③ 胶液的制备：称取0.2g琼脂糖,置于100ml锥形瓶中,加入 20ml 0.5×TBE稀释缓冲液,用保鲜膜封口（避免水蒸气 过度散失），然后在上面用枪头扎个小孔（加热过程中 可以放出少量水汽，以免瓶内压力过大）， 放入微波炉 里加热至琼脂糖全部熔化（1-2min, 液体变透明）,取出 摇匀（烫手！）,此为1%琼脂糖凝胶液。待胶冷却到60 度左右，加入DNA染料Goldview 2 ul，混匀； ④ 倒胶：将胶液缓慢倒入胶板内，注意：倒胶时的温度不 可太低,否则凝固不均匀；速度也不可太快,否则容易出现 气泡。 ⑤ 待胶完全凝固后（10min）,拨出梳子,注意不要损伤凝胶, 然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过凝 胶的上表面。

核酸质量鉴定
核酸质量鉴定是指对提取的核酸样品的质量进行评估和鉴定的一系列实验操作。

常用的核酸质量鉴定方法有：
1. 紫外光谱测定：通过测定核酸在紫外波段的吸收峰位和吸光度，来评估核酸的纯度和浓度。

2. 凝胶电泳：通过将核酸样品在琼脂糖凝胶上进行电泳分离，观察和鉴定核酸的大小、形态和纯度。

3. PCR扩增：通过进行聚合酶链式反应（PCR），可以评估核酸的整体质量和适用性。

4. 电泳图谱分析：通过将核酸样品在高效毛细管电泳或毛细管电泳仪上进行分离和检测，来鉴定样品的纯度和大小。

5. 实时荧光定量PCR：通过测定核酸在PCR反应中实时释放
荧光信号的强度，从而评估核酸的浓度和质量。

以上方法可以单独使用，也可以结合使用，以全面评估核酸样品的质量。

核酸质量鉴定的目的是确保提取的核酸样品的纯度、浓度和完整性，以保证后续实验的准确性和可靠性。

核酸纯度鉴定的方法和原理核酸纯度鉴定是在实验室中常用的核酸质量控制方法之一。

在进行分子生物学研究、基因克隆、PCR反应、基因测序等实验过程中，准确评估核酸的纯度是确保实验结果准确可靠的重要步骤。

核酸纯度的鉴定方法主要包括比色法、比浊法、紫外吸收光谱法等。

其中，紫外吸收光谱法是最常见且最常用的一种方法。

紫外吸收光谱法是利用核酸在紫外光（200-300 nm）波长范围内的特征吸收来评估核酸的纯度。

纯的核酸在260 nm处有一个最大吸收峰，而蛋白质、有机物等可能存在的污染物则往往在280 nm处有吸收峰。

因此，通过测量核酸在260 nm 和280 nm处的吸光度比值（A260/A280），可以初步判断核酸的纯度。

一般来说，纯度良好的DNA样品的A260/A280比值应在1.8-2.0之间，而纯度良好的RNA样品则应在1.9-2.1之间。

除了A260/A280比值，还有一个常用的指标是A260/A230比值。

这个比值是衡量核酸样品中存在的有机物污染程度的指标。

在制备核酸样品时，常常会使用一些试剂，如酚/氯仿、异丙醇等，这些试剂残留在核酸样品中会导致A260/A230比值下降。

一般来说，纯度良好的DNA样品的A260/A230比值应在2.0-2.2之间，而纯度良好的RNA样品则应在2.0以上。

此外，可以通过琼脂糖凝胶电泳、高效液相色谱、毛细管电泳等方法进一步鉴定核酸纯度。

这些方法可以更加精确地确定核酸样品中的杂质含量，并进一步评估核酸的质量。

综上所述，核酸纯度鉴定的方法主要包括紫外吸收光谱法，通过测量A260/A280和A260/A230比值来初步评估核酸的纯度。

此外，还可以采用其他分析方法，如凝胶电泳、高效液相色谱等，来进一步确定核酸纯度。

这些方法的应用可以确保实验结果的准确性，并为后续实验提供良好的实验基础。

核酸纯度的测定方法核酸纯度是指样品中的核酸分子与杂质分子的比例。

测定核酸纯度的主要目的是为了保证核酸样品的质量和用途。

以下将介绍一些常见的核酸纯度测定方法。

一、比色法比色法是通过对核酸样品吸光度的测定来确定核酸纯度的方法。

核酸的吸光度与波长和浓度有关。

正常情况下，核酸在260nm处有最大吸收峰，而蛋白质等杂质在280nm处有吸收峰。

因此，通过测定核酸在260nm和280nm处的吸光度比值可以确定核酸纯度。

一般来说，纯度在1.8-2.0之间的标本可以认为是较纯的。

二、凝胶电泳法凝胶电泳法是一种将核酸样品在凝胶电场中分离的方法。

核酸在凝胶中的迁移速度与分子大小和电荷有关。

经过电泳分离后，可以通过染色或者紫外线照射检测核酸纯度。

凝胶电泳法可以同时检测核酸纯度和分子量大小，是比色法无法获得的更加详细的信息。

三、比重梯度离心法比重梯度离心法是一种复杂的核酸纯度测定方法，主要适用于某些高级别的分子生物学研究。

该方法基于核酸分子在不同比重的梯度中离心分离的原理。

根据核酸分子的密度，可以将其分离到不同比重的位置。

并且可以通过在离心过程中检测样品的荧光强度来确定核酸浓度和纯度。

该方法精度高，可检测出几乎所有污染物，但操作步骤繁琐，需要专业的设备和技能支持。

四、荧光显微镜法该方法利用了核酸的荧光特性进行检测。

利用核酸比色，荧光显微镜法能够非常快速地检测核酸，并且具有比色法和凝胶电泳法无法实现的能力。

核酸分子可以通过结合有色干扰素之类的异物，在固定的荧光信息下显现出彩色或亮度差异。

尽管荧光显微镜法效果较好，但由于成本和设备限制，其常被应用于研究核酸荧光探针，而不是作为一种常见的核酸纯度测定方法。

总之，核酸纯度的测定方法有很多种，科学家们可以根据需求、设备的可用性和经费的限制选用最适合自己的方法。

无论哪种方法，都需要认真操作和严格控制实验条件，以确保获得精确可靠的结果。

0
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
2. 将试管内溶液立即摇匀，置沸水浴内25-30分钟。取 出冷却至室温，于670nm处测定OD值。
3. 以0-5号管RNA浓度为横坐标，对应光密度为纵坐标 ，绘出标准曲线。
4. 根据6号管测得的OD值，从标准曲线求出RNA待测 液浓度。
2. 在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏 度。除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖（五碳糖 ）也有同样反应。其它多数糖类，包括核糖在 内，一般无此反应。
• 三、 实验步骤
• 1. 取同样规格的试管7支，按下表顺序分别精 确地加入各试剂。
编号
1
2
3
4
5
6
7
ห้องสมุดไป่ตู้
DNA标准液(200ug/mL) 蒸馏水(mL)
（一）琼脂糖凝胶电泳
用于大片段DNA或RNA的分离，精度低，但分 离范围广。
电泳迁移率决定于： （1）核酸分子的大小 （迁移率与相对分子质量对数成反比） （2）胶浓度 （迁移率与胶浓度成反比，常用0.7～1%） （3）DNA的构象：超螺旋＞线状分子＞开环状分子
（4）电压 （一般5V/cm,电压与迁移率成正比) （5）碱基组成（影响不大） （6）温度（4～30℃都可以，常室温进行）
0.00 0.00 4.00 2.00
Y X
2. 将试管内溶液立即摇匀，于70℃恒温水浴内保温5060分钟。取出冷却至室温，于595nm处测定OD值 。
3. 以1-6号管DNA含量（微克）为横坐标，光密度为纵 坐标，绘出标准曲线。
4. 根据7号管测得的OD值，从标准曲线求出DNA待测 液中的DNA含量。
B
2. 将试管内溶液立即摇匀，于45℃恒温水浴内保温3045分钟。取出冷却至室温，于660nm处测定OD(光密 度)值。

最近重新研读了分子克隆第三版，有一个有趣的小发现，好像过去没听人说过。

一般测核酸浓度都是用260nm的光吸收值来决定，同时用260/280的比值来判断有无蛋白质污染。

理想的比值是1.8~2.0左右。

分子克隆第三版专门提到这种判断核酸纯度的办法是不可靠的。

原因在于蛋白质在260nm的消光系数比核酸小很多，即使有相当多的蛋白质污染，这个比值还是接近于理想的比值。

另外，260/280比值尤其不能用于评判寡聚核甘酸的纯度，因为嘌呤的消光系数比嘧啶大好多，寡聚核甘酸嘌呤嘧啶组成很可能不平均，所以很可能出现很纯的样品260/280比值却比较小的情况。

你所说的‘消光系数‘，是否就是吸光值的意思？如果你用连续波长测过核酸的吸光度时，就会发现，OD260,恰好是核酸吸光值最大的时候，从200-750,是一条曲线，260时是波峰，而280时，刚好是曲线下降到一半左右时的吸光值。

而恰好280又是蛋白质的最佳吸收值。

如果纯的核酸，那曲线就是标准的，260/280就是1.8-2.0之间，如果混有蛋白质，多肽，酚之类的杂质，那280时的吸收峰就变高了，曲线随之发生变形，而260时的吸收峰不变。

就如你所说的“原因在于蛋白质在260nm的消光系数比核酸小很多”，因此260的吸收峰几乎不变。

但280时却不一样。

这时相反，核酸的消化系数比蛋白质小的多，因此，一旦有污染，280上升很快。

因此260/280在有污染的情况下就会变小。

所以，用260/280的方法，还是比较可靠的。

当然更可靠的，就是用200-750的波长，连续扫描。

直接观察核酸的整条曲线，那比光靠260,280两个吸收值，肯定要准确很多。

其实平时在我们检测时，我们也会检测230,320,两个值。

至于这两值的作用，我稍后再说。

其实有230,260,280,320,这四个点。

基本上也能确定下这条曲线的该一段的形状了。

A 260 / A 280 的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是 280 nm。

二 性能验证的5W1H
WHY
WHO
WHEN
WHAT
WHERE
HOW
线性区间
y = -1.050x + 8.852 R² = 0.999
2
4
6
8
10
00
2
4
6
8
可报告区间只有经验证的线性范围上限不能满足临床需求时的定量检验项目。验证方案：选择在线性范围内高值标本，用试剂盒配套或指定的稀释液做系列等倍比稀 释。每份标本至少测定2次取平均值， 计算各稀释度的理论值与实测值对数值的差值。结果判断：如果某稀释度的理论值与实测值对数的差值≤±0.4，表明在此稀释度下结果 可靠。可报告范围上限为线性范围的上限值* 保证结果可靠的最大稀释倍数，下限为线性范围 下限。
34.26
35.65
37.91
N基因(CT值)
33.64
24.74
32.98
20200203
ORF1A/B(CT值)
38.41
35.3
39.77
N基因(CT值)
22.56
26.26
33.56
20200204
ORF1A/B(CT值)
44.42
36.61
40.85
N基因(CT值)
33.81
26.4
35.44
新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）
性能验证的5W1H
二
WHY
WHO
WHEN
WHAT
WHERE
HOW
正确度/符合率
性能验证的5W1H
二
WHY
WHO
WHEN
WHAT
WHERE
HOW
正确度/符合率

docin/sundae_meng
靶DNA的扩增
5’
(a)
引物2 5’
(b)
3’
3’
3’ 5’ 引物1
5’ (c) 引物2互补链
3’
3’ 引物1互补链
5’
(d)
3’
5’
新引
5’
物
3’
(e) 不同长度的链
单位长度的链
(f) 引物2互补链
5’
3’
(g)
3’ 引物1互补链
5’
目的片段（不同长度的链未示出）
docin/sundae_meng
英国 Sanger 1955 确定牛胰岛素结构，1958 获诺贝尔化学奖 1975 设计出DNA测序法，1980 获诺贝尔化学奖
合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。
docin/sundae_meng
docin/sundae_meng
末端终止法——Sanger
1、紫外吸收法 1个A～50μg/ml 双链DNA ～40μg/ml RNA或单链DNA
2、定糖法 RNA：核糖→ 糠醛→ →绿色物质（670-680nm）
浓HCl 苔黑酚/地衣酚
DNA：脱氧核糖+二苯胺→兰色物质（595-620nm）
浓硫酸
docin/sundae_meng
3、定磷法 核酸含磷量为9.5% 1g磷相当于10.5g核酸
ρ ：浮力密度 ω ：角速度（弧度/秒） r：样品到转轴的距离
docin/sundae_meng
（二）测定DNA的G-C含量
G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系 ρ=0.1 xG-C + 1.658 xG-C =（ρ-1.658）× 10
docin/sundae_meng

核酸鉴定的三种方法一、紫外吸收法。

1.1原理。

核酸中的嘌呤和嘧啶碱基具有共轭双键，在260nm波长处有强烈的紫外吸收。

这就像是核酸有一个独特的身份标识，在这个特定的波长下会被检测到。

咱们可以根据这个特性来对核酸进行定性和定量分析呢。

这就好比每个人都有自己独特的指纹，核酸在260nm处的紫外吸收就是它的“指纹”。

1.2操作及判断。

操作起来也不算复杂，把样品放到紫外分光光度计里，测定260nm处的吸光度值。

如果吸光度值在一定范围内，那就说明有核酸存在。

要是这个值比较高，那可能核酸的含量就比较多。

不过这里面也有个小问题，就是有些杂质也可能在这个波长附近有吸收，就像鱼目混珠一样。

所以这个方法虽然简单直接，但也不是百分百准确无误的。

二、琼脂糖凝胶电泳法。

2.1原理。

这就像是一场核酸分子的赛跑比赛。

琼脂糖凝胶就像跑道，核酸分子在电场的作用下在凝胶里迁移。

不同大小的核酸分子迁移速度不一样，就像短跑运动员和长跑运动员速度有差异一样。

小的核酸分子跑得快，大的跑得慢。

这样根据核酸分子在凝胶中的位置，就能判断核酸的大小和大概的纯度了。

2.2操作。

首先要制备琼脂糖凝胶，就像做蛋糕要先准备面糊一样。

然后把核酸样品和上样缓冲液混合，加到凝胶的小孔里，通上电，让它们跑起来。

等跑一段时间后，再用染料染色，这样核酸分子就像穿上了彩色的衣服，在凝胶里能清楚地看到它们的位置了。

2.3结果判断。

如果看到一条清晰的条带，那就说明核酸比较纯。

要是有拖尾或者多条带，那可能就有杂质或者核酸有降解等情况。

这就好比从一个人的走路姿势能看出他是不是健康一样，从核酸在凝胶里的条带情况能判断出核酸的质量好坏。

三、定磷法。

3.1原理。

核酸里面含有磷元素，这可是核酸的一个重要组成部分。

通过测定磷的含量，就能推算出核酸的含量。

这就像是通过数树上的果子数量来推测整棵树的产量一样。

3.2操作及注意事项。

先把核酸样品进行消化处理，让磷元素都释放出来，然后用特定的试剂和磷反应，通过测定反应产物的量来计算磷的含量。

最近重新研读了分子克隆第三版，有一个有趣的小发现，好像过去没听人说过。

一般测核酸浓度都是用260nm的光吸收值来决定，同时用260/280的比值来判断有无蛋白质污染。

理想的比值是1.8~2.0左右。

分子克隆第三版专门提到这种判断核酸纯度的办法是不可靠的。

原因在于蛋白质在260nm的消光系数比核酸小很多，即使有相当多的蛋白质污染，这个比值还是接近于理想的比值。

另外，260/280比值尤其不能用于评判寡聚核甘酸的纯度，因为嘌呤的消光系数比嘧啶大好多，寡聚核甘酸嘌呤嘧啶组成很可能不平均，所以很可能出现很纯的样品260/280比值却比较小的情况。

你所说的‘消光系数‘，是否就是吸光值的意思？如果你用连续波长测过核酸的吸光度时，就会发现，OD260,恰好是核酸吸光值最大的时候，从200-750,是一条曲线，260时是波峰，而280时，刚好是曲线下降到一半左右时的吸光值。

而恰好280又是蛋白质的最佳吸收值。

如果纯的核酸，那曲线就是标准的，260/280就是1.8-2.0之间，如果混有蛋白质，多肽，酚之类的杂质，那280时的吸收峰就变高了，曲线随之发生变形，而260时的吸收峰不变。

就如你所说的“原因在于蛋白质在260nm的消光系数比核酸小很多”，因此260的吸收峰几乎不变。

但280时却不一样。

这时相反，核酸的消化系数比蛋白质小的多，因此，一旦有污染，280上升很快。

因此260/280在有污染的情况下就会变小。

所以，用260/280的方法，还是比较可靠的。

当然更可靠的，就是用200-750的波长，连续扫描。

直接观察核酸的整条曲线，那比光靠260,280两个吸收值，肯定要准确很多。

其实平时在我们检测时，我们也会检测230,320,两个值。

至于这两值的作用，我稍后再说。

其实有230,260,280,320,这四个点。

基本上也能确定下这条曲线的该一段的形状了。

A 260 / A 280 的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280 nm。