植物愈伤组织培养

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植物愈伤组织培养的影响因子

Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖｉｓｉｏｎ　科技视界　科技・探索・争鸣　植物愈伤组织培养的影响因子　王东艳　（哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，黑龙江哈尔滨１　５００２５）　【摘要】愈伤组织细胞分裂快、结构疏松、具有快速的增殖能力等特点，已成为植物快繁的新手段，最常用的植物组织培养形式。本文主要　对愈伤的特点以及影响植物愈伤组织形成的条件内源＿激素和外源激素、光照条件、温度条件、培养基的成分等进行简要的概述。　【关键词】愈伤组织；组织特点；影响条件　愈伤组织是指外植体在离体培养条件下形成的一团无极性、能旺　盛分裂的薄壁细胞团．在培养过程中经过诱导分化可以发育成完整的　再生植株　愈伤组织培养已成为一种最常用的植物组织培养形式，其　不仅是一种植物快繁的新手段同时也是植物改良种质保存和有用化　合物生产的理想途径。在生产实践中得到广泛应用　因此。不断深入研　究影响植物愈伤组织形成和诱导的因素。不仅可以促进植物组织培养　技术进一步发展和完善。而且可以为实践应用提供理论基础　１愈伤组织特点　植物的愈伤组织一般具备以下３种特点：首先．具有高度再分化　和长期继代保存的能力，以便能够获得再生的植株　其次．可轻易破碎，　以便形成良好的植物组织的悬浮系．而且可以分离出所需要的原生质　体。再次。具有快速的增殖能力，因此容易形成丰富的愈伤组织系。基　于植物愈伤组织具有的以上特征。植物可通过愈伤组织进行多种多样　的遗传操作和分析及其对濒危药用植物资源、植物遗传转化等方面发　挥重要的作用１１－２１　２影响愈伤组织的条件　植物愈伤组织的形成受多种条件的影响．例如植物的内源激素和　外源激素、光照条件、温度条件、培养基的成分等均可以影响植物愈伤　组织的形成。　２．１激素对植物愈伤组织的影响　２０世纪初期温特发现了首个内源激素即生长素．开辟了植物体　中内源激素的探索道路　随着实验的进行发现的植物内源激素越来越　多．其作用越来越受人们的关注。植物内源激素是指由植物自身代谢　产生．可以自由移动到作用部分起功能的一类微量有机物质．在极低　浓度下就有明显生理效应．也被称为植物天然激素或植物激素　虽　然植物体中内源激素的含量很低，但它们与植物生长发育密切相关。　影响植物生命活动的整个过程　植物激素是愈伤组织诱导过程中的重　要影响因子．能够诱导细胞分裂的启动、愈伤组织的形成和生长．这些　植物内源激素在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结果、成熟　与衰老、休眠与萌发以及离体组织培养过程中．相互协调地调控植物　的生长、发育与分化　。在植物愈伤组织培养中，外源激素对它的影　响主要是把信号传给内源激素调控遗传物质的脱分化、再分化等作　用，因此外源激素的作用效果与愈伤组织本身内源激素的种类和水平　有密切关系，外源激素必须通过内源激素才能发挥其作用ｎ。例如，低　浓度的２．４一Ｄ的ＮＢ培养基能诱导产生籼稻的愈伤组织，但是愈伤组　织比较松软．呈黏液化和泡状．一般不易分化，且再生频率很低　只有　将各种外源激素合理使用，才能适应外植体对激素的特定要求。充分　发挥激素的调节作用，诱导愈伤组织的产生并达到分化［８－９］。植物愈伤　组织的培养离不开植物组织培养　植物组织培养是在含有营养物质及　植物生长物质的培养液中．培养离体植物组织（器官或细胞）并诱导使　其长成完整植株的技术。在组织培养中，通过器官发生途径产生再生　植株的基本方式一般有３种：（１）先分化芽，芽伸长后在其幼茎基部　长根，形成完整的小植株．这种方式在木本植物培养中较为普遍。（２）　先分化根，再在根上产生不定芽而形成完整植株。（３）在愈伤组织的　不同部位分别形成芽和根．然后二者的维管组织互相连接，成为有轴　状结构的小植株　在培养基中如果存在腺嘌呤或激动素．就会促进芽　的分化和发育，激动素的效力比腺嘌呤大几万倍．在结合使用ＩＡＡ（或　ＮＡＡ）和ＢＡｆ或ＫＴ）时，ＩＡＡ（或ＮＡＡ）的相对浓度较高，则有利于细　胞的增殖和根的分化，若ＢＡ（或ＫＴ）的相对浓度较高，则促进芽的分　化，如果比例适中时．则仍产生无分化的愈伤组织『Ｊｊ｝ｏ　２．２基因对植物愈伤组织的影响　植物愈伤组织器官的发生主要是相应基因表达和相应蛋白的合　成过程　植物愈伤组织在植物激素和其他生长条件的影响下，可通过　各种信号传递系统调节器官发生有关的基因的活性、启动器官发生有　关基因的表达、产生相应的蛋白．进而在促进愈伤组织的形成中发挥　重要的作用㈣　愈伤组织中表达蛋白的多少可反映其组织化和分化的　程度，表达的蛋白少，表明该愈伤组织的分化或组织化程度低，具有　较强的分生能力或器官发生能力Ｉ　．例如．在大麦愈伤组织形成时被　检测出约３０个特异性表达的蛋白Ｉ　）　２－３培养基对植物愈伤组织的影响　植物愈伤组织的形成主要的介质为培养基．也是愈伤组织成功的　必要条件．目前植物愈伤组织的培养基主要分为ＭＳ、Ｈ、Ｂ５、Ｎ６、Ｗｈｉｔｅ　等５类培养基，每种培养基的营养成分、盐浓度不同。不同的植物愈伤　组织培养基也有所不同　研究发现，豆科类愈伤组织一般使用ＭＳ培　养基生长较好『１４１．而在Ｎ６培养基中的生长受到明显的抑制。ｐＨ值与　多种培养基的凝固相关联，ｐＨ直接反应了培养基的酸碱度．同时也直　接或间接的影响植物愈伤组织对营养元素的吸收所以要精确控制植　物愈伤组织培养基的ｐＨ值。培养基的ｐＨ值根据不同的培养材料有　所不同，一方面，适当降低培养基ｐＨ值可以降低多酚氧化酶的活性和　底物利用率，ｐＨ越接近６．０越有利于愈伤组织的形成。另一方面，有　些植物材料愈伤组织培养基要求的ｐＨ与正常相比较高一些，基本呈　现出中性的状态旧。除了ｐＨ值的影响外，碳源也是影响植物愈伤组织　形成的重要因素之一　植物愈伤组织的培养基不能缺少碳源，碳源能　够给外植体提供能量。而且具有调节渗透平衡的作用．绝大多数的培　养基都用蔗糖作为主要的碳源　能够保证绝大多数植物离体培养物的　正常生长，蔗糖一直被作为植物组织培养标准的碳源得到广泛应用．　许多研究表明，另外与ｐＨ值的影响类似，不同植物对不同糖类的反　应也是不完全相同ｌＩ６１　２．４光照对植物愈伤组织的影响　光照条件时影响植物愈伤组织形成的一个重要的影响因子。光照　和黑暗培养条件对植物愈伤组织的影响表现的截然不同，研究发现，　光照条件下。长春花组织培养细胞生长速度较快，导致这种现象的原　因主要在于光照在诱导分化时可激活某些酶的活性和光诱导的叶绿　体或叶绿体代谢产物　同样也有研究报道显示黑暗对愈伤组织的生长　是有利的　多数植物细胞在光照和黑暗培养条件下合成的次生代谢物　的含量有较大的差别．影响着植物愈伤组织培养时次生代谢产物的积　累。　２．５温度对植物愈伤组织的影响　植物愈伤组织诱导和次生代谢物形成很大程度上受温度的影响，　植物愈伤组织的培养适宜生长的温度范围一般为１５～３２℃：不同植物　的愈伤组织的最适温度有所不同，例如．拟南芥最适培养温度一般为　２３℃．而矮牵牛最适培养温度一般为２５℃　但是次生代谢物形成的最　适温度往往与形成愈伤组织的最适温度不同旧　上述的讨论表明，内源激素和外源激素、光照条件、温度条件、培　养基的成分是影响植物愈伤组织诱导和分化的几种重要的因素。尽　管其作用特点已知，但由于植物物种的差异，植物内源激素和外源激　素以及培养基种类的选择和使用量．光照条件和温度条件的选择成为　探讨高效率进行植物愈伤组织诱导和分化的关键所在。植物内源激素　对植物的生长和代谢有重要作用，但在植物体内的（下转第１８４页）　作者简介：王东艳（１９８７一），女，黑龙江青冈人，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。　ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎ。　。ｇｙ　Ｖｉｓｉ

植物愈伤组织诱导培养基的配制

植物愈伤组织诱导培养基（简称愈伤培养基）是一种含有特定激素和营养物质的培养基，其主要作用是诱导植物体组织形成愈伤组织，从而实现植物组织培养、育种等研究。本文将介绍植物愈伤组织诱导培养基的配制。

一、基础盐溶液的配制

基础盐溶液是愈伤培养基的基础成分，其配方基本固定，主要成分包括无机盐和蔗糖等。基础盐溶液的配入量不同，会影响培养基的pH等指标。

基本的基础盐溶液配方：碳酸钾（K2CO3）2.5g、硝酸铵(NH4NO3)1.0g、硫酸镁（MgSO4·7H2O）1.0g、氯化钙（CaCl2·2H2O）0.15g、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.25g、蔗糖20g、亚硫酸氢钠（NaHSO3）0.25g、维生素B5（nicotinic acid amide）0.1mg、维生素B1（thiamine·HCl）0.1mg，配入1L蒸馏水中。

注意：不同植物种类的愈伤培养基种类略有不同，需要根据实验需求和特性进行差异化调整。

二、植物生长素的添加

植物生长素是愈伤组织诱导的必要因素之一，常用的生长素有IAA、IBA、NAA、2,4-D等，其中2,4-D是最常用的生长素。植物生长素的添加量需要视植物种类、处理目的和生长素种类而定。

一般情况下，2,4-D的添加量为1-2mg/L，但不同品种之间的生长素敏感性可能不一致，因此需要优化试验条件。如果使用IBA或NAA等生长素，其配入量一般为0.1-0.5mg/L。

三、其他添加物

除了基础盐溶液和植物生长素外，愈伤培养基还需要添加其他营养物质、激素等。下面列举了一些常用的添加物及其配入量：

1、硫酸甘露醇（mannitol）：2-3%。用于储存或早期培养。

2、水杨酸（Salicylic acid）：10-500mg/L。用于抑制愈伤组织的黑化和坏死。

愈伤组织的继代培养

实验实验七七愈伤组织的继代培养

【目的要求】：1、掌握愈伤组织的继代培养方法

2、学习接种操作技术规范。

【实验内容】：1、70%乙醇喷洒净化工作台并擦洗干净，将接种所用的工具等放入工作台。

打开紫外灯，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。打开风机吹风15分钟，

备用。

2、挑选生长旺盛的苜蓿愈伤组织（此类愈伤组织多呈白色或淡黄色，有光泽），

将其分割成直径约为0.5cm的小块。

3、将分割好的愈伤组织小块接种到新鲜的原培养基上，摆放均匀

4、培养：将培养瓶用封口纸包好，用记号笔写上姓名和接种日期,放在培养

室内25±2℃条件下暗培养。

【实验结果】：观察愈伤组织在继代培养基上的生长情况。

思考题：1．为什么要进行继代培养？

2．在进行愈伤组织继代培养中应注意的问题是什么？