1 第三章 酶的提取与分离纯化
◆酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的过程。
◆主要内容包括细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，浓缩，干燥、结晶等。
1.细胞破碎
细胞破碎方法可以分为机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法和酶促破碎法等,如表3-1所示。
表1细胞破碎方法及其原理
分 类 细胞破碎方法 细胞破碎原理
机械破碎法 捣碎法
研磨法
匀浆法 通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。
物理破碎法 温度差破碎法
压力差破碎法
超声波破碎法 通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。
化学破碎法 添加有机溶剂
添加表面活性剂 通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎
酶促破碎法 自溶法
外加酶制剂法 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎
1.1 机械破碎法
通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。
常用的破碎机械有组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。
机械破碎法分为3种:捣碎法，研磨法和匀浆法。
1.2物理破碎法
通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。
常用的物理破碎法方法有温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法等，现简介如下：
(1)温度差破碎法：利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用而使细胞破碎的方法称为温度差破碎法。
(2)压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力差破碎法。常用的有高压冲击法、突然降压法、及渗透压变化法等。
(3)超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用（ cavitation）而使细胞破碎的方法称为超声波破碎法。
1.3化学破碎法
蛋白质和酶的分离纯化及鉴定
蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。
目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。
一、质分离纯化的一般原则
1. 原料的选择
原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。
蛋白分布：体液、组织、细胞定位
2. 破碎方法：
(1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。
如：捣碎法、研磨、匀桨法
(2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。
如：反复冻融、渗透压、超声破碎
(3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法.
如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween）
(4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等
3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法
4. 先粗后细，分级分离
粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。
精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。
5. 避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等）
第三章 酶的分离纯化
第三章 酶的分离纯化
第一节 酶分离纯化工作的基本原则及步骤
第二节 细胞破碎
第三节 酶的抽提
第四节 酶的纯化
第五节 酶的纯度与产量
第六节 酶的剂型与保存
第一节 酶分离纯化工作的基本原则及步骤
1926年Summer制备了第一个结晶酶，自此以后，酶分离纯化工作进展很快，现已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净，并根据酶的作用特点，理化性质、发展了各种类型的分离纯化方法、试剂和设备。
一、基本原则
二、 酶分离纯化的基本步骤
为了能成功地进行酶的分离纯化，需注意以下两个基本原则：
1. 防止酶变性失效
防止酶变性失效是酶分离纯化工作很重要的问题，这一点在纯化后期尤为突出。一般地，凡是用以预防蛋白质变性的方法与措施，都可考虑用于酶分离纯化工作中。常见的措施有：
（1）低温 ：除少数例外，所有操作应在低温下进行， 有有机溶剂存在时，更应注意。
二、酶分离纯化的步骤
酶分离纯化时，一般要经过如下步骤：
1. 细胞破碎：
除在体液中提取酶或胞外酶，一般都要进行细胞破碎，促使胞内酶溶出，以利于抽提。
2. 抽提
3. 纯化
下面分节对这三个基本环节加以介绍
第二节 细胞破碎
细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法。
第三章 酶的分离纯化
本章教学目的：使学生了解和掌握酶产品的分离和纯化工艺。
本章教学重点：细胞破碎方法、发酵液预处理、盐析、膜分离、萃取、电泳、层析等常用分离纯化技术。
本章教学难点：盐析操作机理及方法、膜分离机理及操作方法、电泳技术原理与方法。
第一节 酶纯化设计
一、基本原则
1、原则
了解目标蛋白及主要杂质性质；产品用途；分离纯化技术操作单元信息
2、酶纯度
3、酶活性保持
4、酶数量
二、过程优化
1、目标：收率、纯度最高，成本最低
2、必须解决两类问题
可替换操作选择；理想的色谱顺序
3、纯化方法
初级阶段：高处理量、低成本；后期阶段：分辨率
4、技术顺序
沉淀技术、离子交换、亲和色谱、凝胶过滤
柱操作
（1）装柱：均匀，无气泡
（2）平衡（equilibrium)：缓冲液,pH, 盐浓度
（3）上样(loading)：蛋白浓度，pH, 盐浓度，缓冲液
（4）洗涤(washing)：pH, 盐浓度，洗涤剂，缓冲液
（5）洗脱(elution)：条件与吸附相反
（6）清洗(cleaning)：弱酸，弱碱，蛋白质变性剂（尿 素，盐酸胍，硫氰酸盐
（7）再生：与平衡条件相同
（a）自制简易层祈柱
（b）普通商品柱
（c）双底板层析柱（1.洗脱液进出口；2.多孔底板；3．柱床；4．恒温水进口；5．恒温水出口；6．可调节的塞子）
装 柱/预装柱
离子交换剂预处理及调糊
交换剂：上清（体积比）= 1:1 - 3:1
柱底部死空间空气排除
装柱器或玻棒引流，一次连续加入悬胶液
打开出口阀：层析剂沉降
排除空气
检查均匀度，慎用染料检查离子柱！ 柱平衡（可先高浓度后低浓度）（装柱视频）
上 样
1、样品处理：
过滤、粘度（稀释，大分子聚阳离子化合物如聚乙酰亚胺或鱼精蛋白硫酸盐沉淀核酸或核酸内切酶处理）
pH和离子强度控制（缓冲液交换或透析）
2、上样
上样量；上样方法 ；流速
排干法 要求较高
