蛋白质和酶的分离纯化及鉴定
蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。
目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。
一、质分离纯化的一般原则
1. 原料的选择
原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。
蛋白分布：体液、组织、细胞定位
2. 破碎方法：
(1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。
如：捣碎法、研磨、匀桨法
(2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。
如：反复冻融、渗透压、超声破碎
(3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法.
如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween）
(4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等
3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法
4. 先粗后细，分级分离
粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。
精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。
5. 避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等）
第四章 酶的提取与分离纯化2层析分离吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离溶剂洗脱法、置换洗脱法、前缘洗脱法吸附剂与洗脱剂的选择分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同而使各组分分离纸层析、薄层层析离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子亲和力不同而使组分分离阳离子交换剂、阴离子交换剂、不同离子对离子交换剂的亲和力操作过程：预处理、装柱、上柱、洗脱收集、再生凝胶层析使用多孔凝胶，利用流动相中所含各种组分相对分子质量不同而使各组分分离葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶操作过程：装柱、上样、洗脱、再生亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的可逆的亲和力，使生物分子分离纯化聚焦层析将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析特性结合在一起，实现组分分离电泳分离聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶孔径、凝胶强度、聚合时间常规PAGE、浓度梯度PAGE、SDS-PAGESDS-PAGE电泳：加入SDS、巯基乙醇使亚基解离成单体，SDS覆盖单体、电荷密度相等，电泳速度只跟分子长轴大小有关，可用于测定单子的相对分子质量SDS-PAGE配制试剂：Acr、Bis、SDS、Tris缓冲液、TEMED、过硫酸铵、Tris-甘氨酸缓冲液等电聚焦电泳酶按照电荷性质不同各自向着与其等电点相等的pH处移动聚焦，从而彼此分离分辨率高，区带越来越窄，样品可加在任意部位，可分离低浓度样品，可准确测定等电点电泳过程要求无盐溶液，在等电点时溶解度低或可能变性的组分不适用萃取分离有机溶剂萃取双水相萃取超临界萃取反胶束萃取利用待分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术超临界流体密度接近液体、黏度接近气体，适于作为萃取溶剂等温变压流程、等压变温流程、等温等压吸附流程结晶盐析结晶有机溶剂结晶透析平衡结晶等电结晶浓缩与干燥真空干燥冷冻干燥喷雾干燥气流干燥吸附干燥过滤与膜分离非膜过滤膜过滤粗滤微滤加压膜分离电场膜分离透析微滤超滤反渗透
酶的分离纯化
摘要：本文概述了在实验中由于酶浓度、饱和度等不同条件下对酶进行分离纯化的适用方法。酶的分离纯化有很多种方法，在纯化的工艺上有很大的不同，不同来源的酶在分离纯化中表现出不同的洗脱特性。现有酶的分离纯化方法都是依据酶和杂蛋白在性质上的差异而建立的。
关键词：酶；分离；纯化；方法
前言：酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。酶的纯化过程在目前来说仍是一门实验科学。一个特定酶的提纯往往需要经过多个实验的探索才能总结出一般经验规律。酶的分离纯化又与其他蛋白质的纯化过程存在很大的差异，酶的分离纯化有其自己独有的特点：一是特定酶在细胞中的含量少，二是酶通过测定活力的方法可以加以跟踪，前者给实验带来困难，后者为实验提供了捷径。
正文：
1. 酶的分离与纯化的概念[1]
酶的分离与纯化是指将酶从细胞或其他含酶材料中提取出来，再与杂质分开，从而获得符合使用目的、有一定纯度和浓度的酶制剂的过程。
酶分离纯化的一般原则：
①防止酶变性失活
1．）酶纯化一般在低温条件下进行（0~4℃）
2.）各种溶液应该用缓冲液，PH应调到使酶最稳定的PH
3.）各种溶液中还可以加入酶保护剂
②建立一个可靠和快速的测活方法 方法专一、灵敏、精确、简便、经济
③酶原料的选取
选择目的酶含量丰富的原料，且要考虑取材方便、经济节约等因素
2. 酶的分离纯化
2.1 细胞破碎[2]
各种生物组织的细胞具有不同的特点，在采用破碎方法时，要根据细胞的性质，酶的性质来选取合适的破碎方法。
1.）机械破碎法
通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。
捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎。常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。此法在实验宝和生产规模均可采用。
研磨法：用研钵直接研磨。常用于微生物的微生物材料的破碎。
酶的分离纯化
摘要：本文概述了在实验中由于酶浓度、饱和度等不同条件下对酶进行分离纯化的适用方法。酶的分离纯化有很多种方法，在纯化的工艺上有很大的不同，不同来源的酶在分离纯化中表现出不同的洗脱特性。现有酶的分离纯化方法都是依据酶和杂蛋白在性质上的差异而建立的。
关键词：酶；分离；纯化；方法
前言：酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。酶的纯化过程在目前来说仍是一门实验科学。一个特定酶的提纯往往需要经过多个实验的探索才能总结出一般经验规律。酶的分离纯化又与其他蛋白质的纯化过程存在很大的差异，酶的分离纯化有其自己独有的特点：一是特定酶在细胞中的含量少，二是酶通过测定活力的方法可以加以跟踪，前者给实验带来困难，后者为实验提供了捷径。 正文：
1. 酶的分离与纯化的概念[1]
酶的分离与纯化是指将酶从细胞或其他含酶材料中提取出来，再与杂质分开，从而获得符合使用目的、有一定纯度和浓度的酶制剂的过程。
酶分离纯化的一般原则： ①防止酶变性失活
1．）酶纯化一般在低温条件下进行（0~4℃）
2.）各种溶液应该用缓冲液，PH应调到使酶最稳定的PH 3.）各种溶液中还可以加入酶保护剂
②建立一个可靠和快速的测活方法 方法专一、灵敏、精确、简便、经济 ③酶原料的选取
选择目的酶含量丰富的原料，且要考虑取材方便、经济节约等因素
2. 酶的分离纯化 2.1 细胞破碎[2]
各种生物组织的细胞具有不同的特点，在采用破碎方法时，要根据细胞的性质，酶的性质来选取合适的破碎方法。 1.）机械破碎法
通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几
种。
捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎。常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。此法在实验宝和生产规模均可采用。 研磨法：用研钵直接研磨。常用于微生物的微生物材料的破碎。
