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外泌体，一类小的细胞外囊泡，通过作为转运和递送细胞之间的膜和细胞质分子的载体起到在各种生理和病理过程中的重要作用。
由于外来体广泛存在于各种体液中，并且携带其来源细胞的分子信息，因此它们被认为是潜在的非侵入性生物标志物。
尽管如此，方便和定量的外泌体分析方法的发展在技术上仍然具有挑战性。
在这里，我们提出了一种基于铜介导的信号放大策略的直接捕获和外来体快速检测的低成本检测方法。
该分析涉及三个步骤。
首先，通过胆固醇部分和脂质膜之间的疏水相互作用，通过胆固醇修饰的磁珠（MB）磁性捕获大量纳米囊泡。
其次，用适体修饰的氧化铜纳米颗粒（CuO NP）锚定具有特异性膜蛋白的外泌体的珠粒结合纳米囊泡以形成夹心复合物（MB-exosome-CuO NP）。
第三，通过酸解将得到的夹心复合物溶解以使CuO NP变成铜（II）离子（Cu 2+），其可以在聚（胸腺嘧啶）（聚T）存在下通过抗坏血酸钠还原为荧光铜纳米颗粒（CuNP）。
CuNPs的荧光发射随着Cu2 +浓度的增加而增加，这与外泌体浓度成正比。
我们的方法可以定量分析7.5×104至1.5×107个颗粒/μL范围内的外来体，生物样品中检测限为4.8×104个/μL。
总工作时间约2小时。
该检测方法可能成为生物样本中常规外泌体分析的简单且经济有效的方法。
胞外囊泡（EV）是包含来自封闭在脂质双层中的分泌细胞的胞质溶胶的膜囊泡。
它们可以在各种体液中检测到，包括血液，尿液，唾液，母乳，羊水等。
在20世纪80年代，约翰斯通将内源性小EV（30-150 nm）定义为外来体，由于它们携带着丰富的分子信息，包括RNAs （信使RNAs和microRNAs），DNA片段，蛋白质等，因此外泌体吸引了人们的注意。
和他们的亲本细胞的脂质。
因此，外泌体提供了一种方便的方法来监测和分析亲代肿瘤细胞的状态而不需要活检。
此外，越来越多的证据表明外泌体的脱落与肿瘤抗原和抗肿瘤免疫反应相关，信号在免疫系统中，因此对于癌症诊断具有潜在的应用价值.6-8 Melo et al。
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负染色技术负染色又称阴性染色，是相对于普通染色(称正染色)而言的。
负染色首先由Hall在1955年提出。
Hall在病毒研究中用磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的"空洞"被清楚地显示出来。
在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。
而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。
而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)"包埋"低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像"透明"地光亮。
两者之间的反差正好相反，故称为负染色。
对于负染色的机制目前还不十分了解。
对颗粒状的生物材料的研究而言，负染色技术与超薄切片方法相比具有分辨率高(可达15Å)，简单快速等优点。
因此，在生物学研究中得到越来越广泛的应用。
它可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、大小以及表面结构的特征。
尤其在病毒学中，负染色技术成为不可取代的实验技术。
[编辑]负染色液的制备用作负染色的负染色剂应具有：较强的电子散射能力以产生足够的图像反差；熔点高，在电子束的轰击下不会升华；溶解度大，不易析出沉淀；在电镜下不呈现出可观察到的结构；分子小，容易渗入不规则表面的凹陷处；与样品不起化学反应等。
目前最常用的负染液是磷钨酸、磷钨酸钾和磷钨酸钠(分别简称为PTA、KPT、NaPT)。
此外醋酸铀、甲酸铀、硅钨酸、钼酸铵等也常作负染色剂用。
它们的配制方法如下：磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾溶液通常用双蒸水或磷酸缓冲液配制成1％～3％的溶液，使用时应用1 mol／L氢氧化钠溶液将负染色液的pH值调至6.4～7.0或实验所需的值。
醋酸铀：通常使用双蒸水配制成0.2％～0.5％水溶液(pH4.5)。
醋酸铀染色液应是新鲜的，最好使用前配制。
醋酸铀溶解需15～30分钟，在黑暗中能稳定几小时，使用前用1mol／L的氢氧化钠溶液将pH值调至4.5。
TEM测试染色原理
透射电子显微镜（TEM）是一种高分辨率、高放大倍数的显微镜，能够观察样品的超微结构。
在TEM测试中，为了提高图像的衬度和清晰度，常常需要对样品进行染色。
染色原理主要基于电子散射能力和透射电子的成像信号。
首先，当电子束投射到样品上时，会与样品中的原子发生碰撞，产生立体角散射。
由于不同成分对电子的透过率不同，因此透射电子的强度和方向会发生变化，形成明暗不同的影像。
为了提高特定成分的散射能力，以便在图像中更好地显现，我们会使用重金属离子对样品进行染色。
这些重金属离子会与样品中的功能基团结合，增强其对电子的散射能力，从而提高该组分在图像中的衬度。
在实际操作中，常用的染色方法有负染、正染、金属染色等。
负染是指用重金属盐对样品进行染色，使其对电子的散射能力增强，从而在图像中呈暗色。
正染则是用重金属盐对样品进行染色，使其对电子的散射能力减弱，从而在图像中呈亮色。
金属染色则是利用金属元素对样品进行染色，以达到提高衬度的目的。
通过染色，我们可以更好地观察样品的内部结构和化学成分分布，从而对样品进行更深入的分析和研究。
但需要注意的是，染色会对样品造成一定的破坏，因此在进行TEM测试时需要谨慎选择染色方案，以避免对样品的结构造成过大的影响。
总的来说，TEM测试染色原理是基于电子散射能力和透射电子的成像信号，通过染色提高图像的衬度和清晰度，以便更好地观察样品的超微结构和化学成分分布。
猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化及鉴定WANG Xi;LI Guopan;CHEN Qingqing;XU Baojuan;RONG Jun【摘要】为获得较高纯度的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2) Cap蛋白的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)并对其进行结构和功能研究,本试验以大肠杆菌表达系统表达了PCV2重组Cap (PCV2 rCap)蛋白,通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-300 HR凝胶过滤层析、Capto Q离子交换层析、CsCl密度梯度离心等方法对其进行了纯化.通过Western blotting对纯化所得蛋白进行免疫反应性鉴定,透射电镜(TEM)观察纯化蛋白的粒径及形态,高效液相尺寸排阻色谱(HPSEC)检测其组分分布.结果显示,纯化后PCV2 rCap蛋白经SDS-PAGE检测,可见28 ku的目的蛋白带,灰度扫描法检测其纯度为97.53％.Western blotting结果显示,该处的特异性蛋白条带有明显的免疫反应性;TEM检测其为粒径17.35～19.24 nm的规则球形颗粒,表明所获得的PCV2 rCap蛋白在表达时能在菌体内自我装配成VLPs,且在纯化过程中没有被破坏而解聚,仍保持天然状态;HPSEC检测纯化样品中VILPs含量为92.67％.本试验结果为进一步研究PCV2 VLPs的空间结构及其免疫保护机制提供了参考依据.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2019(046)006【总页数】9页(P1792-1800)【关键词】猪圆环病毒2型(PCV2);病毒样颗粒(VLPs);纯化;鉴定;凝胶过滤层析;离子交换层析【作者】WANG Xi;LI Guopan;CHEN Qingqing;XU Baojuan;RONG Jun【作者单位】;;;;【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪圆环病毒2型(PCV2)属于单股负链环状DNA病毒，无囊膜[1]，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原体，对不同阶段的猪均可造成感染[2]，给全球养猪业造成了极大的经济损失[3]。
负染色技术负染色又称阴性染色，是相对于普通染色(称正染色)而言的。
负染色首先由Hall在1955年提出。
Hall在病毒研究中用磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的"空洞"被清楚地显示出来。
在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。
而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。
而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)"包埋"低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像"透明"地光亮。
两者之间的反差正好相反，故称为负染色。
对于负染色的机制目前还不十分了解。
对颗粒状的生物材料的研究而言，负染色技术与超薄切片方法相比具有分辨率高(可达15Å)，简单快速等优点。
因此，在生物学研究中得到越来越广泛的应用。
它可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、大小以及表面结构的特征。
尤其在病毒学中，负染色技术成为不可取代的实验技术。
[编辑]负染色液的制备用作负染色的负染色剂应具有：较强的电子散射能力以产生足够的图像反差；熔点高，在电子束的轰击下不会升华；溶解度大，不易析出沉淀；在电镜下不呈现出可观察到的结构；分子小，容易渗入不规则表面的凹陷处；与样品不起化学反应等。
目前最常用的负染液是磷钨酸、磷钨酸钾和磷钨酸钠(分别简称为PTA、KPT、NaPT)。
此外醋酸铀、甲酸铀、硅钨酸、钼酸铵等也常作负染色剂用。
它们的配制方法如下：磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾溶液通常用双蒸水或磷酸缓冲液配制成1％～3％的溶液，使用时应用1 mol／L氢氧化钠溶液将负染色液的pH值调至6.4～7.0或实验所需的值。
醋酸铀：通常使用双蒸水配制成0.2％～0.5％水溶液(pH4.5)。
醋酸铀染色液应是新鲜的，最好使用前配制。
醋酸铀溶解需15～30分钟，在黑暗中能稳定几小时，使用前用1mol／L的氢氧化钠溶液将pH值调至4.5。
磷钨酸染色剂配制方法
磷钨酸染色剂是常用的原生质染色剂，用于显微镜下观察细胞核和细胞器。
以下是一种简单的磷钨酸染色剂配制方法：
材料：
- 磷钨酸(一水合物)：2克
- 酒精：100毫升
- 蒸馏水：100毫升
步骤：
1. 取2克磷钨酸加入50毫升蒸馏水中，搅拌溶解。
2. 加入50毫升酒精，继续搅拌混合。
3. 加入另外50毫升蒸馏水，搅拌均匀。
4. 过滤液体，储存于密封瓶中。
使用方法：
1. 取少量细胞悬液放入载玻片上。
2. 吸去多余液体，滴加适量磷钨酸染色剂。
3. 在温暖的干燥室中等待10-15分钟。
4. 游离染色剂用蒸馏水冲洗，待载玻片干燥后在显微镜下观察。
注意事项：
- 磷钨酸染色剂易挥发，使用后应及时封闭瓶口。
- 储存时可以放置在冰箱中，能够延长其使用寿命。
- 染色时间和浓度可根据需要进行调整。
- 1 -。
TEM测试流程
1.配制磷钨酸的浓度为2%，此时Ph大约为1~2
2.配制NaOH的浓度为2%
3.将两者中和得到的磷钨酸Ph大约为6~7（十毫升磷钨酸大约需要十五滴左右
的NaOH），此即为染色液
4.将PUD稀释到固含大约为0.05~0.08%之间并使稀释液混合均匀（40%固含
就稀释大约500~800倍）
5.取3~5滴配制好的磷钨酸与稀释后的PUD进行等体积混合均匀，震荡大约
一分钟后即可进行染色
6.在紫外灯光下先滴一滴混合液到铜网上，放置一段时间后其会慢慢变干
（5~10分钟），然后在铜网另外一面也滴一滴混合液并让之干燥（在这个过程中千万要防止混合液顺着缝隙吸附到镊子上面去了），染色即告完成
7.在进行电镜观察的时候先在小倍数的情况下看个整体的染色状况，寻找合适
的孔进行观察拍照。
8.先进行宏观拍照此时标准是200nm（放大倍数一般在4800~9300之间），然
后进行微观拍照此时标准是0.5µm（放大倍数一般在13000~22000之间），这个过程中不论是宏观还是微观最好在确定了放大倍数后就不要改变以进行对比，因此最好从粒径小的开始。
磷钨酸用水或磷酸缓冲液配制成1％左右的溶液，用滴管一滴染色液在制好样品的铜网上，1～2分钟后，用剪成尖角的滤纸吸去染色液。
再滴一滴纯水在铜网上，用滤纸吸去，反复两三次，这样是为了洗去多余的磷钨酸，然后静置干燥。
然后就可以用电镜观察了。
磷钨酸中的重原子相对于有机分子中的碳氢氧氮等轻原子来说，更能阻挡（散射）电子。
所以，有磷钨酸吸附（或沉积）的地方在TEM 照片中看起来更黑，而有机物占据的地方看起来更亮。
之所以叫“负染色”，就是因为被染“黑”的是背景和外轮廓，真正感兴趣的样品部分是“白”的。
也就是说，典型的经过负染色的样品是表现为黑背景中的白区。
一般有机物并不与磷钨酸发生反应，磷钨酸只是沉积在有机物周围形成“背景”或“轮廓”。
但是不是所有的磷钨酸染色都是负染色。
有一些羟基和酰胺类会与磷钨酸作用，出现正染色的效果，即有些含有这些基团的有机物在TEM下看起来被染“黑”，最典型的是尼龙。
另外，有时候不成功的负染色，看到的结果也是“白底黑点”，其实虽然是做了染色的操作，但可能由于方法不对，或者样品本身的性质不适用负染色，结果跟没染是一样的。
如果有机颗粒足够大，不染色时就能看到“白底黑点”。
另一方面，如果染色很弱，一般只是给有机颗粒镶上一个轮廓，如果染色剂量很大，则会出现很黑的“背景”。
因此，对于很小的有机颗粒，如果染色很弱，只是一个轮廓圈，电镜放大倍数不够的时候，看起来就是一个小黑点了。
就好像一个纸上画一个空心圈，站远了看也可能
成一个小黑点。
如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！。
透射电镜负染色技术常见影响因素与对策刘湘花;张彩丽;张俊霞;卢小康;李瑞琴【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2016(032)010【总页数】2页(P1185-1186)【关键词】透射电镜;负染色;影响因素;对策【作者】刘湘花;张彩丽;张俊霞;卢小康;李瑞琴【作者单位】河南中医学院病理实验中心,郑州450046;河南中医学院病理实验中心,郑州450046;河南中医学院病理实验中心,郑州450046;河南中医学院病理实验中心,郑州450046;河南中医学院病理实验中心,郑州450046【正文语种】中文【中图分类】R-331负染色技术又称阴性反差染色，简称负染。
它是由HaLL和Huxley首先采用的一种应用于生物大分子研究的染色技术。
与传统染色不同的是，样品进行负染色时，由于其与染液之间不发生反应，故样品本身并不着色。
利用样品与染色剂密度的悬殊对比，在电子致密的黑色背景中能反衬出低电子密度的白色样品，形成负反差，故称负染色[1]。
负染色技术的样品无需经固定、脱水、包埋和超薄切片等复杂操作，而是将样品制备成具有一定密度的悬浮液，然后将其分散在具有支持膜的铜网上，最后用负染色液染色来增加反差，即可进行电镜观察；该技术具有操作简单、快速方便，可较好的保存样品结构，使被染样品反差适中、分辨率高，且样品和染液需用量少等优点，因此被广泛用于细菌、病毒、大分子、亚细胞碎片、分离的细胞器及蛋白质晶体等样品[2-6]的分析，是一项十分重要的实验技术。
影响样品负染色的因素很多，如样品浓度、染液浓度和pH值、染色时间和温度、支持膜性质、染色时机、样品观察时机等因素均可以对负染色的效果产生影响。
本文主要探讨影响负染色的因素与对策，现报道如下。
负染色技术要求观察的样品必须制备成具有一定浓度的悬浮液。
有些样品悬浮液的浓度过高，且样品本身凝聚性较强，如蛋白质等，可以使用分散剂(牛血清白蛋白、杆菌肽粉末、甘油甘二醇等)防止样品凝聚。
ApplicationTEM样品前处理设备——亲水化处理仪（辉光放电仪）原理及应用辉光放电一般是指低气压放电现象,工作压力一般都低于10 mbar,其基本构造是在封闭的容器内放置两个平行的电极板,利用产生的电子将中性原子或分子激发,而被激发的粒子由激发态降回基态时会以光的形式释放出能量。
在激发状态下构成分子的原子获得足够大的的动能，开始彼此分离，原子的外层电子摆脱原子核的束缚成为自由电子，失去电子的原子变成正离子。
这一过程叫电离，形成的等离子体是一种电离气体，是离子、电子和高能原子等的集合体;正离子和电子总是成对的出现，总数大致相等，整体呈准电中性，它是一种由带电粒子组成的电离状态，称为物质的第四态-等离子态。
等离子表面处理是一种新的技术，可以实现很多功能，例如超洁净清洗、表面能改善、表面活化、刻蚀、涂覆等。
TEM样品前处理设备亲水化处理仪或者称为辉光放电仪就是利用这一技术实现对TEM碳膜进行表面改性，以获取更佳的制样效果。
但是不同厂家不同机型可实现的模式和功能并不完全一致，但总的来说有如下几类：1、表面超洁净清洁原理：就反应机理来看，等离子体清洗通常包括以下过程：无机气体被激发为等离子态；气相物质被吸附在固体表面；被吸附基团与固体表面分子反应生成产物分子；产物分子解析形成气相；反应残余物脱离表面。
在使用空气作为工作气体的情况下，氧气被激发到离子态，有很强的氧化性，可将样品表面常见的有机分子、油脂分子的污染物清洗干净。
效果：经过处理的样品表面会表现出材料本身应有的、均一的亲疏水性能。
而且通常情况下有机分子、油脂等污染物都是强疏水材料，所以超净清洁后样品表面一般会变的更为亲水。
2、短期亲水处理原理：这一过程事实上是和超净清洗同时进行的。
在用的是空气进行等离子处理时，辉光放电将氧气变成等离子态，中性的氧气的变成带电粒子（有正电荷，也有负电荷），这些高能粒子轰击物体表面，会暂时使得样品表面富集负电荷从而提高样品表面能，这就改变物体表面的性质。
磷钨酸用水或磷酸缓冲液配制成1％左右的溶液，用滴管一滴染色液在制好样品的铜网上，1～2分钟后，用剪成尖角的滤纸吸去染色液。
再滴一滴纯水在铜网上，用滤纸吸去，反复两三次，这样是为了洗去多余的磷钨酸，然后静置干燥。
然后就可以用电镜观察了。
磷钨酸中的重原子相对于有机分子中的碳氢氧氮等轻原子来说，更能阻挡（散射）电子。
所以，有磷钨酸吸附（或沉积）的地方在TEM 照片中看起来更黑，而有机物占据的地方看起来更亮。
之所以叫“负染色”，就是因为被染“黑”的是背景和外轮廓，真正感兴趣的样品部分是“白”的。
也就是说，典型的经过负染色的样品是表现为黑背景中的白区。
一般有机物并不与磷钨酸发生反应，磷钨酸只是沉积在有机物周围形成“背景”或“轮廓”。
但是不是所有的磷钨酸染色都是负染色。
有一些羟基和酰胺类会与磷钨酸作用，出现正染色的效果，即有些含有这些基团的有机物在TEM下看起来被染“黑”，最典型的是尼龙。
另外，有时候不成功的负染色，看到的结果也是“白底黑点”，其实虽然是做了染色的操作，但可能由于方法不对，或者样品本身的性质不适用负染色，结果跟没染是一样的。
如果有机颗粒足够大，不染色时就能看到“白底黑点”。
另一方面，如果染色很弱，一般只是给有机颗粒镶上一个轮廓，如果染色剂量很大，则会出现很黑的“背景”。
因此，对于很小的有机颗粒，如果染色很弱，只是一个轮廓圈，电镜放大倍数不够的时候，看起来就是一个小黑点了。
就好像一个纸上画一个空心圈，站远了看也可能
成一个小黑点。
